牛蒡根蛋白-降壓肽納米顆粒的制備及穩(wěn)定性表征

李在群，柴智，馮進，馬愷揚，李瑩*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212000）（2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

牛蒡俗稱東洋參，屬菊科草本植物，是一種具有較高食用價值和藥用價值的中藥。牛蒡根具有抗菌、抗氧化、降血糖等藥理活性[1]，新鮮牛蒡根由70%水、2.8%蛋白質(zhì)、25%碳水化合物及0.6%灰分組成，其中蛋白質(zhì)為牛蒡根重要組成成分[2]。然而，牛蒡作為食品原料的研究已經(jīng)非常廣泛，但其研究重點多為牛蒡多糖與膳食纖維[3]，而不是牛蒡蛋白。隨著消費者對食品安全的擔憂和動物源蛋白價格的上漲，人們對天然植物源蛋白的興趣不斷增加[4]。據(jù)報道，根莖中膳食蛋白質(zhì)被認為是一種具有較高生物價值的蛋白質(zhì)[5]。例如，Tran 等[6]報道的山參蛋白介導的納米顆粒表現(xiàn)出良好的抗炎效果。牛蒡根干片中蛋白質(zhì)含量為12.3%，蛋白質(zhì)在加工過程中作為副產(chǎn)品被丟棄，造成蛋白質(zhì)資源的浪費。而牛蒡根中氨基酸含量比較豐富，其中藥效氨基酸占氨基酸總量的77.65%，鮮味氨基酸為36.34%，同時也是一種成本較低的天然植物蛋白來源[7]。

從泥鰍中提取的降壓肽具有較強的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）抑制活性[8]，然而，生物活性肽易被胃腸道中的酶降解，需要通過載體保護其能遞送到有效作用靶位點[9]。這可以通過納米載體包埋來實現(xiàn)，以保護其結(jié)構(gòu)和功能完整性，并提高其對胃腸道蛋白酶和肽酶的穩(wěn)定性。因此，包封已成為促進生物活性肽作為功能性食品增強人類健康的相關重要技術，它保護生物活性肽免受物理化學影響，并增強其在體外和體內(nèi)的功效[10]。

納米顆粒作為載體具有多種優(yōu)勢，納米技術已成為制藥科學領域的重要組成部分。在納米顆粒中，蛋白質(zhì)基納米顆粒是最重要的。研究表明，蛋白質(zhì)基納米顆粒與其他類型的納米顆粒相比具有無毒和可生物降解等優(yōu)勢[11]。Yang 等[12]測試了乳清蛋白水解物在麥芽糖糊精和β-環(huán)糊精膠囊中的包封效果。另一方面，Alvarado 等[13]使用海藻酸鹽阿拉伯膠包封抗高血壓肽。這些研究中最重要的結(jié)果是證實了包埋可以提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。盡管如此，關于活性分子包封優(yōu)點的證據(jù)是不夠的，需要更多的研究來證明，以便提供有關活性分子包埋技術的相關數(shù)據(jù)。

本研究通過自組裝制備負載泥鰍降壓肽的牛蒡根蛋白納米顆粒，探討不同因素對AHLL 的包埋效果及其穩(wěn)定性情況，同時對牛蒡根蛋白納米顆粒的粒徑、微觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行表征，不僅提高牛蒡根蛋白的利用率，而且為泥鰍源降壓肽的口服利用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛蒡粉，實驗室前期制備；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，上海強耀公司；Tris-HCl 緩沖液，上海源葉生物有限公司；透析袋（8 000～14 000 u），上海源葉生物有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；PAGE 預制膠，上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

BX-2F 磁力攪拌器，常州普天儀器制造有限公司；TGL-50 WS 型大容量高速離心機，鞏義市宏華儀器設備工貿(mào)有限公司；LB 941 TriStar 微孔板多功能分析儀，德國Berthold Technologies 公司；1260 Infinity 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；Alpha-1900Plus 紫外分光光度計，上海普元儀器有限公司；F-7000 熒光分光光度計，日本Hitachi 公司；500 型精密電子天平，意大利BEL 公司；DK-8D 電子恒溫水浴槽，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛蒡蛋白提取

