4 株金黃色葡萄球菌噬菌體的分離鑒定、生物學(xué)特性及其基因組分析

李旋，葉軍航，趙尹蕾，吉婷婷，李雅潔，周文淵,2*

（1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州 225127）（2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于水、空氣、人和動物的皮膚等環(huán)境中[1]。它可以引起傷口感染，誘發(fā)各種炎癥，甚至污染食品和食用農(nóng)產(chǎn)品，導(dǎo)致食物中毒事件的發(fā)生[2]。使用抗生素（如氨芐西林、卡那霉素和萬古霉素等）來預(yù)防和控制SA是最直接有效的方法，但是過度使用抗生素會使金葡菌產(chǎn)生耐藥菌株，對人類和動物健康造成危害，甚至對生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成威脅[3]。因此，尋找可代替抗生素治療的生物制劑非常重要。

噬菌體是細(xì)菌的病毒，能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀馑拗骷?xì)菌，作用機(jī)理明確[4]。噬菌體對宿主細(xì)菌具有專一性能夠直接攻擊并殺害相應(yīng)致病菌[5]，并且具有易于篩選、數(shù)量龐大[6]、成本低廉的優(yōu)點。最重要的是用于人體和動物較為安全，不會導(dǎo)致菌群出現(xiàn)耐藥性，甚至可以殺死耐藥菌[7]，適合用于食品中多重耐藥SA的控制。目前，一些基于噬菌體的產(chǎn)品已經(jīng)在市場上上市，如ListexTMP100 和ListShieldTM[8]，它們的安全性得到美國食品和藥物管理局（FDA）的認(rèn)可，并被美國農(nóng)業(yè)部（USDA）批準(zhǔn)可以作為抗菌加工助劑，用于食品抗菌。噬菌體根據(jù)是否能進(jìn)行溶原途徑的生活史分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，研究表明烈性噬菌體和溫和噬菌體均具有控制SA生長的潛力。Ngassam-Tchamba 等[9]分離的三株烈性噬菌體（Romulus、Remus 和ISP）在體外對與牛乳腺炎相關(guān)的SA具有良好裂解活性。Zhang 等[10]分離的溫和噬菌體JS02 對SA表現(xiàn)出較強的清除能力，并且能抑制SA生物膜的形成。Chang 等[11]將溫和噬菌體SA13 隨機(jī)缺失突變后的突變噬菌體SA13m 應(yīng)用于牛奶中抑制SA，結(jié)果顯示金葡菌在冰箱溫度（4 ℃）和室溫（25 ℃）下均降低至不可檢測的水平。Al-Anany 等[12]研究發(fā)現(xiàn)溫和噬菌體HK97 與亞抑菌濃度的抗生素環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，對SA具有良好清除效果。然而，尚未有研究系統(tǒng)性比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成上的差異。

本研究分離出4 株SA的噬菌體（包括2 株烈性噬菌體和2 株溫和噬菌體），利用透射電鏡觀察其形態(tài)特征差異，隨后對所分離噬菌體的效價、宿主譜、耐酸堿能力、熱穩(wěn)定性、一步生長曲線、最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）值等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，最后通過全基因組測序比較分析烈性噬菌體和溫和噬菌體基因組特征。本文通過比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成的差異，為篩選更加高效的噬菌體作為生物抑菌劑，用于控制食品加工過程中金葡菌污染奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品來源

47 株SA菌株YZUsa1-YZUsa47 分離自江蘇省內(nèi)養(yǎng)豬場；ATCC 29213 購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；3株SA菌株MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744和MRSA WZ153 來自揚州大學(xué)生物危害因素防控重點實驗室；霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）Eh-YZU05 分離自豬糞便，單核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 1911、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）CICC 21513、大腸桿菌（Escherichiacoli）CICC 10664 及最小弧菌（Vibrio mimicus）CICC 21613 購自CICC 菌種保藏中心。

