乳酸菌發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中功能活性物質(zhì)與風(fēng)味成分的比較

林華嗣，黃慶，田勝蘭，胡曉波

（南昌大學(xué)食品學(xué)院，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西南昌 330047）

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）屬于蘭科石斛屬植物的新鮮或干燥莖，是我國傳統(tǒng)名貴的中草藥，因其表皮為鐵綠色而出名，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，素有“藥中黃金”、“救命仙草”之美譽，其含有的化學(xué)成分有多糖、石斛堿、氨基酸等，藥理作用有增強免疫力、抗氧化、改善胃腸功能等[1]。隨著人工種植技術(shù)的突破，鐵皮石斛產(chǎn)量不斷增加，近年來主要通過復(fù)配調(diào)配和發(fā)酵兩種途徑進(jìn)行利用和開發(fā)[2]。發(fā)酵產(chǎn)品不僅能保留原料的活性成分、消除抗?fàn)I養(yǎng)因素、改善生物利用率[3]，還符合消費者追求綠色健康食品的理念。因此，探究發(fā)酵對鐵皮石斛的影響對提高鐵皮石斛的經(jīng)濟效益及保健效益具有重要意義。

研究表明，乳酸菌發(fā)酵可以提高食品的營養(yǎng)價值、品質(zhì)、安全、保藏性以及改善食品的風(fēng)味[4-6]。例如，任運紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)使用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 和釀酒酵母菌171 發(fā)酵鐵皮石斛酒，可促進(jìn)鐵皮石斛中有益物質(zhì)的溶出率，提高發(fā)酵酒的營養(yǎng)價值；舒旭晨等[8]研究發(fā)現(xiàn)使用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛鮮條，得到具有良好抗氧化活性的石斛酵素；Xu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)以鐵皮石斛和香蕉為原料進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵后的復(fù)合果汁的品質(zhì)、抗氧化能力和貯藏穩(wěn)定性均有提高。目前鐵皮石斛多采用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵或添加其他輔料共發(fā)酵，而采用混合乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛汁并研究其功能活性物質(zhì)及風(fēng)味成分的研究鮮有報道。

隨著人們對健康的認(rèn)識和關(guān)注度的增加，社會對食品的營養(yǎng)和功能提出了更高的要求。目前鐵皮石斛深加工產(chǎn)品和開發(fā)力度還不是很充分。試驗前期在對比單菌和混菌發(fā)酵基礎(chǔ)上，選擇鐵皮石斛汁中活菌數(shù)最高、抗氧化能力最強[10]的發(fā)酵菌種，即嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus，La）和副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei，Lp）混合發(fā)酵，探討鐵皮石斛汁中功能活性物質(zhì)與風(fēng)味成分的變化，為鐵皮石斛產(chǎn)品研發(fā)提供新的思路和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江西省龍虎山大棚人工種植的一年生新鮮鐵皮石斛莖，江西軒斛生物科技有限公司；副干酪乳桿菌菌粉（JLPF-176）、嗜酸乳桿菌菌粉（JYLA-191），山東中科嘉億生物工程有限公司；檸檬酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸、乙酸，均為分析純，北京索萊寶科技有限公司；甲醇，色譜純，美國Sigma 公司；甲酸，色譜純，中國上海阿拉丁有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；UPLC-ESI-QTOF-MS/MS、7890A-7000 型氣相色譜-質(zhì)譜儀、Agilent 1260 HPLC 系統(tǒng)，美國Agilent；L-8900型氨基酸分析儀，日本HITACHI 公司；JS-THERMO型多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；TU-1810DAP型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL216G 型高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；YXQ-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQTY-70E 型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SW-CJ 型雙人凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鐵皮石斛汁的制備

將新鮮鐵皮石斛莖清洗晾干，切成2～3 cm 段，70 ℃水浴熱燙5 min，按料水比1:10（m/V）進(jìn)行打漿，用四層紗布進(jìn)行過濾，取100 mL 濾汁采用90 ℃保持5 min 進(jìn)行殺菌處理，得到鐵皮石斛汁（Dendrobium officinaleJuices，DOJ），于4 800 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行測定。

1.3.2 發(fā)酵鐵皮石斛汁的制備

取La 和Lp 的凍干菌粉分別添加到生理鹽水1:100（m/V），置于37 ℃水浴鍋中活化20 min，活化后La 和Lp 的菌數(shù)目均為1.0×108CFU/mL，參考黃慶等[10]的發(fā)酵方法，等比例接種2%（V/V）的La 和Lp的活化菌液于100 mL 鐵皮石斛汁中，于37 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵轉(zhuǎn)速150 r/min，得到發(fā)酵鐵皮石斛汁（FermentedDendrobiumofficinaleJuices，F(xiàn)DOJ），于4 800 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行測定。