采用Tris-HCl 緩沖液浸提法提取牛蒡根蛋白[14]，取4 g 牛蒡粉按照1:10 料液比加入pH 值8 和pH 值9的NaOH 溶液與不同濃度Tris-HCl 緩沖液（pH 值7.4）40 mL，充分搖勻混合后4 ℃冰箱浸提過夜（約10 h），充分浸提后7 000 r/min 離心10 min 取上清液，向上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%（m/V），4 ℃冰箱過夜后6 000 r/min 離心10 min，除去上清液得到蛋白質(zhì)浸膏，加入少量Tris-HCl 緩沖液使蛋白質(zhì)溶解，使用超純水透析（截留量為8 000～14 000 u）3 d，凍干后得到牛蒡根蛋白粉末。

1.2.2 蛋白含量測定

將得到的0.5 mg 牛蒡粗蛋白加入1 mL 超純水中復溶，充分混勻后6 000 r/min，離心10 min，取上清液。采用BCA 法對提取的牛蒡粗蛋白進行測定[15]，按照試劑A 與試劑B 50:1 的比列配制工作液，將0.5 mg/mL 的標準品按1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96 孔板中，并用PBS 補足至20 μL，分別加入200 μL BCA 工作液混勻，37 ℃靜置30 min，波長562 nm 酶標儀測定不同濃度標準品的吸光度，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=0.904x+0.091 3（R2=0.999 3）。牛蒡粗蛋白中的蛋白質(zhì)含量根據(jù)以上方程及蛋白測定的濃度求得。

1.2.3 Native-PAGE 分析

將制備的蛋白上清液置于離心管中，加入上樣緩沖液2 mL，混勻，10 000 r/min 離心3 min 取上清，上樣量為20 μL，配制12%（V/V）分離膠，5%（V/V）濃縮膠，以恒流模式進行凝膠電泳。利用0.25%（m/m）考馬斯亮藍（R-25）染液對凝膠染色1 h，使用脫色液（乙酸:乙醇:水=50:75:875）4 ℃冰箱脫色6 h。

1.2.4 BANPs 制備

用HBSS 配制0.01 mol/L 平衡鹽溶液，將20 mg AHLL 溶于1 mL HBSS 中制成20 mg/mL 的AHLL 母液，將15 mg 牛蒡根蛋白溶于10 mL 純水中磁力攪拌30 min，使蛋白充分溶解，將溶液pH 值調(diào)節(jié)至5，向溶液中緩慢滴加20 mg/mL AHLL 母液使其最終質(zhì)量濃度為200 μg/mL，隨后置于4 ℃層析柜磁力攪拌2 h使其充分結(jié)合。通過超高壓微射流（12 000 PSI）后，用純水進行透析，透析期間每4 h 更換一次透析液，透析3 d 后將溶液取出避光保存。

1.2.5 BRP質(zhì)量濃度對包封率及載藥量的影響

控制AHLL 質(zhì)量濃度為400 μg/mL，其他因素條件不變，利用一系列質(zhì)量濃度梯度的AHLL 溶液制備BANPs 溶液。探討不同質(zhì)量濃度的AHLL 對納米顆粒溶液的包埋效果。包埋率與載藥量由下式計算：

式中：

E——包埋率，%；

L——載藥量，%；

A0——投入AHLL 的質(zhì)量濃度，μg/mL；

A1——游離AHLL 的質(zhì)量濃度，μg/mL；

A2——投入BRP 的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.6 AHLL 質(zhì)量濃度對包封率及載藥量的影響

控制BRP 為8 mg/mL，其他因素條件不變，利用一系列濃度梯度的AHLL 溶液制備BANPs 復合納米顆粒溶液。探討不同濃度的AHLL 對復合納米顆粒溶液的包埋效果。

1.2.7 BANPs 結(jié)構(gòu)測定

1.2.7.1 掃描電子顯微鏡（SEM）實驗

吸取10 μL按上述1.2.4的方法制備的復合納米顆粒載體溶液滴加在潔凈的蓋玻片上室溫下烘干液滴后，再將蓋玻片粘結(jié)在具有導電裝置的樣品臺上，在真空環(huán)境下做噴金處理操作，在掃描電鏡下觀測樣品形態(tài)特征。

