壯骨止痛膠囊對(duì)去卵巢致骨質(zhì)疏松大鼠腸道微生態(tài)的影響

張?zhí)旎?，?婷，雷曉明，王 舒，王豐林，劉平安*，張國民*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一種常發(fā)生于女性絕經(jīng)后5～10 年內(nèi)的骨科疾病，由于卵巢功能的下降，雌激素大幅度下降，導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡受到影響，繼而結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為骨痛、易骨折[1]。 目前，臨床中采取的藥物治療，長期服用易產(chǎn)生耐藥性和許多不良反應(yīng)，因此，亟須尋找更加安全可靠的治療方式[2]。 中醫(yī)藥優(yōu)勢在于資源豐富、藥效理想、不良反應(yīng)少，可通過調(diào)控骨代謝相關(guān)信號(hào)通路及骨骼相關(guān)細(xì)胞的增殖分化等來治療骨代謝紊亂導(dǎo)致的PMOP，進(jìn)而維護(hù)骨骼健康[3]。 越來越多的研究表明，中醫(yī)藥對(duì)骨代謝的調(diào)控作用可能與腸道菌群有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討[4]。 因此，本研究以去卵巢（ovariectomised, OVX）大鼠為研究對(duì)象，探索壯骨止痛膠囊（Zhuanggu Zhitong Capsule, ZGZTC）對(duì)OVX 所致骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, OP）大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2 月齡SPF 級(jí)SD 雌性大鼠40 只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0009]，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，選用無菌顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境溫度20～25 ℃，室內(nèi)通風(fēng)良好。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，并通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審查（倫理號(hào)：LL2022110903）。

1.2 主要試劑和儀器

ZGZTC 由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補(bǔ)（燙）、狗脊、川牛膝組成（0.45 g/粒，四川美大康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20050118，批號(hào)：220703）；戊酸雌二醇（estradiol valerate, EV）片（1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國藥準(zhǔn)字：J20171038，批號(hào)：699A）；脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17, IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）ELISA 試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號(hào)：YD-31044、YD-30201、YD-31073）；大鼠GAPDH內(nèi)參引物（生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：IB08KA7169）。

多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN 公司，型號(hào)：1811004222）；熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司，型號(hào)：LightCycler480 Ⅱ）；顯微鏡（德國Zeiss 公司，型號(hào)：Axioscope 5）。

1.3 分組及給藥

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為造模組（30 只）、假手術(shù)（SHAM）組（10 只）。 造模組采用國內(nèi)外公認(rèn)的去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立PMOP 病理模型[5-7]，即經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.03 g/kg）麻醉后，將大鼠置于俯臥位，備皮消毒，背側(cè)正中旁1～2 cm 行縱切口打開腹腔，找到卵巢，結(jié)扎摘除該側(cè)卵巢組織后，逐層縫合切口，同法處理對(duì)側(cè)卵巢，SHAM 組僅摘除卵巢周圍等質(zhì)量脂肪組織，術(shù)后注射青霉素。 1周后，將造模組隨機(jī)分為OVX 組、ZGZTC 組、EV組，每組10 只。 4 組大鼠均灌胃，ZGZTC 組灌服ZGZTC混懸液[1.944 g/（kg·d）][8]，EV 組灌服EV 混懸液[0.09 mg/（kg·d）][9]，SHAM 組、OVX 組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃12 周后處死并取材。

1.4 HE 染色

取左側(cè)股骨及一部分結(jié)腸用于HE 染色，檢測股骨、結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)變化。 取固定的結(jié)腸、脫鈣后的股骨組織標(biāo)本，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸入石蠟中包埋，包埋完全后切片，厚度約5 μm，切片脫蠟、水化，先后用蘇木素、伊紅染色，脫水透明后采用中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5 ELISA 法檢測血清IL-17、TGF-β、LPS 表達(dá)

大鼠腹主動(dòng)脈取血，將血液樣本置于4 ℃冰箱過夜，待充分凝固后，4 ℃，3 000 r/min 離心15 min（離心半徑17.8 cm），取上清液。 按照雙抗體夾心法對(duì)大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 進(jìn)行ELISA 檢測，使用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的OD 值，計(jì)算濃度。