1.3.3 活性物質(zhì)的測定

1.3.3.1 多糖含量

參考《中華人民共和國藥典》第一部（2020 年版）測定多糖含量[11]。

1.3.3.2 多糖分子量

樣品處理：用體積分?jǐn)?shù)為φ=95%乙醇和100 mL上清液以4:1（V/V）進(jìn)行沉淀，靜置過夜，于4 800 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用去離子水復(fù)溶，用α-淀粉酶除淀粉，sevage 法脫蛋白后旋蒸濃縮，凍干得多糖樣品。采用Yang 等[12]的方法，通過測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.182x+1.410 5，R2=0.999 7。

1.3.3.3 乙酸乙酯萃取成分

采用Dong 等[13]的方法，略有改動。樣品處理：20 mL 上清液用乙酸乙酯以1:1（V/V）反復(fù)萃取3 次，合并乙酸乙酯相，蒸發(fā)濃縮至粉末。將干燥后的提取物重新復(fù)溶于1 mL 色譜級甲醇溶液中，經(jīng)0.22 μm 的有機相濾膜過濾。

液相條件：梯度洗脫程序為5%～5%，0～1.5 min B；5%～35%，1.5～26 min B；35%～60%，26～33 min B；60%～100%，33～38 min B；100%～100%，38～41 min B；100%～5%，41～43 min B；5%～5%，43～45 min B。紫外色譜吸收波長設(shè)置為245 nm、280 nm、334 nm。

1.3.4 風(fēng)味成分的測定

1.3.4.1 揮發(fā)性成分

采用Yang 等[14]的方法，略有改動。樣品處理：稱取5 g 樣品于20 mL 進(jìn)樣瓶中，在80 ℃下平衡30 min，采用老化處理過的萃取頭頂空吸附30 min，隨后開始解吸。

GC-MS 測定條件：HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min 后以8 ℃/min的速度升溫到70 ℃，保持4 min，再以4 ℃/min的速度升溫到145 ℃，以10 ℃/min的速度升溫到220 ℃，保持3 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為He，流量為1.0 mL/min；碰撞氣為N2，流量1.5 mL/min；淬滅氣為He，流量2.25 mL/min；電子轟擊源（EI）：70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃。

1.3.4.2 游離氨基酸

采用Chen 等[15]的方法，略有改動。用體積分?jǐn)?shù)為1%的三氯乙酸將2 mL 上清液稀釋10 倍，于4 ℃條件下10 000 r/min 離心10 min，取上清液再用0.02 mol/L 的鹽酸溶液1:1（V/V）進(jìn)行稀釋混勻，再經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后供氨基酸自動分析儀測試。

1.3.4.3 有機酸

采用Yang 等[14]的方法，略有改動。樣品處理：取2 mL上清液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾供高效液相色譜儀測試。色譜條件：BIO-RAD Aminex? HPX-87H離子交換色譜柱C18（5 μm，250 mm×7.8 mm）；流動相：6 mmol/L 的稀硫酸；檢測器：紫外檢測器，波長：210 nm；流速0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗平行測定3 次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用IBM SPSS Statistics 25 軟件處理數(shù)據(jù)，P＜0.05 為顯著差異，P＜0.01 為極顯著差異。使用Origin 9 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量分析

多糖是鐵皮石斛重要的活性物質(zhì)之一，鐵皮石斛多糖能起到抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗糖尿病等功能[1]。發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中多糖含量變化如圖1 所示，DOJ 中多糖含量為3.88 mg/mL，F(xiàn)DOJ 中多糖含量為3.03 mg/mL，鐵皮石斛汁經(jīng)發(fā)酵后多糖含量極顯著降低21.91%（P＜0.01）。王丹等[16]研究報道植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵鐵皮石斛多糖含量明顯下降，與本研究結(jié)果一致。發(fā)酵鐵皮石斛汁中多糖含量降低可能是因為乳酸菌通過碳水化合物活性酶利用多糖來維持乳酸菌的生理活動[17]。

圖1 DOJ 和FDOJ 的多糖含量Fig.1 Polysaccharide content of DOJ and FDOJ

2.2 多糖分子量分析

結(jié)果如表1 所示，DOJ 有3 個洗脫峰，而FDOJ有4 個洗脫峰，多糖的平均分子量由發(fā)酵前的184.40 ku 減小至發(fā)酵后的91.27 ku。多糖的平均分子量減小的原因可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了相應(yīng)的酶降解了多糖[17]，這與王丹等[18]研究的結(jié)果一致。分子量是研究多糖結(jié)構(gòu)與活性的重要參數(shù)之一，多糖的分子量越小意味著體積也越小，體積小的多糖容易穿透細(xì)胞膜，有利于多糖發(fā)揮出抗氧化和降血糖[18]等活性。結(jié)果表明，乳酸菌能有效地利用鐵皮石斛汁中多糖，降低其分子量，提高鐵皮石斛汁中多糖潛在的活性。