1.2.7.2 粒徑及Zeta 電位測定

使用動態(tài)光散射測定納米顆粒的粒徑分布和電位。將上述按1.2.4 制備的BRP、BANPs 溶液放入納米粒度儀的檢測槽中，設置溫度為（25±1）℃、光散射角度90°，功率30 W。在此條件下測定復合納米顆粒的粒徑和Zeta 電位數(shù)值。

1.2.7.3 傅里葉變換紅外光譜

采用傅立葉變換紅外光譜光譜儀評估了BRP 與AHLL 之間的相互作用。將BANPs 凍干粉末用杵手工研磨成粉末。將研磨好的粉末在4×108Pa 的壓力下壓制成薄片。以空氣為背景，在500～4 000 cm-1和4 cm-1分辨率范圍內(nèi)分析紅外吸收掃描。

1.2.7.4 熒光光譜分析

使用熒光分光度計對BRP 與BANPs 進行內(nèi)源熒光測定。將上述制備的復合納米顆粒溶液加入微量比色皿中，熒光激發(fā)波長280 nm，熒光發(fā)射波長285～500 nm，激發(fā)縫寬3 nm，發(fā)射狹縫寬度10 nm，掃描速度為300 nm/min，于此條件下對樣品進行檢測。

1.2.7.5 紫外-可見光分析

使用紫外分光度計對BRP、BANPs 及AHLL 進行紫外-可見光光譜掃描，將上述制備的復合納米顆粒溶液加入石英比色皿中，紫外光譜掃描起始波長190 nm，終止波長600 nm 對樣品進行紫外檢測。

1.2.7.6 不同解離溶劑對納米顆粒的影響

利用尿素、NaCl 和SDS 對BANPs 原液進行稀釋，得到尿素稀釋液（6 mol/L）、NaCl 稀釋液（0.5 mol/L）和SDS 稀釋液（0.5%）樣品。對每個樣品的濁度、粒徑和Zeta 電位進行測定。

1.2.8 BANPs 穩(wěn)定性測定

1.2.8.1 溫度對納米顆粒穩(wěn)定性的影響

將制備好的將制備好的AHLL、BRP、BANPs 溶液分別置于不同溫度（60、70、80、90、100 ℃）的水浴鍋中保溫1 h 后取樣，對照為AHLL 溶液標品，取樣后過0.45 μm濾膜，用高效液相法測定多肽AHLL的保留量，并利用動態(tài)光散射對其粒徑和電位進行測定。AHLL 的降解率由下式計算：

式中：

R——降解率，%；

A0——初始AHLL 的質(zhì)量濃度，μg/mL；

A1——處理后AHLL 的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.8.2 pH 值對納米顆粒穩(wěn)定性的影響

調(diào)節(jié)AHLL、BRP、BANPs 復合納米顆粒溶液pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），磁力攪拌60 min 后，用高效液相法測定多肽AHLL 的保留量，并利用動態(tài)光散射對其粒徑和電位進行測定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)至少重復3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值和標準差表示。采用SASS 9.4 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提溶劑對BRP提取率及蛋白含量的影響

堿溶酸沉法是蛋白質(zhì)提取的傳統(tǒng)方法。本研究采用NaOH 溶液（pH 值8.0、9.0）和0.05、0.1、0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液作為浸提溶劑分別對BRP 進行提取，并考察了BRP 的提取率及蛋白含量。由圖1 可知，浸提溶劑的種類和濃度對BRP 的提取率和蛋白含量具有顯著的影響。傳統(tǒng)堿液提取時，BRP 提取率較低，且長時間的堿液浸提也易造成蛋白質(zhì)的變性和有害物質(zhì)生成，對蛋白質(zhì)的后續(xù)利用產(chǎn)生不良影響。Tris-HCl 緩沖液顯著提升了 BRP 的提取率（P＜0.05），且提取率和蛋白含量隨著緩沖液體系濃度的增加而表現(xiàn)出增大的趨勢。0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液作為浸提溶劑時，BRP 的得率和蛋白含量最高，分別為6.62%和68.62%。

