新生兒篩查確診苯丙氨酸羥化酶缺乏癥患者基因變異及長(zhǎng)期隨訪分析

孫萌，李育霖，李盼盼，李改杰，閆 妍，鄒卉

濟(jì)南市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，山東 濟(jì)南 250001

HPA 是由于PAH 缺乏或其輔酶四氫生物蝶呤缺乏導(dǎo)致血Phe濃度持續(xù)增高的一組最常見(jiàn)的氨基酸代謝病，呈常染色體隱性遺傳，如未早期治療會(huì)造成患者智力發(fā)育不可逆損害［1］。中國(guó)HPA 新生兒篩查起始于20 世紀(jì)80 年代，是我國(guó)最早進(jìn)行的新生兒疾病篩查病種之一［2］。PAH缺乏癥患者隨著年齡增長(zhǎng)，陸續(xù)進(jìn)入青少年及成人患者時(shí)期，后者治療隨訪重點(diǎn)與嬰幼兒時(shí)期有所不同。本研究通過(guò)分析268 例PAH 缺乏癥患者的基因檢測(cè)結(jié)果及本中心新生兒疾病篩查確診的198 例PAH 缺乏癥患者的長(zhǎng)期隨訪資料，旨在了解PAH基因變異類型以及學(xué)齡期前兒童及青少年P(guān)AH缺乏癥患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集1996 至2021 年濟(jì)南市新生兒疾病篩查中心篩查確診的198例PAH缺乏癥患者及濟(jì)南周邊地區(qū)轉(zhuǎn)診經(jīng)篩查確診的213例PAH缺乏癥患者的臨床資料。根據(jù)《高苯丙氨酸血癥的診治共識(shí)》［3］，411例患者中經(jīng)典型PKU 200例、輕度PKU 116例、輕度HPA 95例。本中心自2010年進(jìn)行確診患者的基因檢測(cè)，411例患者中共268例經(jīng)父母簽署知情同意書(shū)后行基因檢測(cè)。其中本中心新生兒篩查確診55 例、濟(jì)南周邊地區(qū)轉(zhuǎn)診213 例。本研究通過(guò)濟(jì)南市婦幼保健院倫理委員會(huì)審查（2022-1-006），標(biāo)本檢測(cè)經(jīng)過(guò)新生兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 儀器及試劑

串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀TQD-1525 為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；時(shí)間分辨熒光免疫分析儀VICTOR2-1420 為芬蘭Wallac 公司產(chǎn)品；二代測(cè)序平臺(tái)DNBSEQ-T7 為華大基因公司產(chǎn)品；桑格測(cè)序儀3730XL為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；DNA提取純化試劑盒為杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品；非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒及Phe測(cè)定試劑盒為美國(guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品。

1.3 定制Panel檢測(cè)基因變異

采集患者及父母的外周血送至第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，提取受檢者提供的檢測(cè)標(biāo)本中的基因組DNA。采用定制PAH、PTS、PCBD1、QDPR、SPR、GCH1等86 個(gè)遺傳代謝病相關(guān)基因的捕獲探針，通過(guò)多重探針雜交方法靶向富集目標(biāo)區(qū)域序列，經(jīng)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)發(fā)現(xiàn)一處變異的標(biāo)本再采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行拷貝數(shù)異常變異的檢測(cè)。通過(guò)桑格測(cè)序?qū)γ鞔_變異位點(diǎn)的患者的父母進(jìn)行基因驗(yàn)證確定變異來(lái)源。

