李心珠,谷春梅*,于寒松,董鵬超,鮑云翔
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)(2.國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工研究室,吉林長(zhǎng)春 130118)
大豆含有豐富的蛋白質(zhì)和各種必需氨基酸,是主要的工業(yè)原材料及經(jīng)濟(jì)作物。同時(shí)富含多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,其中大豆胰蛋白酶抑制因子(Soybean Trypisin Inhibitor,STI)是一種很重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子,包括Kunitz 胰蛋白酶抑制因子(Kunitz Trypsin Ihhibitor,KTI )和 Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk Inhibitor,BBI)[1]。一方面,其與胰蛋白酶、糜蛋白酶相互作用,形成一種不易降解的穩(wěn)定復(fù)合體,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的消化吸收與利用減弱。另外,因?yàn)槿梭w蛋白酶降低,造成體內(nèi)含硫氨基酸降低,引起胰腺腫大、免疫功能下降等,危害人類(lèi)及動(dòng)物健康,制約各行業(yè)大豆利用率[2],因此對(duì)其檢測(cè)勢(shì)在必行。目前對(duì)于KTI 的檢測(cè)有脲酶檢測(cè)、酶化學(xué)檢測(cè)法,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是目前最廣泛的一種免疫檢測(cè)法,用于大豆抗?fàn)I養(yǎng)成分測(cè)定[3,4],通過(guò)酶高效催化作用,使抗體的特異性結(jié)果放大。由于抗體合成成本高以及本身易受到外界環(huán)境的干擾,因此,有必要建立高效的KTI 檢測(cè)技術(shù)。
作為一種新型信號(hào)分子,核酸適配體具有高親和力、易于合成修飾、成本低、靶標(biāo)范圍大等優(yōu)點(diǎn)[5-8],使其在蛋白質(zhì)作用研究[9-11]、環(huán)境監(jiān)控[12-14]、食品安全檢測(cè)[15-17]等眾多領(lǐng)域受到了廣泛重視[18]。核酸適配體作為寡核苷酸片段與靶分子結(jié)合,通過(guò)構(gòu)建適配體生物傳感器將結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的信號(hào)[19],分為熒光適配體傳感器[20-22]、比色適配體傳感器[23,24]、電化學(xué)適配體傳感器[25,26]等。目前納米材料被用于多種方面[27],由于其靈敏、操作簡(jiǎn)單等被作為輔助元件[28]。CNPs 為其中一種,具有價(jià)格低廉、生物相容性好、無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)[29]。由于CNPs 具有納米尺度和碳物質(zhì)特性,對(duì)平面型染料分子的作用強(qiáng),利用π-π堆積作用,可以使單鏈DNA 在其表面產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸附,吸附在CNPs 表面上的熒光團(tuán)通過(guò)電子或能量轉(zhuǎn)移被有效淬滅,因此CNPs 作為熒光淬滅劑,將為生物分子熒光識(shí)別技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[30]。
近年來(lái),核酸信號(hào)放大技術(shù)廣泛用于不同物質(zhì)的分析檢測(cè),其中ExoIII能不斷催化降解雙鏈DNA,并特異性催化其從3’末端水解[31],其信號(hào)放大不需要特定的識(shí)別序列,適用于生物傳感平臺(tái)的構(gòu)建,已被用于核酸[32,33]、金屬離子[34]、有機(jī)物[35]等的檢測(cè)。本研究構(gòu)建一種ExoIII信號(hào)放大技術(shù)與CNPs 結(jié)合的方法,實(shí)驗(yàn)原理如圖1 所示,由KTI 適配體、cDNA、SP、ExoIII和CNPs 5 個(gè)部分組成。不存在KTI 時(shí),APT 與cDNA 產(chǎn)生互補(bǔ)雙鏈,SP 為單鏈結(jié)構(gòu),加入CNPs 后,SP 被CNPs 吸附淬滅;當(dāng)KTI 存在時(shí),KTI與APT 結(jié)合,cDNA 和SP 互補(bǔ)成雙鏈,無(wú)法被CNPs吸附,SP 依然呈現(xiàn)熒光態(tài),同時(shí)ExoIII在3’末端對(duì)其進(jìn)行降解,并通過(guò)ExoIII的周期性切割釋放出大量熒光團(tuán),使熒光強(qiáng)度得到明顯提高,基于此可對(duì)KTI進(jìn)行靈敏檢測(cè)。
圖1 熒光適配體生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.1 Fluorescence aptamer biosensor detection schematic