圖1 不同浸提溶劑對牛蒡根蛋白提取率及蛋白含量的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the extraction yield and protein content of burdock root protein

2.2 BRP 的Native-PAGE 分析

通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了BRP 的均一性，這是一種在非變性條件下分離蛋白復合物的高分辨率方法[16]。結(jié)果如圖2 所示，天然的BRP 僅在75～100 ku 之間有一條明顯的條帶，表明大部分BRP 都集中在這個分子量范圍內(nèi)，提取得到的BRP 較為均一。此外，本研究采用的溶劑提取法對BRP 的影響較小，沒有破壞牛蒡中固有蛋白組成，也沒有雜蛋白干擾。

圖2 BRP 的Native-PAGE 電泳圖譜Fig.2 Native-PAGE electrophoretic pattern of BRP

2.3 BRP、AHLL 質(zhì)量濃度對BANPs 包封率和載藥量的影響

活性肽的包封效率是影響其穩(wěn)定性和功能發(fā)揮的重要因素之一[17]。為此，本研究測定了BRP 和AHLL的質(zhì)量濃度變化對降壓肽包封效率及載藥量的影響。固定降壓肽AHLL 的添加量為200 μg/mL，保持其它條件不變的情況下制備BANPs，探討載體蛋白BRP濃度對AHLL 包封率的影響。由圖3a 可見，隨著BRP濃度的增加，納米顆粒中AHLL 包封率快速且顯著地上升，當BRP 為8 mg/mL 時，AHLL 的包封率最高，達到71.43%，隨后繼續(xù)增大BRP 質(zhì)量濃度，包封率變化不大，甚至表現(xiàn)出一定的下降趨勢。BANPs 的載藥量也具有類似的變化：載藥量起初隨著BRP 質(zhì)量濃度的增大而上升，接著快速下降并基本保持穩(wěn)定。這說明，BANPs 的包封率和載藥量與載體蛋白BRP 質(zhì)量濃度之間并不呈現(xiàn)簡單的線性正相關關系。當BRP質(zhì)量濃度較低時，溶液中的載體數(shù)量較少，沒有足夠多的蛋白分子包裹AHLL 導致對AHLL 的包封不充分，因此包封率較低。增加載體BRP 的質(zhì)量濃度將導致體系中形成更多穩(wěn)定的納米顆粒，AHLL 的包封率和載藥量隨之升高，并逐漸達到飽和。此時繼續(xù)增大BRP 質(zhì)量濃度，體系中過剩的載體分子并不有助于包封率的進一步提升，過高的BRP 質(zhì)量濃度下載體蛋白反而會發(fā)生聚集，影響包埋效果，造成AHLL包封率和載藥量呈現(xiàn)出下降的趨勢。Yuan 等[18]采用不同比例的玉米醇溶蛋白包埋葉黃素，其包埋率與載藥量同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖3 BRP、AHLL 濃度對復合納米顆粒包封率和載藥量的影響Fig.3 Effect of BRP and AHLL concentrations on the encapsulation efficiency and drug loading of composite nanoparticles

類似地，固定載體蛋白BRP 為8 mg/mL，保持其它條件不變的情況下，考察AHLL 添加量對BANPs包封率和載藥量的影響（圖3b）。隨著AHLL 添加量的增加，納米顆粒的包封率首先略有增大并基本保持穩(wěn)定，當AHLL 質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時，包封率最高，達到77.28%，此后包封率呈現(xiàn)出下降趨勢。納米顆粒的載藥量隨著AHLL 質(zhì)量濃度的增加不斷提高，之后保持平穩(wěn)。這表明，當載體數(shù)量過剩時，增加AHLL 質(zhì)量濃度可以提高納米顆粒的載藥量。當BRP與AHLL 充分結(jié)合形成穩(wěn)定的納米顆粒后，由于蛋白載體逐漸飽和，過多的AHLL 分子也不會被包埋，反而會造成體系包封率的下降。

