亞臨界丁烷萃取副產(chǎn)物檳榔芯中檳榔堿的工藝優(yōu)化

孫建，康宗華 ，劉群，江露，李明丹

1.湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司（益陽(yáng) 413000）；2.新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410300）

檳榔屬于棕櫚科檳榔屬多年生常綠喬木，在中國(guó)海南、臺(tái)灣等地都有分布。海南全省檳榔種植面積7.92萬(wàn) hm2，年產(chǎn)值20多億元[1]。2022年全省檳榔總產(chǎn)量29.48萬(wàn) t，比上年增加6.7%[2]。

全世界約有6億人在食用檳榔嚼塊，我國(guó)主要以嚼食果殼加工產(chǎn)品為主[3]。每年約有10萬(wàn) t果芯被廢棄，果芯資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用變得迫在眉睫。

以檳榔堿為主的生物堿類是檳榔中特征功效成分，其具有驅(qū)蟲[4-5]、輔助改善記憶[6]、抗炎及提升免疫[7]、抑制骨質(zhì)疏松[8]、促進(jìn)胃腸活力[9-10]、抵抗焦慮[11]、提神醒腦[12]等功效。康麗如等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化亞臨界水提取果芯中檳榔堿的工藝，提取率可達(dá)4.25 mg/g。羅士數(shù)[14]分別采用乙醇回流法、超聲波提取法及超臨界CO2萃取法提取檳榔鮮果中檳榔堿，證實(shí)3種工藝所得檳榔堿有很好抑菌作用。此外，還有微波預(yù)處理結(jié)合超臨界CO2流體萃取工藝研究報(bào)告[15]。

低溫亞臨界萃取技術(shù)是一種新型萃取分離技術(shù)，被廣泛用于油脂制取及脫脂產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域[16-19]。亞臨界狀態(tài)的丁烷擴(kuò)散性強(qiáng)、傳質(zhì)速度快、溶解能力高，常被用于油料中油脂的快速萃取和組分分離[20]。

以亞臨界丁烷萃取技術(shù)對(duì)副產(chǎn)物檳榔芯中的檳榔堿進(jìn)行萃取，結(jié)合單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)參數(shù)，以期為工業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用及檳榔資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試藥

檳榔芯（湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司）；正丁烷溶劑（純度≥99.6%，長(zhǎng)沙柘長(zhǎng)氣體有限公司）；對(duì)照品檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純；磷酸、氨水（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

WT30002KE電子秤（常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司）；運(yùn)邦YB-1000A型多功能粉碎機(jī)（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；DZF-6020型臺(tái)式真空干燥箱（中新醫(yī)療儀器有限供公司）；不銹鋼篩網(wǎng)（0.850 mm，約20目，紹興市上虞華豐五金儀器有限公司）；DWCQ-20L亞臨界低溫萃取設(shè)備（安陽(yáng)市晶華油脂工程有限公司）；島津Nexera XR高效液相色譜系統(tǒng)（日本SHIMADZU公司）；ME2002E/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檳榔堿萃取工藝

將檳榔芯副產(chǎn)物依次進(jìn)行干燥、破碎、過(guò)篩處理，稱取適量并記錄質(zhì)量（g），用適量堿液處理，裝入0.074 mm（200目）尼龍濾袋內(nèi)，包扎嚴(yán)實(shí)。打開(kāi)萃取設(shè)備的罐口，放入萃取罐中，同時(shí)上好螺絲把罐封閉好；開(kāi)真空泵排氣，把萃取罐內(nèi)的壓力抽至-0.08 MPa后，開(kāi)溶劑罐罐底溶劑閥向萃取罐注入適量丁烷溶劑。打開(kāi)夾套熱水閥門進(jìn)行升溫，至萃取罐內(nèi)的溫度達(dá)到試驗(yàn)溫度后開(kāi)始計(jì)時(shí)，浸泡萃取。待萃取結(jié)束后，打開(kāi)萃取罐底部閥門，把混合油放入蒸發(fā)罐內(nèi)。開(kāi)啟蒸油閥、冷凝器閥門，依次開(kāi)啟壓縮機(jī)和真空泵，進(jìn)入脫溶工序。待溶劑回收完全，緩慢打開(kāi)蒸發(fā)罐排空閥，破真空至常壓后，開(kāi)放油閥放萃取物料，記錄萃取物質(zhì)量（g）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方案

按1.3.1的方法進(jìn)行提取，考察萃取次數(shù)（1，2，3，4和5次）、萃取時(shí)間（10，20，30，40，50和60 min）、萃取溫度（35，40，45，50和55 ℃）和液料比（4︰1，6︰1，8︰1，10︰1和12︰1 mL/g）4個(gè)因素在不同水平下對(duì)檳榔芯中檳榔堿萃取率影響，每組重復(fù)3次。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取萃取時(shí)間（A）、液料比（B）和萃取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，檳榔堿萃取率（mg/g）為響應(yīng)值。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)周期，按萃取1次進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3個(gè)自變量因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 檳榔堿含量測(cè)定