1.2 主要試劑和儀器

盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI），購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；7.5%氯化鈉肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；絲裂霉素C購自上海麥克林生物公司。

SW-CJ-1F 型無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備制造有限公司；JEM-1200EX 型透射電鏡，日本電子株式會社；HC-2066 型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；H/T16MM 型冷凍離心機(jī)，北京博勱儀器有限公司；BDY-2012 型恒溫?fù)u床，上海百典儀器設(shè)備有限公司。

1.3 噬菌體分離

1.3.1 烈性噬菌體分離

利用SA菌株ATCC 29213 作為宿主進(jìn)行SA噬菌體分離。采集揚州市內(nèi)污水樣品500 mL，污水樣品的前處理過程以及噬菌體分離純化過程參照Chang 等[11]的方法進(jìn)行。用8 000 r/min 的高速離心機(jī)離心10 min以除去雜質(zhì)，之后使用0.45 μm 和0.22 μm 濾器過濾除菌后，得到噬菌體原液。將3 mL 2×的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)液和100 μL 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SA菌株ATCC29213加入處理后的污水中，在37 ℃的溫度下?lián)u床培養(yǎng)8 h以上。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物經(jīng)過離心、過濾得到原液，并保存在4 ℃的冰箱。

1.3.2 溫和噬菌體分離

挑取純化后的金葡菌YZUsa13 和YZUsa14 單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中[13]，于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌液濃度為2×107CFU/mL。分別在LB 培養(yǎng)基中加入167 μL 濃度為0.3 mmol/L 的絲裂霉素C 和菌液，置于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6 h，每隔1 h 取1 mL 通過0.22 μm 濾膜后，與菌液各100 μL 加入10 mL 離心管中，利用層平板法測定噬菌體滴度。

1.4 透射電鏡觀察

噬菌體的形態(tài)學(xué)觀察參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，并略作修改。先將噬菌體液進(jìn)行濃縮，然后在200 目碳涂層銅網(wǎng)上滴加20 μL 的濃縮后的噬菌體（1010PFU/mL）懸浮液，充分吸附約15 min 后取出銅網(wǎng)使其自然干燥2～3 min。然后用2%（m/V）的磷鎢酸鈉（pH 值為7.6）溶液染色2 min 后，使用透射電鏡（TEM，Hitachi H600A）觀察噬菌體形態(tài)。

1.5 噬菌體宿主譜的測定

噬菌體的宿主譜采用空斑法[11]進(jìn)行測定，通過雙層平板法將100 μL 菌液（108CFU/mL）和5 mL 的LB 半固體培養(yǎng)基混勻后倒在LB 固體培養(yǎng)基上，自然干燥后取10 μL 噬菌體培養(yǎng)液（MOI=100）滴在表面，倒放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每組實驗平行重復(fù)3 次。

1.6 生物學(xué)特性測定

1.6.1 最佳感染復(fù)數(shù)的測定

最佳MOI 的測定方法參照文獻(xiàn)[13]的測定方法，略有改動。將菌液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL，按照噬菌體和宿主菌的不同比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 和100）將噬菌體和宿主菌混勻后37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 后，于8 000 r/min 條件下離心10 min，過濾并測定效價，效價最高的比例即為最佳MOI。每組做三次平行實驗。

1.6.2 一步生長曲線（One-stepGrowth）的測定

一步生長曲線的測定方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測定，略有改動。將噬菌體和108CFU/mL 宿主菌按照最佳MOI 混合，37 ℃靜置培養(yǎng)7 min 后8 000 r/min 離心10 min，棄上清后加入5 mL 的LB 培養(yǎng)基重懸沉淀，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于不同時間點（0、5、10、15、30、45、60、75 和90 min）或（0、10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、135、150、165、180、200、220 和240 min）取100 μL 梯度稀釋后與宿主菌各100 μL 倒雙層平板。每組實驗平行重復(fù)3 次。