2.4 BANPs 的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 粒徑與電位分析

zeta 電位決定了懸浮在液體中的納米顆粒的團聚狀況，一般可反映粒子之間由于靜電排斥所產(chǎn)生的穩(wěn)定性。zeta 電位值越大，表明納米顆粒表面同種電荷產(chǎn)生的靜電斥力越大，體系穩(wěn)定性也相對越好[19]。圖4展示了不同pH 值條件下（pH 值2.0～7.0）BRP 和BANPs 的粒徑和電位值變化。pH 值2.0 時，BRP 帶正電荷；pH 值3.0 左右，BRP 大量凝集形成沉淀，聚集體粒徑較大，且電位值趨于零，推測此時達到BRP的等電點。pH 值4.0～7.0 時BRP 帶較多負電荷，當pH 值6 時BANPs 電位值為-21.33 mV，由于負電荷的增加，粒子間的排斥力使BRP 粒徑較小，集中在138.53～185.47 nm，BRP 體系整體較為穩(wěn)定，殷婷等[20]報道的負載白藜蘆醇的大麥醇溶蛋白納米顆粒Zeta電位均在20 mV 左右，Zeta 電位（正或負）越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集。當BRP 與AHLL 結(jié)合形成納米顆粒后，由于AHLL 的引入使得BANPs 的粒徑略高于BRP，為166.80～280.30 nm，粒徑分布均勻，且在pH 值4.0～7.0 的范圍內(nèi)，pH 值的改變對BANPs 粒徑影響較小。加入AHLL 后，BANPs的電位值略有下降，推測BRP 與AHLL 間存在一定的靜電相互作用[21]。

圖4 不同pH 值條件下BRP、BANPs 的粒徑及電位變化Fig.4 Particle size and potential changes of BRP and BANPs under different pH conditions

2.4.2 熒光與紫外-可見光譜分析

BRP 及BANPs 的熒光發(fā)射光譜如圖5a 所示。色氨酸和酪氨酸是蛋白質(zhì)的主要內(nèi)源熒光基團[22]。激發(fā)波長為285 nm 時，BRP 的最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在416 nm 處。加入AHLL 后，BANPs 的熒光強度顯著下降，并隨著AHLL 濃度增加，熒光強度逐漸降低，發(fā)生了熒光淬滅現(xiàn)象。推測在BANPs 的形成過程中，AHLL的引入可能導致BRP疏水核中色氨酸殘基原本的疏水微環(huán)境發(fā)生變化，疏水性降低，極性增強，BRP的固有熒光被淬滅導致體系熒光強度下降，表明疏水相互作用參與了AHLL 與BRP 納米顆粒的形成，BRP的空間結(jié)構(gòu)變得更加伸展。Wang 等[23]也報道了在制備鱈魚蛋白納米顆粒時，隨著姜黃素濃度的增加其熒光強度出現(xiàn)有規(guī)律的降低，表明疏水相互作用在分子間起重要作用。同時，AHLL 與BRP 結(jié)合過程中的靜電相互作用可能也影響了BRP 的分子結(jié)構(gòu)。

圖5 BRP、BANPs 熒光圖譜和紫外-可見光譜圖Fig.5 Fluorescence and UV spectra of BRP and BANPs

檢測了BRP、BANPs 的紫外-可見光譜。如圖5b所示，BRP 的最大吸收峰出現(xiàn)在276 nm 處，是蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的特征吸收峰[24]。添加AHLL 后，形成的納米顆粒的吸收峰強度增加，最大吸收波長從276 nm 增加到293 nm，出現(xiàn)紅移，表明BRP 與AHLL的結(jié)合影響了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，生成了新的復合物，導致蛋白質(zhì)的吸收光譜發(fā)生變化。吸光度的增加和吸收波長的紅移，可能是AHLL 與BRP 間的相互作用使得蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸色氨酸等殘基的位置發(fā)生變化，產(chǎn)生了新的共軛體系，這與熒光光譜的結(jié)果是一致的。