KTI、BBI、SBA標(biāo)準(zhǔn)品,均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;碳納米顆粒,購(gòu)于北京德科島金;核酸外切酶III,購(gòu)于蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司;豆?jié){;DNA 序列,均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在3’-端的雙鏈DNA 必須至少有4 個(gè)不匹配的堿基,以阻止ExoIII的水解[36]。因此將4 個(gè)胸腺嘧啶T 添加到APT 與cDNA 的3’-端,以阻止ExoIII的DNA 水解,表1 是用于實(shí)驗(yàn)的所有序列。
表1 DNA 序列Table 1 DNA sequences
MB-102 恒溫金屬振蕩浴,杭州博日科技有限公司;YHZ-112B 恒溫振蕩培養(yǎng)搖床,蘇州市國(guó)飛儀器有限公司;infinitieM200型多功能酶標(biāo)儀,Nano Quant;TGL-16 型高速臺(tái)式離心機(jī),上海安亭儀器廠。
1.3.1 熒光適配體生物傳感器檢測(cè)KTI
首先,將APT、cDNA、SP 的濃度分別配置為0.2、0.2、1 μmol/L,取50 μL APT 與50 μL 的KTI 溶液進(jìn)行混合,其中KTI 的質(zhì)量濃度為200 ng/mL,室溫反應(yīng)1 h;然后分別取50 μL cDNA 和50 μL SP 加入到上述混合物中,在室溫下反應(yīng)30 min;最后,添加含40 U ExoIII的緩沖液100 μL,對(duì)SP進(jìn)行消化,在37 ℃條件下反應(yīng)2 h;當(dāng)酶解結(jié)束以后,將體系加熱到75 ℃進(jìn)行5 min 后停止反應(yīng);然后,在反應(yīng)混合物中添加200 μL 的CNPs 溶液,最后的體積是500 μL,并在37 ℃黑暗的條件下培養(yǎng)該混合物30 min[37]。熒光發(fā)射光譜測(cè)試條件為:激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為500~640 nm,入射狹縫以及出射狹縫寬度為5 nm。依照523 nm 處的峰值強(qiáng)度對(duì)KTI 的濃度做定量分析。
1.3.2 CNPs 質(zhì)量濃度的優(yōu)化
CNPs 在本研究中用作檢測(cè)平臺(tái),它的質(zhì)量濃度是影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素。如果系統(tǒng)中CNPs 質(zhì)量濃度太低,無(wú)法有效地消除未被水解的信號(hào)探針SP的熒光,從而使背景熒光強(qiáng)度太高影響檢測(cè)限;在質(zhì)量高濃度下淬滅過(guò)大會(huì)使測(cè)定結(jié)果不精確,所以必須優(yōu)化CNPs 的質(zhì)量濃度。CNPs 的添加質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL,采用與上述1.3.1 熒光適配體生物傳感器檢測(cè)KTI 相同的方法進(jìn)行測(cè)定。
1.3.3 可行性試驗(yàn)
核酸外切酶III作為一種切割酶,具有高效的酶催化活性,對(duì)靶標(biāo)循環(huán)有促進(jìn)作用[38]。為了增加檢測(cè)的靈敏度,使用ExoIII對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行輔助放大,為了驗(yàn)證該方法是否可行需對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)分析,試驗(yàn)共分為a、b、c、d 四組,試劑組合如下表2 所示,其中沒(méi)有添加的試劑被ddH2O 取代,KTI 的質(zhì)量濃度是200 ng/mL,最終體積為500 μL,反應(yīng)過(guò)程同1.3.1。
表2 試劑及組合Table 2 Reagent and combination
1.3.4 特異性研究
為了檢驗(yàn)該方法對(duì)KTI 的特異性,分別加入質(zhì)量濃度為200 ng/mL 的KTI、BBI、SBA 標(biāo)準(zhǔn)溶液,其余操作與1.3.1 相同。通過(guò)比較不同種類(lèi)的KTI 類(lèi)似物存在時(shí),體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度大小來(lái)判斷本方法的選擇性。
1.3.5 豆?jié){樣品中KTI 加標(biāo)回收測(cè)定
取豆?jié){樣品作為檢測(cè)對(duì)象,驗(yàn)證體系在實(shí)際樣品中的實(shí)用性,具體方法如下:用ddH2O 將豆?jié){配置為φ=1%的緩沖體系,加入不同量的KTI 溶液,KTI 的質(zhì)量濃度為50、100、500 ng/mL,獲得了一系列濃度的加標(biāo)KTI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將APT、cDNA、SP 的濃度分別配置為0.2、0.2、1 μmol/L,取50 μL APT 與50 μL 加標(biāo)KTI 溶液進(jìn)行混合,室溫反應(yīng)1 h;分別取50 μL cDNA 和50 μL SP 加入到上述混合物中,在室溫下反應(yīng)30 min;然后,添加含40 U ExoIII的緩沖液100 μL,消化SP,在37 ℃條件下反應(yīng)2 h;當(dāng)酶解結(jié)束以后,將體系加熱到75 ℃進(jìn)行5 min 后停止反應(yīng);最后,在反應(yīng)混合物中添加200 μL 的CNPs 溶液,反應(yīng)總體積為500 μL,并在37 ℃黑暗的條件下培養(yǎng)該混合物30 min,測(cè)試條件同1.3.1。