1.6.3 耐酸堿性實驗

噬菌體的耐酸堿性實驗參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行測定，分別取1 mL 噬菌體于若干10 mL 的離心管中，分別加入1 mL pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的SM 緩沖液中，37 ℃下作用2 h 后測定效價。

1.6.4 熱穩(wěn)定性實驗

噬菌體熱穩(wěn)定性實驗參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測定，取1 mL 效價約為108PFU/mL 的噬菌體于試管中并放在40、50、60、70 ℃的恒溫金屬浴中依次作用20、40和60 min 后測定效價。

1.7 基因組測序及分析

對噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的全基因組序列進(jìn)行測定和分析。噬菌體基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[14]中所述方法。分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Qubit ?dsDNA HS 分析試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）對噬菌體基因組DNA 進(jìn)行定性定量。

通過Illumina HiSeq 平臺（Illumina，SanDiego，CA，USA）對噬菌體基因組序列進(jìn)行測定，插入片段大小為500 bp。使用FGENESB（http://www.softberry.com）、GeneMarkS[15]和Glimmer v3.02[16]軟件對開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）進(jìn)行預(yù)測。通過InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和BLASTp[17]對ORFs 進(jìn)行注釋。將基因組信息上傳至 NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的GenBank 編號分別為OP432864、MW864252、ON229621 和ON220160。

1.8 噬菌體系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

截至2021 年4 月，GenBank 數(shù)據(jù)庫中記錄192個金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過軟件kSNP3 v3.0 對噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13、SAPYZU-SapM14和上述192 個SA噬菌體基因組序列的單核苷酸多態(tài)性（Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs）進(jìn)行解析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[18]。以噬菌體ErwiniaphagephiEa2809 作為外組噬菌體，并使用iTOL 進(jìn)行注釋[19]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD，n=3），每組實驗重復(fù)3 次，取平均值。實驗數(shù)據(jù)中點線圖、柱狀圖由Origin 2023 軟件繪制完成。

2 結(jié)果與討論

如圖1，本研究以金葡菌ATCC 29213 為宿主菌，通過雙層平板法，從揚州市內(nèi)污水樣品中分離得2 株SA烈性噬菌體，分別命名為 SAPYZU-04 和SAPYZU-15。利用絲裂霉素C 從已分離純化的金葡菌YZUsa13 和YZUsa14 中誘導(dǎo)出2 株溫和噬菌體，分別命名為SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14。4 株噬菌體的噬菌斑均呈圓形透亮、邊界清晰，直徑為0.8～1.5 mm。

圖1 噬菌斑形態(tài)圖Fig.1 Morphology of phage plaque

2.1 噬菌體的電鏡形態(tài)

通過透射電鏡觀察噬菌體微觀形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均有一個呈正多面體結(jié)構(gòu)頭部和一個可伸縮的尾巴，頭部長度分別約為64.96 nm 和88.68 nm，尾部長度約為165.03 nm 和 176.89 nm 。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均有一個呈橢球形頭部和一個不可伸縮的長尾，頭部長度分別約為長直徑：84.26、71.82 nm 和短直徑：44.73、47.71 nm，尾部長度約為254.43 nm 和266.17 nm。結(jié)果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的顯微形態(tài)與黨瑞瑩等[20]、張志宏等[21]和涂尊方等[22]的研究一致；而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的電鏡形態(tài)與Zhang 等[10]、Yang 等[23]和Feng 等[24]的研究結(jié)果一致。