1.6 RT-PCR 法檢測結(jié)腸Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)量

取適量結(jié)腸組織，使用超純總RNA 提取試劑盒提取RNA，核酸蛋白濃度測定儀測量RNA 濃度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后行兩步法擴(kuò)增PCR（95 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，循環(huán)45 次）。 依據(jù)原始檢測結(jié)果，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算咬合蛋白（Occludin）、閉合小環(huán)蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA 相對(duì)表達(dá)量。 引物目的基因序列搜索于美國國家生物技術(shù)信息中心，設(shè)計(jì)、合成于生工生物工程股份有限公司，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.7 16S rRNA 測序檢測大鼠腸道菌群

取新鮮大鼠糞便，提取DNA 后進(jìn)行16S rRNA高通量測序。 采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S 的V3-V4區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化和質(zhì)檢后通過Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以“±s”表示，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Dunnnett's T3檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）；若不符合正態(tài)分布，組間比較采用秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨、結(jié)腸HE 染色結(jié)果

SHAM 組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)完整、分布均勻，骨髓腔大小無異常。與SHAM 組比較，OVX 組股骨的骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁數(shù)目減少，骨小梁部分出現(xiàn)斷裂，脂肪空泡形成增多。 與OVX 組比較，ZGZTC 組、EV 組骨小梁數(shù)目增加，脂肪細(xì)胞形成的空泡減少。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠股骨微結(jié)構(gòu)情況（HE，×100）

SHAM 組結(jié)腸形態(tài)正常，杯狀細(xì)胞和隱窩細(xì)胞數(shù)量較多，腺體分布整齊，炎癥細(xì)胞浸潤及滲出程度低。OVX 組上皮細(xì)胞的形態(tài)被破壞并且炎性細(xì)胞浸潤。與OVX 組相比，EV 組杯狀細(xì)胞有所增多，炎癥細(xì)胞浸潤減少；ZGZTC 組見正常杯狀細(xì)胞和U 型隱窩，腺體排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤顯著變少。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸微結(jié)構(gòu)情況（HE，×200）

2.2 各組大鼠結(jié)腸Occludin、ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

與SHAM 組比較，OVX 組大鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.01）；與OVX 組比較，ZGZTC 組和EV 組大鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。詳見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸Occludin、ZO-1 mRNA 表達(dá)情況（n=10）

2.3 各組大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 值比較

與SHAM 組比較，OVX 組血清IL-17、LPS 值升高（P<0.01），TGF-β 值降低（P<0.01）；與OVX 組比較，ZGZTC 組和EV 組血清IL-17、LPS 值均降低（P<0.01），TGF-β 值升高（P<0.01）；ZGZTC 組和EV組IL-17、TGF-β、LPS 值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖4。

圖4 各組大鼠血清中IL-17、TGF-β、LPS 含量（n=10）

2.4 各組大鼠16S rRNA 測序結(jié)果

2.4.1 腸道菌群測序有效特征序列分析 3組大鼠共分析得到OTU 物種1 618 個(gè)，OVX 組、ZGZTC 組和EV 組各有888、803、801 條，其中，3 組共有物種數(shù)目252 個(gè)，特有的特征數(shù)分別有356、318、322 條。 詳見圖5。

圖5 特征分布韋恩圖

2.4.2 腸道菌群α 多樣性分析 各組大鼠腸道菌群的稀釋曲線最終都趨于平緩，表明各組測序獲得的特征數(shù)量合理，物種豐富度足夠，測序深度滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析（圖6）。 此外，各組大鼠腸道菌群的豐富度指數(shù)（潮1 指數(shù)與Ace 指數(shù)）、多樣性指數(shù)（辛普森指數(shù)與香濃指數(shù)）均無顯著性差異（圖7）。