1.4 198例患者的治療及隨訪方法

篩查確診后，輕度HPA 患者正常飲食，輕度PKU 及經(jīng)典型PKU 患者給予低Phe 飲食治療，根據(jù)個(gè)體差異，遵循個(gè)體化治療原則。但后者中有兩例患兒因家屬未同意而未于確診后接受治療，至出現(xiàn)臨床癥狀才接受治療，治療時(shí)間分別為7 月齡和8 月齡。隨訪過(guò)程中監(jiān)測(cè)患者血Phe 濃度，1 歲以下1 周測(cè)一次，1～12 歲2 周～1 個(gè)月測(cè)一次，12歲以上1～3個(gè)月測(cè)一次，每3～6個(gè)月測(cè)量患者身高、體重。采用0～6 歲兒童神經(jīng)心理發(fā)育量表對(duì)0～6 歲患者于1、2、3、6 歲時(shí)進(jìn)行大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)動(dòng)作、適應(yīng)能力、語(yǔ)言、社會(huì)行為五大能區(qū)的智能發(fā)育評(píng)估［4］。對(duì)6 歲以上患者記錄學(xué)習(xí)成績(jī)。對(duì)14歲以上患者完成顱腦MRI。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因變異檢測(cè)結(jié)果

完善基因檢測(cè)的268 例PAH 缺乏癥患者中，253 例檢測(cè)到兩個(gè)及以上來(lái)自父母雙方的變異位點(diǎn)；15 例僅檢測(cè)到1 個(gè)變異位點(diǎn)，均為致病變異。共檢出111 種變異，其中以c.728G＞A（16.50%）、c.158G＞A（8.35%）、c.721C＞T（5.70%）、c.1068C＞A（5.31%）、c.611A＞G（7.40%）變異多見(jiàn)。共檢出12 例患者攜帶純合致病變異，其中c.728G＞A 純合變異7 例，均為經(jīng)典型PKU。共檢出44 例患者攜帶c.158G＞A 復(fù)合雜合變異，其中以輕度HPA患者為主（37 例）。攜帶c.158G＞A 變異的經(jīng)典型PKU（5 例）和輕度PKU（2 例）患者中，攜帶3 個(gè)基因變異位點(diǎn)5 例，其中4 例同時(shí)出現(xiàn)c.842+2T＞A變異，且該變異未在上述37例輕度HPA患者中出現(xiàn)；2例分別是與c.799C＞T或c.1199G＞C組成的復(fù)合雜合變異，均為經(jīng)典型PKU。結(jié)果提示，PAH基因以c.728G＞A、c.158G＞A、c.611A＞G、c.721C＞T、c.1068C＞A 變異多見(jiàn)，其中c.158G＞A 復(fù)合雜合變異的臨床表型以輕度HPA 為主，但在經(jīng)典型PKU和輕度PKU中也均有分布。

2.2 198例患者轉(zhuǎn)歸結(jié)果

198例PAH缺乏癥確診患者中，5例PKU患者放棄治療，9例PKU患者因其他疾病死亡，26例輕度HPA 患者無(wú)須治療。共168 例患者接受隨訪，末次隨訪年齡5月齡～22歲，隨訪時(shí)間（9.43±5.83）年。168 例患者體格發(fā)育均正常，無(wú)矮小及營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生，見(jiàn)表1。結(jié)果提示，PAH 缺乏癥患者經(jīng)規(guī)范治療后體格發(fā)育良好。

表1 168例PAH缺乏癥患者的身高、體重分布情況Table 1 Height and weight distribution of 168 patients with PAH deficiency

168 例患者中6 歲及以下共67 例，其中33 例患者完善神經(jīng)心理發(fā)育量表資料，并按照末次隨訪年齡分為兩組：3歲及以下組（n=15）和3～6歲組（n=18）。33例患者中，智能發(fā)育異常2例，其初始治療年齡均超過(guò)6 月齡，且均為3～6 歲組；其余31 例智能發(fā)育均在正常水平。3～6 歲組患者血Phe 濃度顯著高于3歲及以下組［分別為（299.68±140.02）和（154.88±43.84）μmol/L，P＜0.05］，3～6歲組和3歲及以下組患者的發(fā)育商差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［分別為（92.69±15.51）和（98.39±9.45）分，P＞0.05］。對(duì)6歲以上PAH 缺乏癥患者（n=101）學(xué)習(xí)情況進(jìn)行隨訪，均于普通學(xué)校就讀，93 例中小學(xué)階段患者學(xué)習(xí)成績(jī)中等及以上，8 例已上大學(xué)。結(jié)果提示，PAH 缺乏癥患者經(jīng)過(guò)早期干預(yù)、規(guī)范治療，智能發(fā)育可達(dá)正常水平。