圖2 噬菌體的形態(tài)Fig.2 Morphology of phage

2.2 裂解譜

應(yīng)用空斑法測試噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14對51 株金葡菌菌株YZUsa1-YZUsa47、ATCC 29213、MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744、MRSA WZ153 和5 株其他菌屬菌株的裂解特性，結(jié)果如表1 所示。烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均能裂解51 株金葡菌，裂解率為100%，并且噬菌斑較透亮，+++數(shù)量均達(dá)到56%；而噬菌體SAPYZU-SapM13能裂解48 株SA菌株，裂解率為94%，噬菌體SAPYZU-SapM14能裂解44 株SA菌株，裂解率為86%。然而，這4 株噬菌體對于單核增生性李斯特菌ATCC 1911、腸炎沙門氏菌CICC 21513、大腸桿菌CICC 10664、最小弧菌CICC21613以及霍氏腸桿菌Eh-YZU05均沒有裂解能力。4 株噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均比王一帆等[25]（1/11，9%）、Yang 等[23]（13/30，43%）、黨瑞瑩等[20]（23/63，36%）、Feng 等[24]（61/138，44%）和張志宏等[21]（10/37，27%）分離的噬菌體的裂解譜更寬。噬菌體較寬的宿主譜是其用于生物防治的重要特性[26]，因此，噬菌體裂解譜的測定對于選擇應(yīng)用于食品中的生物抑菌劑至關(guān)重要。此外，溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在進(jìn)行宿主譜測定實驗時，對他們的溶原菌仍有裂解作用，該結(jié)果與Zhang 等[10]和Feng 等[24]的研究一致。研究表明一些噬菌體裂解宿主菌是一種“從外裂解”的過程，這個過程是高濃度噬菌體吸附宿主菌后快速破壞宿主細(xì)菌細(xì)胞[27]。因此，本研究的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14進(jìn)行宿主譜測定時濃度遠(yuǎn)大于宿主細(xì)菌細(xì)胞是其顯示裂解特性的原因之一。

表1 噬菌體的宿主譜Table 1 Host spectrum of phage

2.3 最佳MOI

用不同 MOI 比例的噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14感染宿主菌，培養(yǎng)8 h 后測定噬菌體效價。如圖3 所示，噬菌體SAPYZU-04 在MOI 為0.01（P＜0.05）時，效價最高（約為109PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-15在MOI 為0.000 1 時，效價最高（約為1010PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-SapM13在MOI 為0.1 時，效價最高（約為1010PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-SapM14在MOI為0.01（P＜0.01）時，效價最高（約為109PFU/mL）。因此，噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的最佳MOI 分別為0.01、0.000 1、0.1 和0.01。

圖3 噬菌體最佳MOI 測定結(jié)果Fig.3 Results of determination of the optimal complex number of phage infection

圖4 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of phages

2.4 噬菌體的熱穩(wěn)定性

如圖 4 所示，金黃色葡萄球菌噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在40 ℃和50 ℃條件下作用1 h效價基本不變，效價分別為5.63×107、1.34×109、1.12×109和1.27×1010PFU/mL；在60 ℃條件下隨著作用時間越長，噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14效價越低。分別在70 ℃孵育40、20和20 min時，噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15 和SAPYZU-SapM14完全失活，而噬菌體SAPYZU-SapM13在70 ℃孵育60 min 時完全失活。結(jié)果表明4 株噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14對高溫的耐受能力均強于Kraushaar 等[28]報道的金葡菌噬菌體。

2.5 噬菌體的耐酸堿能力

如圖5 所示，噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在酸度較高的環(huán)境（pH 值為2）中會完全失活；在pH 值為3～12 時活性較穩(wěn)定。在pH 值為5 時，噬菌體SAPYZU-04 的效價最高為1.31×107PFU/mL（P＜0.05）；pH 值為9時，噬菌體 SAPYZU-15 的效價最高為8.94×106PFU/mL；而噬菌體 SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在pH 值為8 時效價最高，分別為9.18×107PFU/mL 和9.52×107PFU/mL。結(jié)果表明噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在pH值為3～12范圍內(nèi)均保持良好活性，其對酸堿的耐受能力均強于盧瑋等[29]分離的金葡菌噬菌體（pH 值為6～11 范圍內(nèi)穩(wěn)定）。