表1 DOJ 和FDOJ 的多糖分子量Table 1 The molecular weight of polysaccharides of DOJ and FDOJ

2.3 乙酸乙酯萃取成分分析

根據(jù)負(fù)離子模式下各色譜峰的保留時間、紫外特征、分子和離子峰及主要碎片峰信息，結(jié)合文獻(xiàn)、Mass Bank 數(shù)據(jù)庫收錄的天然產(chǎn)物對化合物進(jìn)行鑒定[19]。鑒定結(jié)果如表2 所示，發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中乙酸乙酯萃取成分共鑒定出25 種化合物，其中相同化合物11種，差異化合物14 種。

表2 DOJ 和FDOJ 乙酸乙酯萃取成分Table 2 The ethyl acetate extracted components of DOJ and FDOJ

從表2 可知，DOJ 中鑒定出20 種化合物，包括有機酸6 種、羥基苯甲酸2 種、羥基肉桂酸3 種、類黃酮7 種、其他2 種；FDOJ 中鑒定出16 種，包括有機酸4 種、羥基苯甲酸3 種、羥基肉桂酸2 種、類黃酮5 種、其他2 種。發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中有機酸、羥基肉桂酸和類黃酮物質(zhì)較發(fā)酵前分別減少2 種、1種和2 種，羥基苯甲酸較發(fā)酵前增加1 種。表明乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物或?qū)⒃现械奈镔|(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換[20]，使鐵皮石斛汁的活性成分發(fā)生變化，例如，發(fā)酵鐵皮石斛汁中的沒食子酸，它是一種具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等[21]活性的新成分。

2.4 揮發(fā)性成分分析

DOJ 和FDOJ 的揮發(fā)性成分如表3 所示，發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中共檢測出41 種揮發(fā)性成分，其中發(fā)酵前后鐵皮石斛汁中相同揮發(fā)性成分6 種，差異揮發(fā)性成分35 種。

表3 DOJ 和FDOJ 的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components of DOJ and FDOJ

從表3 可知，DOJ 中檢測出21 種揮發(fā)性成分，包括芳香烴1 種、酚類與醇類2 種、吡喃與呋喃1 種、烯烴8 種、醛類與酮類4 種、螺環(huán)類1 種、酯類1 種、酸類3 種，其中(+)-檸檬烯（40.59%）是DOJ 中主要揮發(fā)性成分；FDOJ 中檢測出26 種揮發(fā)性成分，包括酚類與醇類9 種、吡喃與呋喃1 種、烯烴5 種、醛類與酮類9 種、螺環(huán)類1 種、酯類1 種，其中芳樟醇（42.55%）是FDOJ 中主要揮發(fā)性成分。發(fā)酵后鐵皮石斛汁中酚類與醇類、醛類與酮類物質(zhì)較發(fā)酵前分別增加7 種和5 種，烯烴物質(zhì)較發(fā)酵前減少3 種。表明鐵皮石斛汁在發(fā)酵前后的風(fēng)味成分有明顯變化，與熊濤[22]等研究報道有相似的結(jié)果。

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，如圖2a 所示，發(fā)酵前芳香烴、酚類與醇類、吡喃與呋喃、烯烴、醛類與酮類、螺環(huán)類、酯類、酸類物質(zhì)相對含量分別為0.77%、3.96%、3.34%、65.16%、7.04%、0.72%、10.30%、8.70%，發(fā)酵后酚類與醇類、吡喃與呋喃、烯烴、醛類與酮類、螺環(huán)類、酯類物質(zhì)相對含量分別為57.44%、1.35%、24.46%、10.11%、1.60%、5.04%。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后烯烴物質(zhì)相對含量減少，酚類與醇類物質(zhì)相對含量增多，未檢出芳香烴和酸類物質(zhì)，說明鐵皮石斛汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后烯烴類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酚類與醇類香氣物質(zhì)[23]。根據(jù)香氣描述分類，如圖2b 所示，發(fā)酵前花香、水果香、其他香氣物質(zhì)相對含量分別為0.77%、50.07%、5.04%%，發(fā)酵后花香、木香、水果香、茶香、其他香氣物質(zhì)相對含量分別為52.41%、1.5%、27.5%、0.47%、1.42%。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后水果香氣物質(zhì)相對含量減少，花香香氣物質(zhì)相對含量增多，檢出木香和茶香香氣物質(zhì)，牛佳佳等[24]研究報道乳酸菌發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量增加，產(chǎn)生大量的高級醇，使發(fā)酵汁具有獨特的風(fēng)味，與本研究結(jié)果一致。

