魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品的研制與應(yīng)用

滿朝坤，王建華，孫萌，滿旭光，富玉，韓建勛

1.譜尼測試集團股份有限公司（北京 100000）；2.譜尼測試集團北京檢驗認證科學(xué)研究院有限公司（北京 100000）

魚肉中含有豐富的營養(yǎng)成分，食用價值很高，深受人們喜愛。但隨著環(huán)境的污染，魚類食品中重金屬超標的問題日益嚴重。鉛作為魚肉中常見的重金屬污染物之一，具有毒性、不可降解性和生物富集性，可通過食物鏈對人類健康構(gòu)成威脅[1-2]。GB 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規(guī)定：魚類水產(chǎn)動物及其制品中鉛的限量為0.5 mg/kg。因此，準確監(jiān)控和測定魚類食品中的鉛含量，對抑制鉛中毒具有重要意義。

魚肉中鉛的常見檢測方法有石墨爐原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法、液相色譜-原子熒光光譜法、紅外光譜法等[3-4]。為保證實驗室檢測結(jié)果的準確可靠，往往需要相應(yīng)的質(zhì)控樣品作為質(zhì)量控制手段[5-9]。質(zhì)控樣品的制備方法一般有自然機體污染法和空白基質(zhì)加標法2種。羅建波等[10]采用自然機體污染法，以金槍魚、帶魚、石斑魚等為基質(zhì)，研制16種海魚中砷、汞質(zhì)量控制樣品。吳玉珂等[11]采用空白基質(zhì)加標法，以三文魚、蝦類、貝類為基質(zhì)，研制3種基體中鉛、鎘、砷、汞、鉻成分的標準物質(zhì)。2種方法得到的樣品均勻性和穩(wěn)定性良好。其中，自然機體污染法是得到含有目標檢測物的真實樣品[12]，與實際待測樣品基本一致，但制備過程較為復(fù)雜，周期較長；空白基質(zhì)加標法是將目標檢測物附著在樣品表面[13]，但其優(yōu)點在于樣品制備流程相對簡單，可任意設(shè)計、制備多種加標濃度。

試驗選取不含鉛的市售巴沙魚作為質(zhì)控樣品的基質(zhì)，采用空白基質(zhì)加標法進行魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品的研制。魚肉經(jīng)預(yù)處理、真空冷凍干燥等，制成魚肉凍干粉，根據(jù)預(yù)設(shè)濃度水平添加一定量的鉛標準溶液，經(jīng)攪拌勻漿、二次真空冷凍干燥、二次混合后，分裝于密封袋中真空保存，并對制得的樣品進行均勻性評價、穩(wěn)定性評價和特性量定值。試驗共制備2個濃度水平的魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品，可應(yīng)用于實驗室的質(zhì)量控制、實驗室人員評價等領(lǐng)域[14]。質(zhì)控樣品的制備流程具有可復(fù)制性和可推廣性，對于魚肉中重金屬質(zhì)控樣品的研制具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉（市售巴沙魚）；鉛元素溶液標準物質(zhì)（1 000 μg/mL，中國計量科學(xué)研究院）；硝酸（優(yōu)級純，北京北化開元化學(xué)品有限公司）；磷酸二氫銨（色譜純，≥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硝酸鈀（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

石墨爐原子吸收光譜儀（Savant AA，澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司）；微波消解儀（極光6，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；數(shù)顯式電熱板（ML-3.6-4A，北京科偉永興儀器有限公司）；容量瓶A級（10 mL，洛陽北方玻璃技術(shù)股份有限公司）；超純水機（Milli-Q，美國Millipore公司）；電子天平[MS-105DU，梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；冷凍干燥機（LGJ-100F，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；多功能切碎機（QJH-QS13A，浙江千家匯電氣設(shè)備有限公司）；刀式混合研磨儀[GM300，弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司]；V型混合機（V-50，無錫新洋設(shè)備科技有限公司）；真空包裝機（MJZK-360，泉州名爵機械設(shè)備有限公司）；電子天平（JY5002，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；恒溫恒濕箱（LHS-100CL，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 質(zhì)控樣品的研制

