單氰胺打破葡萄冬芽休眠的生理響應(yīng)*

劉 朝，李小琴，陳 姣，王 凱，張永福

(昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院，云南 昆明 650214)

我國作為葡萄屬(VitisL.)植物的起源地之一，境內(nèi)葡萄屬植物種類占全世界的60%左右，是世界上葡萄屬植物種類最豐富的國家之一[1].葡萄(VitisviniferaL.)作為世界五大果樹之一，更是我國重要的經(jīng)濟果樹植物.自2012年，中國葡萄總產(chǎn)量就位居世界首位，在2018年約占全世界葡萄總產(chǎn)量的15.04%[2].目前，除澳門外，葡萄在我國各地均有種植，其中最具代表的是新疆、河北、山東、陜西、云南等地[2].葡萄作為一種冬季落葉果樹，冬季休眠是其生長過程中的自然現(xiàn)象，在休眠期間低溫積累量是影響葡萄冬芽萌發(fā)，從休眠狀態(tài)進行到生長階段的重要因素.隨著葡萄栽培面積的擴大，南方地區(qū)已成為重要產(chǎn)區(qū)，但由于南方地區(qū)葡萄易在冬季低溫積累量不足，使其冬芽不能完成自然休眠，從而導致休眠期延長、萌芽不整齊也不完全、葡萄營養(yǎng)生長過盛、葡萄晚熟、產(chǎn)量下降等問題[3，4].利用化學試劑處理的方法打破葡萄冬芽休眠，提早萌芽，并保持萌芽一致性，進而提高葡萄的產(chǎn)量及品質(zhì)，已經(jīng)成為各地葡萄栽培過程中的重要環(huán)節(jié).

目前，硝酸銨(NH4NO3)、二氯乙醇(C2H5ClO)、單氰胺(H2CN2)、石灰氮(CaCN2)等破眠劑被廣泛應(yīng)用于葡萄冬芽破除休眠，其中以單氰胺效果最好且無殘留[5-8]，并且單氰胺處理葡萄冬芽后對果實的還原性糖、可滴定酸、可溶性固形物及維生素C含量[8-11]影響不顯著.單氰胺可引起植物的過氧化物酶(POD)活性上升，進而可一定程度上提高POD和氧自由基等引起的氧化過程，使植物呼吸作用向戊糖磷酸途徑轉(zhuǎn)化，提高組織新陳代新的活力，打破植物休眠[8].并且，在葡萄冬芽打破休眠的過程中，淀粉、可溶性糖和蛋白等含量、POD和超氧化物歧化酶(SOD)活性均會發(fā)生增加或降低的變化[3]，從而打破葡萄冬芽休眠，提前冬芽萌芽，提高萌芽率，并最終使葡萄果實提前1～3周成熟[12]，提高經(jīng)濟效益[5].

‘水晶’葡萄(Vitisvinifera×V.labrusca‘Shuijing’)為歐美雜交種，目前在云南、山東、貴州等地被廣泛種植[13，14]，但目前并未見關(guān)于單氰胺打破‘水晶’葡萄冬芽休眠的生理機制相關(guān)研究報道.因此本試驗以‘水晶’葡萄為材料，探討單氰胺打破葡萄冬芽休眠的生理響應(yīng)，旨在為葡萄產(chǎn)業(yè)化栽培過程中打破葡萄冬芽休眠技術(shù)提供理論和技術(shù)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的‘水晶’葡萄枝條采集于云南省紅河州彌勒市東風韻葡萄種植基地，為2021年12月中旬冬剪時，收集修剪下來的一年生木質(zhì)化枝條，單氰胺(純度為95%)購自安徽優(yōu)雅化工有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

挑選生長狀況一致的葡萄枝條，頂端剪成平口，而下端剪成斜口，每個枝條留3個冬芽.將剪好的葡萄枝條分為10組，每組10枝(共約30個冬芽)，其中5組用質(zhì)量分數(shù)2.5%單氰胺溶液均勻涂抹芽和枝條，另外5組涂抹蒸餾水作為對照，然后將枝條扦插到蒸餾水中，放入恒溫箱在 25 ℃ 環(huán)境下光照 16 h，22 ℃ 環(huán)境下黑暗 8 h 進行培養(yǎng).扦插后每隔 7 d 取樣一次，共取6次(第0，7，14，21，28，35 d)，進行生理生化指標的測定，同時統(tǒng)計葡萄枝條的發(fā)芽率和平均芽長度.