2.4.3 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

為了確定BRP 與AHLL 相互作用前后二級結(jié)構(gòu)的變化，本研究對BRP 和BANPs 的紅外光譜進行了掃描（圖6）。BRP 和BANPs 在3 283 cm-1處存在一個寬頻帶，而3 100～3 500 cm-1范圍的特征吸收峰是由O-H 鍵的強拉伸振動產(chǎn)生的[25]，因此BRP 和BANPs均存在O-H 鍵的拉伸振動。

圖6 BRP、BANPs 紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of BRP and BANPs

蛋白質(zhì)的主要特征吸收帶包括酰胺I 帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺II 帶（1 500～1 600 cm-1）[26]，分別由C=O 的伸縮振動和C-N 的伸縮振動以及N-H 的面內(nèi)彎曲振動產(chǎn)生，酰胺I 帶和酰胺II 帶均與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)密切相關，是由α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲疊加共同作用所產(chǎn)生的吸收帶[27]。如圖6 所示，BRP 的FT-IR 光譜在1 630 cm-1處顯示出一個典型的酰胺I 帶吸收峰，在引入AHLL 形成BANPs 后，此特征吸收峰產(chǎn)生明顯移動，且在1 530 cm-1處觀察到出現(xiàn)了一個新的峰，這表明復合納米顆粒形成時，BRP 和AHLL 的組裝力中存在靜電相互作用[28]。Fan等[29]報道的大豆分離蛋白與巖藻多糖納米顆粒由于靜電相互作用在酰胺I 帶和酰胺II 帶均出現(xiàn)移動。這也驗證了電位測定的結(jié)果。

2.4.4 BANPs 分子間相互作用分析

納米顆粒之間存在不同類型的作用力，可以通過分析濁度、粒徑、電位等參數(shù)的相對變化來評估不同解離溶劑條件下納米顆粒間作用力的變化規(guī)律[30]。圖7為BANPs 在NaCl、SDS 和尿素3 種不同解離溶劑條件下（24 h）的物化參數(shù)變化結(jié)果。加入NaCl 后，BANPs 溶液的濁度值、粒徑顯著增大，電位顯著降低并趨于零，表明靜電相互作用是BANPs 分子間的主要作用力，同樣的，許雪兒等[31]研究的玉米醇溶蛋白納米顆粒在NaCl 的干擾下發(fā)生了電荷屏蔽作用，顆粒絮凝，粒徑電位增大；類似地，SDS 的加入也導致了BANPs 溶液的濁度值、粒徑增大，電位值降低，即疏水相互作用在BANPs 的形成和穩(wěn)定過程中也發(fā)揮了重要作用。以濁度值的變化（ΔT）為例，3 種條件下ΔT依次為NaCl＞SDS＞尿素（靜電相互作用＞疏水相互作用＞氫鍵），此外，粒徑和電位的變化趨勢也支持上述結(jié)果。因此，實驗表明，BANPs 的形成和維持主要受靜電相互作用和疏水相互作用的影響這與熒光和FT-IR 的結(jié)果一致。

圖7 不同解離溶劑對BANPs 溶液濁度、粒徑及電位的影響Fig.7 Effect of different dissociation solvents on turbidity,particle size and potential of BANPs solution

2.5 BANPs 的微觀形貌觀察

通過掃描電鏡觀察到BRP 和BANPs 的微觀結(jié)構(gòu)特征，納米顆粒的結(jié)構(gòu)影響到復合體系的穩(wěn)定，結(jié)果如圖8 所示。BRP 呈現(xiàn)外形較光滑且規(guī)則的球狀顆粒，分布均勻，其粒徑主要集中在150～200 nm 之間，這與動態(tài)光散射測定的粒徑結(jié)果是一致的。BANPs 經(jīng)冷凍干燥后顆粒表面發(fā)生皺縮，呈不規(guī)則形態(tài)，但分布較均勻。相關研究表明，納米顆粒的形態(tài)參數(shù)對其生物學反應及相互作用有一定的影響[32]。

圖8 BRP（左）、BANPs（右）的微觀形貌觀察Fig.8 Microscopic morphology observation of BRP and BANPs