1.3.1 方案設(shè)計

考慮到我國對魚肉中鉛常用檢測標準的方法檢出限最高為0.4 mg/kg，定量限最高為1.2 mg/kg，因此設(shè)計高、低2個濃度水平的魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品，其中，低濃度水平為0.8 mg/kg（2倍檢出限），高濃度水平為2.4 mg/kg（2倍定量限）。制備流程如圖1所示。

圖1 魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品的制備流程

1.3.2 基質(zhì)選擇

隨機取樣同批次的市購巴沙魚樣品，采用GB 5009.12—2017《食品安全國家標準 食品中鉛的測定》[15]第一法（石墨爐原子吸收光譜法）測定魚肉中鉛含量，若鉛含量低于檢出限，可作為空白魚肉樣品。

1.3.3 標準溶液的配制

準確量取4.00 mL鉛元素溶液標準物質(zhì)（1 000 μg/mL），置于10 mL棕色容量瓶中，用體積分數(shù)5%的硝酸溶液定容、混勻，配制成400 μg/mL的鉛元素標準溶液，于0～8 ℃冷藏避光保存。

1.3.4 空白基質(zhì)預(yù)處理

稱取20 kg空白魚肉樣品，解凍后去除筋膜、脂肪，切成小塊，粉碎成肉糜狀，稱重后放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h。取出后稱重，并用刀式混合研磨儀進行粉碎，將粉碎過篩后的空白魚肉粉用V型混合機混合60 min后備用。同時，依據(jù)魚肉凍干前后的失重情況，得到魚肉凍干粉的復(fù)原比例1︰8。

1.3.5 質(zhì)控樣品的制備

分別量取16 L水于2個不銹鋼桶中，依次加入2.00和6.00 mL的鉛元素標準溶液，攪拌均勻配制成一定濃度的鉛元素水溶液（分別含鉛元素0.8和2.4 mg）。稱取2份1 kg的空白魚肉粉，分批次加入到上述鉛元素水溶液中，并用置頂式電動攪拌器攪拌3 h，轉(zhuǎn)速1 000 r/min?；靹蚝髮悠菲戒佋诶鋬霰P中，并標記為低濃度樣品和高濃度樣品，放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h。取出凍干后的樣品，分別稱重后粉碎、過篩，用V型混合機再次混合60 min。經(jīng)均勻性檢驗合格后，進行分裝，采用鋁箔袋真空密封包裝，每袋樣品約5 g。

1.3.6 質(zhì)控樣品的均勻性檢驗

隨機抽取低濃度和高濃度樣品各10份，采用GB 5009.12—2017《食品安全國家標準 食品中鉛的測定》第一法進行魚肉凍干粉中鉛的檢測，每份樣品重復(fù)測定2次。依據(jù)CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[16]，采用單因子方差統(tǒng)計分析法進行樣品均勻性評價。

1.3.7 質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性檢驗分為短期穩(wěn)定性檢驗和長期儲存穩(wěn)定性檢驗。依據(jù)CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》5.2.2中的方法，采用t檢驗法進行樣品穩(wěn)定性評價。每個時間點和溫度下隨機抽取6份樣品。

短期穩(wěn)定性：將樣品分別置于-18 ℃和25 ℃條件下儲存7 d。

長期穩(wěn)定性：將樣品置于-18 ℃條件下分別儲存14，21，45和120 d。

1.3.8 質(zhì)控樣品的定值

依據(jù)GB/T 28043—2019《利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法》[17]和CNAS-GL002：2018《能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》[18]，通過組織能力驗證方式，以能力驗證結(jié)果的指定值作為質(zhì)控樣品的特性值，以能力驗證結(jié)果的2倍標準差作為質(zhì)控樣品的控制限[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果與分析

采用單因子方差統(tǒng)計分析法，通過采用F檢驗對魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品進行均勻性檢驗分析。若F＜自由度為（f1，f2）及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值Fα（f1，f2），則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

樣品均勻性檢驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表1和表2。通過統(tǒng)計分析，在顯著性水平α為0.05時，F(xiàn)低濃度樣品=1.04，F(xiàn)高濃度樣品=1.01，均小于臨界值F0.05(9,10)=3.02，表明制備的樣品之間不存在顯著性差異，2個濃度水平的質(zhì)控樣品均勻性良好。