1.2.2 指標測定

取葡萄枝條冬芽采用氮藍四唑光氧化法、愈創(chuàng)木酚-過氧化氫顯色法分別進行SOD[15]和POD活性[16]的測定；采用考馬斯亮藍G-250染色、茚三酮顯色法、蒽酮比色法和苯酚-硫酸法分別進行蛋白質(zhì)含量[17]、游離氨基酸[18]、可溶性糖[19]和淀粉[20]含量的測定；采用納氏定氮法、鉬藍顯色法和四苯硼鈉法分別進行氮、磷、鉀[21]含量的測定.

總碳含量和碳氮比計算方法如下：

總碳含量=可溶性糖含量×0.42+淀粉含量×0.44;碳氮比(C·N-1)=碳含量/氮含量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007與SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄枝條發(fā)芽情況觀察和統(tǒng)計

據(jù)觀察在第 0 d 全部葡萄枝條冬芽均處于休眠狀態(tài)，無萌芽；第 35 d，單氰胺溶液處理(以下簡稱：試驗組)的葡萄枝條與對照組相比，冬芽發(fā)芽情況和芽長勢更好，且差異顯著(圖1).試驗組葡萄的冬芽在第 7 d 開始萌芽，而對照組在第 21 d 才開始萌芽，明顯晚于試驗組 14 d.試驗組葡萄第 35 d 的萌芽率達到93.6%，為對照組(萌芽率：43.6%)的2.1倍(圖2).此外，試驗組葡萄第 35 d 的冬芽平均芽長度為 6.8 cm，為對照組(冬芽平均芽長度：3.5 cm)的1.9倍(圖3).上述結(jié)果說明單氰胺確實可以促進葡萄冬芽萌芽、提高萌芽率并促進冬芽生長.

蒸餾水 單氰胺 蒸餾水 單氰胺 (a)第0 d (b)第35 d圖1 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理后葡萄的發(fā)芽情況對比

圖2 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄的發(fā)芽率對比注：同一處理，不同時段數(shù)據(jù)上不同小寫字母表示差異 顯著(P<0.05)；不同處理，同一時段數(shù)據(jù)上不同 大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

圖3 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡萄的 冬芽平均芽長度對比

2.2 單氰胺處理對葡萄冬芽SOD和POD活性影響

對照組和試驗組葡萄冬芽的SOD活性均隨時間呈上升趨勢且變化顯著.與第 0 d 相比，第 35 d 試驗組‘水晶’葡萄冬芽SOD活性增強了51.96%，而對照組SOD活性增強了33.42%.而在整個時間段，試驗組的‘水晶’葡萄冬芽SOD活性始終高于對照組，第 35 d 試驗組葡萄冬芽SOD活性比對照組高出13.70%(圖4).兩組葡萄的POD活性也均隨時間總體呈上升趨勢且變化顯著，與第 0 d 相比，在第 35 d 試驗組葡萄冬芽的POD活性增強了 1 904.76%，而對照組葡萄的POD活性增強了733.33%.同樣的，在整個時間段中，試驗組葡萄冬芽的POD活性始終高于對照組，第 35 d 試驗組葡萄冬芽的POD活性比對照組高出140.57%(圖5).上述結(jié)果說明單氰胺溶液處理可以提高葡萄冬芽機體內(nèi)的SOD和POD活性，增加葡萄冬芽的抗氧化能力，有利于冬芽的生長萌發(fā).