22 例14 歲以上患者中，完成MRI 檢測(cè)9 例，其中經(jīng)典型PKU 8 例、輕度PKU1 例，平均年齡（17.13±2.42）歲。1例經(jīng)典型PKU患者結(jié)果正常；其余8 例發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)多發(fā)異常信號(hào)，即均有T2WI 上雙側(cè)側(cè)腦室旁小斑片狀或片狀高信號(hào)灶表現(xiàn)，多見(jiàn)T2WI上半卵圓中心斑點(diǎn)狀或片狀高信號(hào)灶，還可見(jiàn)T2WI 上頂枕葉、胼胝體壓部、左側(cè)放射冠區(qū)及右側(cè)丘腦高信號(hào)灶。該例結(jié)果正?；颊叩难狿he 濃度控制在360 μmol/L 以內(nèi)。9 例患者智能發(fā)育正常，社會(huì)適應(yīng)良好，其中3 例已上大學(xué)，其余6 例學(xué)習(xí)成績(jī)中等及以上。結(jié)果提示，即使MRI 結(jié)果存在差異，早期干預(yù)的患者智能發(fā)育和社會(huì)適應(yīng)能力均良好。

3 討論

PAH 缺乏癥由PAH基因缺陷導(dǎo)致，不同種族、不同地域之間基因變異的類型、頻率分布呈現(xiàn)多樣性［5］。在東歐國(guó)家PAH基因變異類型中，c.1222C＞T 最常見(jiàn)，而歐洲南部以c.782G＞A 最常見(jiàn)，而中國(guó)人群常見(jiàn)的變異位點(diǎn)有c.721C＞T、c.728G＞A［6-7］。PAH 缺乏癥不同基因型所致臨床表型存在差異。復(fù)合雜合基因型的表型相對(duì)復(fù)雜，不同變異單體間可能相互影響，多數(shù)取決于兩個(gè)變異位點(diǎn)中較溫和的變異位點(diǎn)［8］。c.158G＞A的殘余酶活性為79%，本研究中攜帶該位點(diǎn)的復(fù)合雜合患者主要為輕度HPA，亦存在輕度甚至經(jīng)典型PKU，與Tao等［9］報(bào)道一致。有學(xué)者通過(guò)對(duì)120 種變異在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的位置、臨床表型及變異的體外酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)不同功能域的變異對(duì)臨床表型的影響不同［10］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，改變基因變異的誘導(dǎo)表達(dá)溫度，蛋白質(zhì)表達(dá)量及酶活性也會(huì)發(fā)生改變，因此相同基因型所致臨床表型可能存在差異［11］。這也解釋了本文資料中2 例攜帶相同的c.158G＞A 和1199G＞C 復(fù)合雜合基因型患者分別表現(xiàn)為經(jīng)典型PKU 及輕度HPA。作為發(fā)病率最高的氨基酸代謝病，PAH 缺乏癥的基因診斷可以構(gòu)建本地域的基因突變熱點(diǎn)，幫助臨床醫(yī)生判斷患者的預(yù)后以及治療中對(duì)Phe 的耐受力，同時(shí)為患者家庭的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和生育計(jì)劃等提供依據(jù)。