2.6 BANPs 的穩(wěn)定性分析

2.6.1 BANPs 的熱穩(wěn)定性

AHLL 等天然活性物質(zhì)在食品加工過程中或極端的條件下（如高溫等）通常是不穩(wěn)定的[33]。因此，在60、70、80、90、100 ℃下處理60 min，考察了游離AHLL 和BANPs 中AHLL 的穩(wěn)定性。如圖9a 所示，游離AHLL 的降解速率較快，溫度升高到70 ℃時，AHLL降解率急劇上升到57.39%；當溫度達到100 ℃，60 min 后AHLL 僅剩不到25%，75.61%的AHLL 發(fā)生了降解，而此時BANPs 中包埋AHLL 的降解率為46.90%，其穩(wěn)定性提高了28.71 個百分點。Zhang 等[34]測定鐵蛋白包埋ACE 抑制肽的穩(wěn)定性，當溫度為80 ℃時，活性肽降解率為51.34%，相同溫度下，本研究中AHLL 的降解率僅為36.08%，顯著低于Zhang等[34]報道的降解率。在整個溫度測試范圍內(nèi)，BRP 包埋處理后的納米顆粒中AHLL的降解率均顯著低于游離AHLL，這表明基于BRP 的納米載體明顯增強了AHLL 的熱穩(wěn)定性。如圖10a 所示，隨著溫度的升高，BANPs 的粒徑逐漸降低并保持穩(wěn)定，而電位的變化較小。這主要是BRP 由于自組裝通過靜電等相互作用結(jié)合形成了致密的納米顆粒結(jié)構(gòu)和更有效的疏水囊，致密的納米顆粒結(jié)構(gòu)可以通過隔絕溫度與其它水溶性促氧化劑（包括自由基、氧和金屬離子）等作用來保護AHLL 免受降解，穩(wěn)定性提高。

圖9 不同溫度、pH 值對AHLL 降解率的影響Fig.9 Effect of different temperature and pH on the degradation rate of AHLL

圖10 不同溫度、pH 值對BANPs 粒徑及電位的影響Fig.10 Effects of different temperatures and pH on the particle size and zeta potential of BANPs

2.6.2 BANPs 的pH 穩(wěn)定性

負載降壓肽的牛蒡蛋白納米顆粒在不同pH 值下的穩(wěn)定性對其在食品中的應用有很大的影響。以降解率作為不同pH 值下穩(wěn)定性的評價指標，結(jié)果如圖9b所示，隨著pH 值的逐漸增大，游離AHLL 的降解率急劇增加，pH值7.0～8.0時，AHLL降解率均超過50%；而BANPs 中AHLL 降解率的增加速率較為平穩(wěn)，在pH 值5.0～8.0 的范圍內(nèi)，BANPs 中包埋的AHLL 的降解率均顯著低于游離AHLL。結(jié)合圖10b 的結(jié)果，推測這可能是因為該pH 值范圍內(nèi)時BRP 分子攜帶較多的負電荷，可通過靜電相互作用等與AHLL 較緊密地結(jié)合，從而保證了較寬pH 值范圍內(nèi)的納米顆粒中活性肽的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究表明，利用0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液提取牛蒡根蛋白，并利用BRP 構(gòu)建了負載AHLL 的復合納米顆粒遞送體系，發(fā)現(xiàn)提取的牛蒡根蛋白成分固定無雜蛋白質(zhì)干擾，與AHLL 通過靜電相互作用和疏水相互作用形成穩(wěn)定的復合納米顆粒。在BRP 為8 mg/mL，AHLL 為200 μg/mL 時，載體蛋白BRP 對AHLL 的包封率高達77.28%，載藥量提高到23.97%，BANPs 顆粒分布比較均勻且粒徑較小。隨著溫度升高和pH 值增大，BANPs 中AHLL 降解率均顯著低于游離AHLL，粒徑電位變化較小并趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定性顯著提高。因此，本文報道的牛蒡根蛋白可用于小分子生物活性肽的包封與保護，有望用于活性肽的靶向遞送與可控釋放，為未來我們利用蛋白納米載體封裝小分子疏水活性肽提供理論基礎。