圖4 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡 萄冬芽的SOD活性對比

圖5 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡 萄冬芽的POD活性對比

2.3 單氰胺處理后葡萄冬芽氮、磷、鉀含量變化

試驗組葡萄冬芽的氮含量先下降后上升，且差異顯著.在第 21 d，其氮含量達到最低值，隨后不斷上升.而對照組的氮含量則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢.在第21，28，35 d，試驗組葡萄冬芽的氮含量較對照組分別增加了17.47%，85.52%和212.41%，說明單氰胺溶液處理可促使葡萄枝條中氮向冬芽轉(zhuǎn)移，促進冬芽萌發(fā)生長(圖6).試驗組葡萄冬芽的磷含量隨時間均呈下降趨勢.在整個時間段中，試驗組葡萄冬芽的磷含量均明顯高于對照組，且差異顯著.在第7，14，21，28，35 d，其較對照組分別高了37.70%，26.37%，29.43%，24.95%和21.58%，說明單氰胺處理可減緩葡萄冬芽中磷含量的降低(圖7).試驗組和對照組葡萄冬芽的鉀含量隨時間的變化也均呈下降趨勢.在整個時間段中，試驗組葡萄冬芽的鉀含量均明顯高于對照組，且差異顯著，在第 35 d，其高于對照組41.11%(圖8).綜上所述，單氰胺溶液處理‘水晶’葡萄冬芽的氮、磷、鉀含量均高于對照組，說明單氰胺溶液處理可以提高葡萄冬芽中氮、磷、鉀含量，有利于葡萄冬芽的生長.

圖6 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的氮含量對比

圖7 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的磷含量對比

圖8 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡萄 冬芽的鉀含量對比

2.4 單氰胺處理對葡萄冬芽淀粉、可溶性糖、總碳含量和碳氮比的影響

試驗組和對照組中葡萄冬芽的淀粉含量均隨時間呈下降趨勢，在第14，21，28，35 d 分別降低了6.80%，23.75%，46.39%和19.93%(圖9)；兩組中葡萄冬芽的可溶性糖含量均隨時間上下波動，在第7，14，21，35 d，試驗組葡萄冬芽的可溶性糖含量分別較對照組高11.07%，32.16%，14.20%和97.64%(圖10)；試驗組葡萄冬芽的總碳含量在第21，28 d 較對照組分別低了14.20%和41.07%，在第7，35 d 較對照組分別高了20.89%、16.34%，而在第 14 d 與對照差異不顯著(圖11)；試驗組葡萄冬芽的碳氮比則先上升后下降，在第7，14，21，28，35 d 較對照分別降低了34.55%，12.57%，27.83%，65.58%和61.45%，且差異顯著(圖12).綜上所述，單氰胺溶液處理和對照組的葡萄冬芽淀粉和總碳含量均逐漸下降；可溶性糖含量和碳氮比均呈現(xiàn)上下波動趨勢.在整個時間段中，單氰胺處理的葡萄冬芽中可溶性糖含量總體高于對照組，而淀粉含量和碳氮比均低于對照組.上述結(jié)果說明，單氰胺能促進葡萄冬芽淀粉水解，增加可溶性糖含量并提高其氮含量，降低碳含量，為葡萄冬芽的生長提供能量.

圖10 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的可溶性糖含量對比

圖11 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的總碳含量對比

圖12 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的碳氮比對比

2.5 單氰胺處理對葡萄冬芽蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的影響

試驗組和對照組葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量隨時間總體呈上升趨勢，且在整個時間段中，試驗組葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量均明顯高于對照組，且差異顯著.在第7，14，21，28，35 d，試驗組較對照組分別高了41.91%，40.51%，40.28%，90.23%和98.68%(圖13).而兩組葡萄冬芽中游離氨基酸含量隨時間均呈上下波動的趨勢，且在整個時間段中，試驗組葡萄冬芽的游離氨基酸含量總體比對照組高，在第14，21，28，35 d，分別高了161.92%，154.80%，47.52%和93.89%(圖14).綜上而言，單氰胺可促進葡萄冬芽蛋白質(zhì)的合成，增加游離氨基酸含量，促進冬芽生長.