圖6 α 多樣性指數(shù)稀釋曲線

圖7 α 多樣性分析指數(shù)比較

2.4.3 腸道菌群β 多樣性分析 通過主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis, PCoA）和聚類分析來分析β 多樣性的差異。 PCoA 結(jié)果顯示，各組樣品顯著分離，置換多元方差分析表明組間差異具有顯著性（P=0.006<0.01），聚類分析也顯示出類似的結(jié)果。詳見圖8。

圖8 β 多樣性分析比較

2.4.4 各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)豐度分析

（1）門水平菌群豐度及差異

由圖9-A 可知，相對(duì)豐度最高的10 個(gè)菌群分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、彎曲菌門（Campilobacterota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、螺旋菌門（Spirochaetota）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、狄氏副擬桿菌（Patescibacteria），其中，厚壁菌門和擬桿菌門為腸道的優(yōu)勢菌群，相對(duì)豐度占比80%以上。 在厚壁菌門豐度比較中，相比于OVX 組（69.53%），ZGZTC 組（67.96%）和EV 組（61.16%）的相對(duì)豐度均下降。 在擬桿菌門豐度比較中，相比于OVX 組（21.94%），ZGZTC 組（25.16%）和EV 組（30.09%）的相對(duì)豐度均增加。

圖9 門水平（A）及屬水平（B）的腸道菌群相對(duì)豐度

（2）屬水平菌群豐度及差異

由圖9-B 可知，相對(duì)豐度前10 的菌屬有毛螺菌科＿NK4A136 菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、普氏菌屬（Prevotella）、龍布茨氏菌屬（Romboutsia）、全緣球菌屬（Alloprevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、疣微菌屬（Turicibacter）、普雷沃氏菌科＿Ga6A1 菌屬（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、優(yōu)桿菌科＿ 惰性菌屬（[Eubacterium]_siraeum_group）、優(yōu)桿菌科＿ 反芻菌屬（[Eubacterium]_ruminantium_group）。 在毛螺菌科＿NK4A136 菌屬豐度比較中，相比于OVX 組（14.23%），ZGZTC 組（6.10%）豐度明顯降低，而EV 組（18.17%）相較于OVX 組豐度增加；在普氏菌屬比較中，對(duì)比于OVX 組（8.36%），ZGZTC 組（4.71%）的相對(duì)豐度明顯降低，而EV 組（8.71%）相較于ZGZTC 組的相對(duì)豐度增加；在龍布茨氏菌屬比較中，相比于OVX組（1.68%），ZGZTC 組（11.03%）的相對(duì)豐度顯著增加，而EV 組（1.55%）相較于ZGZTC 組的相對(duì)豐度下降。

3 討論

中醫(yī)古籍并無PMOP 的記載，但其臨床表現(xiàn)與“骨痿”相似[10]?！肮丘簟币愿文I陰虛證、脾腎陽虛證及腎虛血瘀證多見，故治療多從先后天之本——脾腎入手[11]。 ZGZTC 作為治療OP 的良藥之一，具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛之效。 方中君藥補(bǔ)骨脂可溫腎壯陽，臣藥淫羊藿可強(qiáng)筋壯骨，二藥共奏助生肝腎之陽之功；枸杞子、女貞子滋補(bǔ)肝腎，骨碎補(bǔ)活血通經(jīng)，狗脊補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝，四者共助補(bǔ)下焦肝腎之陰、強(qiáng)筋壯骨之功，共為佐藥；使藥牛膝則引藥下行達(dá)病所[12]。然而，基于腸道菌群探討ZGZTC 防治PMOP 的相關(guān)機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