1.3.6 數(shù)據(jù)分析
試驗(yàn)中的分析數(shù)值均采用三次平行試驗(yàn)進(jìn)行處理,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;采用Origin 2021 和GraphPad Prism 8 軟件繪圖;采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
CNPs 是傳感器的檢測(cè)平臺(tái),其質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響[39],因此需要對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。圖2 為體系中加入不同濃度的CNPs,KTI 是否存在的條件下熒光強(qiáng)度值的變化,其中紅色柱狀為添加KTI 溶液時(shí)的熒光強(qiáng)度,黃色柱狀為未添加KTI 時(shí)的熒光強(qiáng)度。從圖2 中可以看到,CNPs 質(zhì)量濃度越來(lái)越高,系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度逐漸降低,CNPs 質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時(shí),熒光強(qiáng)度顯著高于其他更高質(zhì)量濃度(P<0.05),當(dāng)CNPs 質(zhì)量濃度達(dá)到60 μg/mL 后,質(zhì)量濃度增大對(duì)熒光強(qiáng)度的變化影響不顯著,逐漸趨于平穩(wěn)。是因?yàn)殡S著CNPs 質(zhì)量濃度的增加,熒光信號(hào)被大量淬滅。
圖2 CNPs 在不同質(zhì)量濃度下的熒光強(qiáng)度對(duì)照?qǐng)DFig.2 Comparison of fluorescence intensity of CNPs at different mass concentrations
如圖3 所示為體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度,呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì),當(dāng)CNPs 質(zhì)量濃度為60 μg/mL 時(shí),相對(duì)熒光強(qiáng)度值最高,為1.0 左右,與其他數(shù)據(jù)之間具有顯著差異(P<0.05),之后的相對(duì)熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著差異(P>0.05),因此選擇60 μg/mL 作為最終的優(yōu)化結(jié)果。與馮婷婷等[40]基于CNPs 傳感器檢測(cè)腺苷脫氨酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,CNPs 優(yōu)化質(zhì)量濃度相似。
圖3 CNPs 在不同質(zhì)量濃度下的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.3 The relative fluorescence intensity of CNPs at different mass concentrations
為了考察實(shí)驗(yàn)方法的有效性,該實(shí)驗(yàn)采用了檢測(cè)體系中是否出現(xiàn)ExoIII時(shí)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響來(lái)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性,如圖4 所示。在體系中不具有ExoIII時(shí),加入KTI 與不加入KTI 的熒光強(qiáng)度對(duì)比有較小范圍的不同(圖4 中的b、c),但KTI 的引入使適配體與KTI 結(jié)合,cDNA 與信號(hào)探針SP 互補(bǔ),由此產(chǎn)生了雙鏈DNA,不能完全被CNPs 吸附,從而增加了溶液的熒光強(qiáng)度;當(dāng)體系中加入ExoIII時(shí),體系與CNPs 進(jìn)行酶促切割,從而使檢測(cè)信號(hào)放大,熒光強(qiáng)度顯著增加(圖4 中的a、d),但是體系的背景熒光沒(méi)有太大變化,此時(shí)的熒光信號(hào)是背景信號(hào)的3 倍左右。相對(duì)于沒(méi)有ExoIII的情況下,添加之后熒光信號(hào)增加約80%(圖4 中的b、d)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,利用ExoIII循環(huán)放大技術(shù)可以提高熒光信號(hào)的強(qiáng)度,與趙陽(yáng)陽(yáng)[41]實(shí)驗(yàn)關(guān)于適配體生物傳感器檢測(cè)赭曲霉毒素A的可行性分析中的結(jié)果基本相同,說(shuō)明此方法可行。
圖4 不同體系的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of different systems