表1 魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果

表2 魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品均勻性方差分析結(jié)果

2.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性檢驗結(jié)果與分析

采用t檢驗法判定魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性，將穩(wěn)定性檢測結(jié)果與初始均勻性檢測結(jié)果的平均值進行一致性比較[20]，若t檢驗計算值小于查表臨界值，即表明制備的質(zhì)控樣品是穩(wěn)定的。

短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在顯著性水平α為0.05時，該條件下2個濃度水平的t值均小于t臨界值，表明樣品中鉛含量在-18 ℃和25 ℃條件下儲存7 d內(nèi)無明顯變化。

表3 魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在顯著性水平α為0.05時，2個濃度的凍干粉質(zhì)控樣品中鉛含量隨時間的變化無顯著性差異，表明樣品在-18 ℃條件下儲存120 d內(nèi)的穩(wěn)定性較好。其原因可能是凍干粉質(zhì)控樣品基本不含水分，且在真空狀態(tài)和-18 ℃的低溫條件下，可以很大程度抑制魚肉基質(zhì)中微生物的生長[21]，同時降低酶活性和各種生化反應(yīng)速率[22]，從而使其保持良好的穩(wěn)定性，不易變質(zhì)。

表4 魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.3 質(zhì)控樣品定值結(jié)果與分析

2.3.1 能力驗證結(jié)果統(tǒng)計分析

對參加能力驗證活動的15家參加者的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計量匯總表見表5。可以看出，參加者的檢測結(jié)果滿意率較好，最終得到：低濃度樣品中鉛的指定值為0.768 mg/kg，能力評定標準差為0.035 mg/kg；高濃度樣品中鉛的指定值為2.500 mg/kg，能力評定標準差為0.231 mg/kg。

表5 能力驗證的結(jié)果統(tǒng)計分析表

2.3.2 質(zhì)控樣品定值

采用能力驗證結(jié)果的指定值作為質(zhì)控樣品的特性值，以2倍能力評定標準差建立質(zhì)控樣品的控制限。低濃度質(zhì)控樣品的最終定值結(jié)果為0.768±0.070 mg/kg，控制上限為0.838 mg/kg，控制下限為0.698 mg/kg；高濃度質(zhì)控樣品的最終定值結(jié)果為2.500±0.462 mg/kg，控制上限為2.962 mg/kg，控制下限為2.038 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

試驗考慮到巴沙魚價格低廉、原料易獲取、處理方便及脂肪含量低等因素，因此選取不含鉛的市售巴沙魚作為質(zhì)控樣品的基質(zhì)?？瞻谆|(zhì)加標法是制備質(zhì)控樣品的常用手段，包括凍干前加標和凍干后加標2種[12]。凍干前加標是將空白基質(zhì)與目標物首先進行攪拌混勻，通過真空冷凍干燥、粉碎、混合等步驟得到樣品；凍干后加標是將空白基質(zhì)通過真空冷凍干燥的方式磨成粉末，進行加標、混勻等系列操作得到樣品。為保證基質(zhì)樣品與目標物能夠充分混勻，試驗將兩者結(jié)合，采用二次凍干方式，將魚肉樣品經(jīng)過第一次冷凍干燥磨成粉后，將魚肉凍干粉加入含有一定濃度鉛元素的水溶液中，增加基質(zhì)與目標物的接觸面積，充分攪拌后通過真空冷凍干燥、粉碎、混合等步驟，保證樣品的均勻性。

綜上所述，試驗建立一種魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品的制備方法，采用二次真空冷凍干燥、多次混合的方式，以空白巴沙魚為基質(zhì)，添加不同含量的鉛標準溶液，制備均勻性和穩(wěn)定性良好的高、低2個濃度水平的魚肉凍干粉中鉛質(zhì)控樣品，并通過組織能力驗證的方式，以能力驗證結(jié)果的指定值作為質(zhì)控樣品的特性值，以2倍能力評定標準差作為質(zhì)控樣品的控制限，結(jié)果符合預(yù)期目標。相較于自然基體污染法，該制備方法流程簡單，具有可復(fù)制性和可推廣性，制備的質(zhì)控樣品可用于食品安全快速檢測、人員考核等領(lǐng)域的質(zhì)量控制和實驗室的能力驗證，可為相關(guān)基質(zhì)和重金屬類質(zhì)控樣品的研制提供參考依據(jù)。