圖13 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量對比

圖14 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的游離氨基酸含量對比

3 討論

單氰胺作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，可以促進果樹萌芽、冬芽生長，目前已在藍莓、桃、葡萄等多種果樹上成功應(yīng)用[22].李鵬飛等[23]利用單氰胺處理‘霞多麗’葡萄枝條，結(jié)果顯示單氰胺可打破葡萄休眠，提高葡萄發(fā)芽率和萌芽整齊度，與本實驗結(jié)果較為一致.黃曉婧等[3]利用單氰胺處理‘夏黑’葡萄枝條，發(fā)現(xiàn)‘夏黑’葡萄的POD和SOD均顯著上升，并且處理組均明顯高于對照組，也與本試驗結(jié)果較為一致.張昂等[24]利用單氰胺對‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄進行處理，但其SOD活性變化為先下降后上升，與本試驗結(jié)果不一致.這主要是因為葡萄萌芽時間存在差異.而當‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄萌芽后，其SOD活性也為上升趨勢，并且其單氰胺處理組明顯高于對照組，與本試驗結(jié)果也較為一致.這也佐證了SOD活性是葡萄打破休眠，進入萌芽的重要指標.然而，‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄萌芽后的POD活性呈下降趨勢，與本試驗結(jié)果不一致.因此在打破葡萄休眠，進入萌芽這一過程中，引起POD活性變化的機制還需要進行進一步的探討.

黃曉婧等[3]利用單氰胺處理‘夏黑’葡萄后，其可溶性糖先升高后降低，并且在萌芽前，單氰胺處理后的可溶性糖含量高于對照組，而在萌芽后卻低于對照組.單氰胺處理‘夏黑’葡萄后，其淀粉含量下降，且對照組高于單氰胺處理組.這些結(jié)果與本試驗結(jié)果較為一致.譚一婷等[25]研究表明單氰胺處理后的不同葡萄品種中的可溶性糖和淀粉含量均高于對照，與本研究結(jié)果不一致.上述研究結(jié)果表明，在葡萄打破休眠進入萌芽過程中，可溶性糖和淀粉含量的變化在不同葡萄品種中并沒有一致的變化規(guī)律，其原因還有待進一步的探討.

氮、磷、鉀對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要，并且氮、磷、鉀可從植株的老葉或枝條轉(zhuǎn)移至新葉或新芽，促進新葉或新芽的生長.本試驗發(fā)現(xiàn)，單氰胺處理‘水晶’葡萄冬芽的氮、磷、鉀、蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量明顯高于對照組，說明氮、磷、鉀、蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量也在葡萄打破休眠后萌芽過程中具有重要作用.總體而言，單氰胺處理可增加‘水晶’葡萄淀粉水解，提高SOD和POD活性，促進葡萄枝條中氮、磷、鉀轉(zhuǎn)移至冬芽，提高葡萄冬芽中蛋白質(zhì)合成，使葡萄冬芽提前萌發(fā)并生長旺盛.

4 結(jié)論

本研究通過對單氰胺處理后‘水晶’葡萄冬芽的萌發(fā)情況觀察及其生理指標測定，發(fā)現(xiàn)：在處理后第 35 d，與對照組相比，試驗組葡萄的萌芽時間提前了 14 d，冬芽萌芽率和平均芽長度分別是對照組的2.1，1.9倍；試驗組葡萄冬芽的SOD、POD活性較對照組分別增加了13.70%和140.57%，其氮、磷、鉀、可溶性糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量較對照組分別增加了212.41%，21.58%，41.11%，97.64%，98.68%，93.89%；而其淀粉、碳氮比較對照組分別降低了19.93%和61.15%.由此可見，POD活性、氮、可溶性糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量是單氰胺解除葡萄冬芽休眠的主要生理因子.綜上所述，2.5%單氰胺處理‘水晶’葡萄后，可引起葡萄冬芽內(nèi)生理變化，縮短葡萄冬芽萌芽周期，提高萌芽率和萌芽整齊度，促進冬芽的生長.