過(guò)高的血Phe濃度及其中間代謝產(chǎn)物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，使腦組織受到不可逆的損害，進(jìn)而導(dǎo)致患者智能發(fā)育異常、生長(zhǎng)遲緩等；早期診斷和積極采用低Phe 飲食可降低血Phe 濃度，避免或減少對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害，絕大部分患者預(yù)后良好［12］。嬰兒期飲食結(jié)構(gòu)單一，血Phe 濃度容易控制。隨著患者年齡的增長(zhǎng)，各種天然食物逐步增加及兒童間食物分享機(jī)會(huì)增多，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，都會(huì)提高血Phe 濃度控制難度。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，學(xué)齡期前患者血Phe 濃度控制在120～360 μmol/L 可避免腦功能損害，如能控制在120～240 μmol/L 則可更好地保證患者的智能發(fā)育水平［13-14］。《高苯丙氨酸血癥診治共識(shí)》指出，1 歲以下患者血Phe 濃度的理想范圍為120～240 μmol/L，1～12 歲則為120～360 μmol/L［3］。本研究中3 歲以下組與3～6 歲組患者血Phe 控制濃度存在差異，但兩組間智能發(fā)育無(wú)明顯差異。這說(shuō)明隨著年齡增大可適當(dāng)放寬對(duì)血Phe濃度的控制要求，血Phe 濃度控制在理想范圍內(nèi)時(shí)對(duì)智能發(fā)育水平的影響較小。研究表明，經(jīng)過(guò)篩查確診并早期治療的PAH 缺乏癥患者智能發(fā)育水平與初篩時(shí)的血Phe 濃度無(wú)相關(guān)性，而治療延遲的患者70%～80%則會(huì)出現(xiàn)中重度智力低下［15-17］。本研究中2 例智能發(fā)育異?；純撼跏贾委熌挲g均大于6月齡，考慮與其延遲治療長(zhǎng)期積聚的高Phe濃度相關(guān)。

隨著生物醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，人們關(guān)注的不僅是HPA 患者的存活率，而更加注重其生活質(zhì)量。隨訪期間，6 歲以上患者學(xué)習(xí)能力與社會(huì)適應(yīng)性均在正常范圍，這些患者均在篩查后進(jìn)行早期規(guī)范治療，并進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，Phe濃度穩(wěn)定控制在理想范圍，實(shí)現(xiàn)新生兒篩查早期干預(yù)治療從而避免患者智力損傷的預(yù)期效果。有研究報(bào)道，高水平、不穩(wěn)定的血Phe 濃度會(huì)影響患者腦白質(zhì)的完整性，應(yīng)定期監(jiān)測(cè)并控制血Phe 濃度［18］。本研究中MRI結(jié)果存在差異，患者多有腦白質(zhì)受損，1例MRI 正?；颊咻^其他8 例患者的血Phe 濃度控制更穩(wěn)定，低濃度并且平穩(wěn)的血Phe 水平可能有助于減少腦部病變范圍。9 例患者智能發(fā)育均正常，社會(huì)適應(yīng)良好，3 例已上大學(xué)，其余6 例學(xué)習(xí)成績(jī)中等及以上。MRI 異常者需要后期關(guān)注監(jiān)測(cè)是否出現(xiàn)震顫、共濟(jì)失調(diào)、頭痛、感覺(jué)障礙等表現(xiàn)。

PAH 缺乏癥患者早期開(kāi)始治療并定期隨訪將血Phe 濃度控制在理想范圍內(nèi)，智能發(fā)育可達(dá)到正常水平。新生兒疾病篩查對(duì)PAH 缺乏癥的早期診斷和治療至關(guān)重要，但必須強(qiáng)調(diào)長(zhǎng)期隨訪并接受正規(guī)治療的重要性，最大限度地提高家長(zhǎng)和患者的依從性，堅(jiān)持規(guī)范治療，避免智能發(fā)育落后。PAH 缺乏癥患兒達(dá)青少年及成人后，建議堅(jiān)持飲食治療和規(guī)律隨訪，避免神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥出現(xiàn)。

志謝研究得到山東省自然科學(xué)基金（ZR2020MH334）、濟(jì)南市科技計(jì)劃（2022-2-124）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MH 334),and Science and Technology Program of Jinan City(2022-2-124)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)