方法可行性和CNPs 質(zhì)量濃度優(yōu)化試驗(yàn)條件確定后,將不同質(zhì)量濃度的KTI(100~600 ng/mL)加入到檢測(cè)體系,以研究適配體生物傳感器對(duì)于KTI 檢測(cè)的靈敏度。如圖5 所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著KTI 濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸增加,在此范圍內(nèi)呈線(xiàn)性相關(guān),線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,檢測(cè)限(LOD)設(shè)定為三倍空白溶液的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,因此得出適配體生物傳感器檢測(cè)限(LOD)為12.59 ng/mL。對(duì)照現(xiàn)有KTI 檢測(cè)技術(shù),如表3 所示,本方法對(duì)于KTI 的檢測(cè)優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道[42],具有更低的檢測(cè)限,靈敏度較高。
表3 本方法與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)對(duì)比Table 3 This method is compared with existing detection techniques
圖5 傳感器在不同KTI 質(zhì)量濃度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.5 The standard curve of the sensor at different KTI mass concentrations
選擇以下兩種KTI 類(lèi)似物BBI、SBA 進(jìn)行特異性試驗(yàn),通過(guò)對(duì)KTI 適配體生物傳感器的特異檢測(cè),是測(cè)定其可靠性的一個(gè)重要參數(shù)。主要在于檢測(cè)其能特異性結(jié)合KTI 外,是否還與其他KTI 結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)結(jié)合。如圖6 所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與其他兩種類(lèi)似物BBI、SBA 相比,KTI 體系中相對(duì)熒光強(qiáng)度最高,為0.9 左右,與其他兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(P<0.05),兩種類(lèi)似物的相對(duì)熒光強(qiáng)度較小,核酸適配體不能識(shí)別,兩者數(shù)據(jù)間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明,KTI 適配體能夠進(jìn)行KTI 的特異性識(shí)別,因此驗(yàn)證了該適配體生物傳感器對(duì)KTI具有良好的選擇性和特異性。
圖6 KTI 的特異性試驗(yàn)Fig.6 Specificity test of KTI
基于這種適配體生物傳感器具有良好的檢測(cè)能力和良好的選擇性,在實(shí)際樣本中評(píng)價(jià)其檢測(cè)方法的可行性。用ddH2O 將豆?jié){配置為1%的緩沖體系,加入不同量的KTI 溶液用于分析測(cè)定,KTI 的質(zhì)量濃度分別為50、100、500 ng/mL,采用加標(biāo)回收法對(duì)三種不同KTI 質(zhì)量濃度的回收率進(jìn)行測(cè)定,如表4 所示。回收率介于97.42%~102.85%范圍內(nèi),數(shù)據(jù)之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.61%~2.36%之間,檢測(cè)準(zhǔn)確度良好。結(jié)果表明ExoIII輔助放大信號(hào)檢測(cè)法對(duì)于實(shí)際樣品中的KTI表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能,能有效用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
表4 適配體生物傳感器用于豆?jié){樣品中KTI 的測(cè)定Table 4 Aptamer biosensor for the determination of KTI in soybean milk samples
開(kāi)發(fā)了一種以核酸適配體作為識(shí)別單元,核酸外切酶III作為信號(hào)放大元件以及碳納米顆粒作為信號(hào)開(kāi)關(guān)的熒光型適配體生物傳感器,利用ExoIII不斷降解-雜交循環(huán),結(jié)合CNPs 的熒光淬滅效果對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大,可以有效提高KTI 檢測(cè)的靈敏度。KTI 的熒光強(qiáng)度與KTI 濃度之間存在著一定的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,檢測(cè)限(LOD)為12.59 ng/mL,所設(shè)計(jì)的核酸適配體生物傳感器顯示出良好的選擇性。以豆?jié){作為樣品,采用加標(biāo)回收法測(cè)得回收率為97.42%~102.85%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.61%~2.36%之間。相對(duì)于常規(guī)的測(cè)定方法,該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、專(zhuān)一性良好等優(yōu)點(diǎn),可以作為一種新的測(cè)定方法用于實(shí)際樣品中KTI 的檢測(cè)。