1.3.41 供試液制備

精密稱取20 mg各批次萃取物，用甲醇-0.5%磷酸水溶液1︰1（V/V）的混合溶液進(jìn)行溶解并定容至25 mL容量瓶中，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后供高效液相色譜儀測(cè)定，結(jié)合對(duì)照品譜圖計(jì)算樣品中4種檳榔生物堿含量（mg/g）。

1.3.42 色譜條件

參考藥典中方法，色譜柱為Ultimate?XB-SCX強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 3.8）55︰45（V/V）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 檳榔堿萃取率（mg/g）的計(jì)算（式1）

式中：W為檳榔堿萃取率，mg/g；m0為萃取得到萃取物質(zhì)量，g；c為萃取物經(jīng)HPLC檢測(cè)后得到檳榔堿含量，mg/g；m為試驗(yàn)時(shí)所稱檳榔芯粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取次數(shù)對(duì)萃取效果的影響

在液料比8︰1（mL/g）、單次萃取時(shí)間30 min、萃取溫度45 ℃條件下，分別考察萃取1，2，3，4和5次對(duì)物料中檳榔堿萃取效果影響。

由圖1可以看出，在1～4次萃取操作下，萃取率不斷增大。但萃取4次和萃取5次，萃取率差別不大，表明物料中檳榔堿已得到充分萃取，繼續(xù)增加萃取次數(shù)已無(wú)實(shí)際意義。因此，選擇4次萃取即可滿足工藝要求。

圖1 萃取次數(shù)對(duì)檳榔堿萃取率影響

2.1.2 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

在液料比8︰1（mL/g）、萃取次數(shù)1次、萃取溫度45 ℃條件下，考察萃取時(shí)間（10，20，30，40，50和60 min）對(duì)檳榔堿萃取效果影響。

由圖2可以看出，萃取時(shí)間在10～30 min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，檳榔堿萃取率快速升高。浸提30～60 min，萃取率幾乎保持不變，整體趨勢(shì)與花椒精油亞臨界萃取工藝的報(bào)道[21]相似?？紤]工藝整體效率，單次萃取時(shí)間選擇30 min較合適。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)檳榔堿萃取率影響

2.1.3 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

在萃取時(shí)間30 min、萃取次數(shù)1次、液料比8︰1（mL/g）條件下，考察不同萃取溫度對(duì)檳榔堿萃取效果影響。

如圖3所示，萃取體系溫度在35～45 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，檳榔堿萃取率不斷增大。繼續(xù)調(diào)高體系溫度（45～55 ℃），萃取率有所減小。這可能是萃取體系適當(dāng)加溫有助于溶劑分子和檳榔堿分子的熱運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)分子間相互碰撞，導(dǎo)致檳榔堿易于溶解至溶劑中，表現(xiàn)為萃取率增大[22]。但萃取體系過(guò)高的加溫則使液態(tài)丁烷溶劑液體密度降低，不利于目標(biāo)成分的萃出[23]，或者因?yàn)闇囟鹊纳?，?dǎo)致物料內(nèi)其他脂溶性成分浸出，進(jìn)而影響檳榔堿成分的萃取[24]。

圖3 萃取溫度對(duì)檳榔堿萃取率影響

圖4 液料比對(duì)檳榔堿萃取率影響

2.1.4 液料比對(duì)萃取效果的影響

在萃取時(shí)間30 min、萃取次數(shù)1次、萃取溫度45℃條件下，考察不同液料比對(duì)檳榔堿萃取效果影響。

液料比4︰1～8︰1（mL/g）范圍內(nèi)，檳榔堿萃取率隨著液料比的增加快速升高。液料比在8︰1～12︰1（mL/g）范圍內(nèi)，萃取率保持穩(wěn)定且有所降低。這可能是液料比的增加使物料中檳榔堿分子與溶劑分子碰撞概率增大，促進(jìn)檳榔堿向溶劑中轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為萃取率升高[25]。但繼續(xù)增加液料比，物料中其他脂溶性成分競(jìng)爭(zhēng)性溶出，進(jìn)而影響目標(biāo)成分的浸出?？紤]到后續(xù)脫溶工序效率及能耗，液料比選擇8︰1（mL/g）較為合適。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)因素水平表和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，得到試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)擬合分析，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型，得到回歸方程Y=1.52+0.15A+0.11B+0.14C+0.022AB+0.053AC-0.067BC+0.016A2-0.13B2-0.23C2。