PMOP 的發(fā)病核心是骨代謝失衡，而導(dǎo)致骨代謝失衡的原因有炎癥高表達(dá)、免疫系統(tǒng)失衡、雌激素水平降低，過程中均有腸道菌群參與。 MCCABE 等[13]發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可導(dǎo)致OP 發(fā)生，其中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-17 等炎癥因子可刺激破骨細(xì)胞形成。MA 等[14]發(fā)現(xiàn)，OVX 大鼠閉合蛋白-1（Claudin-1）和Occludin 表達(dá)降低，提示PMOP 會(huì)破壞腸道屏障功能，而腸道菌群可能通過激活免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)Claudin-1 和Occludin 蛋白表達(dá)。隨著絕經(jīng)后雌激素水平逐漸降低，甲狀旁腺素分泌逐漸增多，但腸道菌群主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的產(chǎn)生可以降低甲狀旁腺素水平，從而增加礦物質(zhì)吸收，影響激素代謝[15]。EV 可提高體內(nèi)的雌激素水平，具有抗骨質(zhì)疏松作用。 臨床上將EV 和淫羊藿總黃酮合用，淫羊藿的雄激素樣作用可抵抗雌激素的毒副作用，從而起到平補(bǔ)陰陽、益腎健骨的療效[16]。 健骨顆粒對(duì)腸道菌群環(huán)境和骨免疫調(diào)節(jié)有影響，可通過腸道菌群-短鏈脂肪酸-調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）/輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17, Th 17）軸調(diào)節(jié)骨代謝[17]。 亦有研究表明，腸道中的有益菌群可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成和功能來影響Treg/Th17 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、TGF-β 之間的平衡以維持骨骼穩(wěn)態(tài)[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了各組血清炎癥標(biāo)志物水平，結(jié)果顯示，與SHAM 組相比，OVX 組大鼠IL-17 明顯升高、TGF-β 降低，腸道黏膜存在大量炎性細(xì)胞，緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Occludin 表達(dá)均降低。 與OVX 組比較，ZGZTC 組及EV 組IL-17 明顯降低、TGF-β 升高，腸道炎癥情況明顯改善。 因此，減少炎癥因子的產(chǎn)生，增加益生菌含量可能是ZGZTC 通過腸道菌群改善PMOP 的機(jī)制之一。

腸道厚壁菌門-乳桿菌屬的減少與老年階段常見疾病之間存在密切相關(guān)性[19]。研究顯示，與骨密度正常的受試者相比，OP 患者的腸道菌群在門的水平上，厚壁菌門顯著增加，而擬桿菌門顯著減少，厚壁菌門/擬桿菌門與腰椎骨密度呈負(fù)相關(guān)；在屬的水平上，OP 患者腸道菌群中梭菌屬、糞球菌屬、乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，韋榮氏球菌屬的相對(duì)豐度顯著下降[20]。本研究通過對(duì)比腸道菌群門、屬豐度發(fā)現(xiàn)，門水平上，相比于OVX 組，ZGZTC 組與EV 組厚壁菌門豐度減少，擬桿菌門豐度上升，而此菌在幫助宿主維持腸道微生態(tài)平衡方面起到相當(dāng)重要的作用，同時(shí)可通過與雌激素之間的相互作用有效調(diào)節(jié)骨代謝[21]，說明ZGZTC 可能通過改善OVX 大鼠腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門的比例，改善由OVX所致的腸道菌群紊亂狀態(tài)。 在屬的水平上，ZGZTC能逆轉(zhuǎn)瘤胃球菌屬優(yōu)勢菌屬在OVX 大鼠腸道菌群中的豐度減少的情況，減少OVX 組致病菌屬的存在，進(jìn)一步防止LPS 分泌增加及腸黏膜屏障破壞。毛螺菌科是體內(nèi)的有害菌，與體質(zhì)量及血清總膽固醇含量呈正相關(guān)，提示其與骨-脂代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZGZTC 組毛螺菌科豐度降低，提示ZGZTC 可能通過腸道菌群及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行骨-脂代謝調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮抗PMOP 作用。

綜上所述，ZGZTC 能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、減少炎癥因子生成、改善腸道炎癥等方式調(diào)節(jié)OVX 大鼠骨的形態(tài)學(xué)變化。 本實(shí)驗(yàn)為ZGZTC 治療OVX 提供了一定的科學(xué)依據(jù)，并且證實(shí)了其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)有關(guān)，為補(bǔ)腎類方藥通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)改善疾病提供了研究基礎(chǔ)。 但本研究只采用了16S rRNA 進(jìn)行測序，存在覆蓋不足等缺陷，后續(xù)將進(jìn)行更深入的生物信息學(xué)分析，并對(duì)涉及的相關(guān)信號(hào)通路行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。