2.5 游離氨基酸分析

鐵皮石斛汁發(fā)酵前后游離氨基酸的種類和含量變化如圖3 所示，DOJ 中檢測出9 種游離氨基酸，F(xiàn)DOJ中檢測出15 種游離氨基酸，發(fā)酵后游離氨基酸種類較發(fā)酵前增加6 種，分別為絲氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）。發(fā)酵鐵皮石斛汁中檢測出6 種人體必需氨基酸，比發(fā)酵前多2 種，分別為Phe 和Ile。氨基酸總含量由發(fā)酵前的1.48 mmol/L 增加到發(fā)酵后的5.85 mmol/L，其中谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）的含量分別極顯著升高（P＜0.01），天冬氨酸（Asp）的含量極顯著降低（P＜0.01）。氨基酸種類和含量變化的原因可能是乳酸菌通過內(nèi)源性蛋白酶水解蛋白質(zhì)，以及乳酸菌利用氨基酸生物轉(zhuǎn)化成其他種類的氨基酸[31]。氨基酸不僅是營養(yǎng)成分，也是呈味物質(zhì)。例如，Lys 和Arg 能夠預(yù)防疾病和增強人體免疫力[32]，Asp、Gly、Glu、Ala、Arg 能賦予發(fā)酵汁甜味和鮮味[33]。綜上，乳酸菌發(fā)酵可增加鐵皮石斛汁中必需氨基酸和呈味氨基酸的種類與含量，賦予鐵皮石斛汁良好的營養(yǎng)和風(fēng)味。

圖3 DOJ 和FDOJ 的游離氨基酸種類與含量Fig.3 Free amino acid species and content of DOJ and FDOJ

2.6 有機酸分析

鐵皮石斛汁發(fā)酵前后有機酸的種類和含量變化如圖4 所示，總共檢測出5 種有機酸，在DOJ 中檢測出3 種有機酸，在FDOJ 中檢測出4 種有機酸，檸檬酸在FDOJ 中未檢出，乳酸和乙酸僅在FDOJ 中檢出。有機酸總含量由發(fā)酵前的1 671.90 mg/L 升高至發(fā)酵后的2 045.50 mg/L，其中發(fā)酵后乳酸含量高達(dá)1 556.70 mg/L，占有機酸總含量的76.11%；發(fā)酵后蘋果酸和琥珀酸的含量極顯著降低83.43%和65.89%（P＜0.01），含量分別為128.70 mg/L 和261.90 mg/L，可能是蘋果酸在三羧酸循環(huán)中被轉(zhuǎn)化成了乳酸，琥珀酸在碳代謝中被丙酮酸氧化成氫離子和乙酸[34]，這也是發(fā)酵后檢測出乙酸的原因之一。乳酸產(chǎn)生的另外一個原因可能是葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成丙酮酸，在乳酸脫氫酶的作用下被還原成乳酸[34]，表明乳酸菌發(fā)酵能夠增加鐵皮石斛汁有機酸的種類和含量。不同的有機酸對食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)不同，楊舒雅[35]研究報道微量的乙酸能夠豐富食品的口感，乳酸具有柔潤的口感，蘋果酸帶有水果的香氣，但具有澀味和生青味，檸檬酸口感清冽，而琥珀酸帶有點苦味。綜上，發(fā)酵鐵皮石斛汁含有大量的乳酸、微量的乙酸、少量的蘋果酸和琥珀酸，乳酸菌發(fā)酵賦予鐵皮石斛汁柔潤的口感。

圖4 DOJ 和FDOJ 的有機酸含量Fig.4 Organic acid content of DOJ and FDOJ

3 結(jié)論

利用嗜酸乳桿菌與副干酪乳桿菌混合發(fā)酵鐵皮石斛汁，探究乳酸菌發(fā)酵對鐵皮石斛汁的影響。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵使石斛汁中多糖平均分子量減小，新產(chǎn)生的較小分子量多糖能夠更好的吸收，增強多糖的潛在功能活性；產(chǎn)生有助于提高石斛汁的新功能活性物質(zhì)，如具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的沒食子酸活性成分。發(fā)酵后烯烴物質(zhì)種類和相對含量均降低，酚類和醇類物質(zhì)種類和相對含量均增加；同時必需氨基酸和呈味氨基酸的種類和含量均增加；有機酸種類增加，乳酸含量占有機酸總含量的76.11%，蘋果酸和琥珀酸含量顯著降低。這些成分的變化共同影響了鐵皮石斛汁的風(fēng)味，賦予了鐵皮石斛汁花香香氣、鮮甜的風(fēng)味及柔潤的口感?？傮w而言，嗜酸乳桿菌與副干酪乳桿菌混合發(fā)酵的鐵皮石斛汁，在功能成分以及風(fēng)味方面表現(xiàn)出一定的改善與提高，為鐵皮石斛益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供了可靠的理論依據(jù)。