2.2.2 模型方差分析

對(duì)所得多元二次回歸響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析，驗(yàn)證回歸模型和各因素顯著性。方差分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，回歸模型的差異極顯著（對(duì)應(yīng)P值為0.000 1＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（對(duì)應(yīng)P值為0.358 8＞0.05），說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，擬合的回歸方程適應(yīng)性較好。變異系數(shù)C.V.=4.08%＜10%，表明試驗(yàn)的可信度和精確度高。模型多元回歸系數(shù)R2=0.922 7，且Radj2（0.937 6）和Rpred2（0.753 6）較接近，兩者差值小于0.2，表明回歸模型相關(guān)性好，能夠充分分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)檳榔堿萃取率影響。

由方差分析表可知：一次項(xiàng)萃取時(shí)間（A）、液料比（B）和萃取溫度（C）對(duì)檳榔堿萃取率的影響均極顯著；二次項(xiàng)B2、C2影響極顯著，但A2影響不顯著；交互項(xiàng)中僅BC對(duì)萃取率影響顯著，其余兩組影響不顯著。

2.2.3 各因素交互作用分析

運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6中的Model Graphs模塊繪制響應(yīng)面等高線圖，分析萃取時(shí)間、液料比和萃取溫度對(duì)檳榔堿萃取率影響。固定其中1個(gè)因素時(shí)，可用等高線圖評(píng)估其他2個(gè)因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線越接近橢圓形，則兩因素間的交互作用越強(qiáng)，若等高線越接近圓形，則兩因素間交互作用幾乎可忽略[26-27]。

從圖5可以看出，3組等高線圖彎曲程度排序?yàn)锽C＞AC＞AB，表明萃取溫度（C）和液料比（B）兩因素間交互作用最強(qiáng)，萃取溫度和萃取時(shí)間（A）兩因素間交互作用次之，萃取時(shí)間和液料比兩因素間交互作用最弱，這也與方差分析中回歸模型相應(yīng)的系數(shù)大小及顯著性趨勢(shì)相一致。液料比和萃取溫度間交互作用等高線圖相較另外2組更接近橢圓，回歸模型方差分析顯示其P值為0.044 5＜0.05，表明差異顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)檳榔堿萃取率影響的響應(yīng)曲面等高線圖

2.2.4 理想優(yōu)化參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得回歸方程進(jìn)行求解，得到理想條件參數(shù)：萃取時(shí)間40 min、液料比8.8︰1（mL/g）、萃取溫度46.83 ℃。在此條件下，預(yù)測(cè)檳榔堿萃取率有1.74 mg/g。為便于試驗(yàn)操作，調(diào)整部分參數(shù)，即萃取時(shí)間40 min、液料比9︰1（mL/g）、萃取溫度47 ℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，檳榔堿萃取率為1.77 mg/g，與預(yù)測(cè)值相近，表明該條件參數(shù)可靠，具有使用價(jià)值。采用優(yōu)化參數(shù)對(duì)副產(chǎn)物檳榔芯共提取4次，油狀萃取物收率有1.2%，總檳榔堿萃取率可達(dá)4.46 mg/g。

2.3 萃取物中檳榔堿HPLC檢測(cè)譜圖分析

如圖6所示，對(duì)照品譜圖中檳榔次堿（9.778 min）、去甲基檳榔次堿（12.404 min）、檳榔堿（14.813 min）和去甲基檳榔堿（17.415 min）依次出峰。樣品（萃取物）譜圖中只有1個(gè)主峰，出峰時(shí)間為14.816 min，與對(duì)照品譜圖中的檳榔堿出峰時(shí)間（14.813 min）一致，表明萃取物中有檳榔堿成分，且萃取物中生物堿主要是檳榔堿。

圖6 4種生物堿對(duì)照品和萃取物HPLC譜圖

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和BBD法響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定亞臨界丁烷萃取副產(chǎn)物檳榔芯中檳榔堿的最佳工藝條件，即萃取時(shí)間40 min，液料比9︰1（mL/g），萃取溫度47 ℃。在此條件下進(jìn)行單次萃取，檳榔堿萃取率為1.77 mg/g，共提取4次，油狀萃取物收率有1.2%，總檳榔堿萃取率可達(dá)4.46 mg/g。且萃取物經(jīng)HPLC檢測(cè)，與4種檳榔主要生物堿對(duì)照品比對(duì)，僅觀察到檳榔堿出峰，表明萃取物中生物堿類成分主要是檳榔堿。

亞臨界丁烷萃取工藝具低溫特點(diǎn)，這較大程度地避免副產(chǎn)物檳榔芯中生物堿類的氧化、分解，具有顯著進(jìn)步，且該優(yōu)化參數(shù)穩(wěn)定可靠，可為開(kāi)發(fā)檳榔資源提供參考。