圖5 噬菌體的耐酸堿能力Fig.5 Resistance of phages to acidity and alkalinity

2.6 一步生長曲線

將噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14分別與宿主菌混合后培養(yǎng)，得到噬菌體的一步生長曲線。如圖6 所示，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 侵染宿主的10 min 內(nèi)效價無明顯變化，表明它們的潛伏期均為10 min。在10～150 min 內(nèi)，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 的效價一直保持升高趨勢，隨后趨于穩(wěn)定，表明它們的裂解期均約為140 min，裂解量分別約為每個細(xì)胞210 和322 PFU。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的潛伏期較長，分別約為15 和30 min；裂解期較短，分別約為30 和45 min，裂解量分別為每個細(xì)胞52 和49 PFU。上述結(jié)果顯示，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15的裂解量均高于Gutierrez 等[30]分離的金葡菌烈性噬菌體（每個細(xì)胞15 和25 PFU）。溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的裂解量比Feng等[24]分離的溫和噬菌體JD419 裂解量（每個細(xì)胞33 PFU）更高。潛伏期和爆發(fā)量是表示噬菌體裂解能力的重要生物學(xué)特性，具有較短潛伏期和較大爆發(fā)量的噬菌體更適合作為生物防治劑[31]。

圖6 噬菌體的一步生長曲線Fig.6 one step growth curve of phages

2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹

全基因組序列分析結(jié)果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04 和 SAPYZU-15 基因組全長分別為140 584 bp 和 135 178 bp，而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組全長分別為44 922 bp 和44 232 bp。其中噬菌體SAPYZU-04的GC 含量為31.48%，預(yù)測到188 個ORFs；噬菌體SAPYZU-15 的GC 含量為29.90%，預(yù)測到187 個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM13的GC 含量為33.98%，包含71 個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM14的GC 含量為33.89%，包括73 個ORFs。

截至2021 年4 月，GenBank 數(shù)據(jù)庫中記錄192個金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過這些金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，解析4 株噬菌體和其他金黃色葡萄球菌噬菌體之間的關(guān)系。此樹形圖（圖7）劃分了3 個主要的遺傳譜系（I-Ⅲ）。聚類分析結(jié)果表明，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 與Hellelleviridae 科的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅱ），且SAPYZU-04 和SAPYZU-15與噬菌體qdsa001基因組核苷酸序列最相似，相似性＞99.0%；溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與Azeredovirinae 亞科Dubowvirus屬的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅲ），且SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與TEM126 和SAP26 的基因組核苷酸序列一致性＞95%。因此，根據(jù) ICTV2022 年最新的分類標(biāo)準(zhǔn)[32]，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 屬于Hellelleviridae 科；而 SAPYZU-SapM13和 SAPYZU-SapM14屬 于Azeredovirinae 亞科Dubowvirus屬。

圖7 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.7 Phylogenetic analysis

2.8 全基因組序列分析

對4 株噬菌體基因組攜帶基因的蛋白功能進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖8 所示。噬菌體SAPYZU-04 的基因組編碼32 個DNA 代謝相關(guān)基因，包括核酸內(nèi)切酶基因（orf38）、DNA 解旋酶基因（orf115）和DNA 聚合酶Ⅰ基因（orf144）等；噬菌體SAPYZU-15 的基因組包含多個DNA 代謝基因，其中包括3 個DNA 合成相關(guān)基因（orf1、orf3和orf5）、2 個DNA 聚合酶Ⅰ（orf10、orf11）和 DNA 綁定蛋白（orf82）；噬菌體SAPYZU-SapM13的基因組編碼13 個與噬菌體DNA復(fù)制、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，包括核酸外切酶基因（orf7）、轉(zhuǎn)錄因子（orf9）、DNA 復(fù)制基因（orf25）和DNA 解旋酶（orf45）等；而噬菌體SAPYZU-SapM14編碼11 個與噬菌體DNA 代謝相關(guān)的基因，包括轉(zhuǎn)錄因子（orf11）、DNA 綁定蛋白（orf24）、DNA 解旋酶（orf28）和核酸內(nèi)切酶（orf51）等。其中SAPYZU-15基因組編碼豐富的DNA 合成基因加速了噬菌體大分子的合成。SAPYZU-04 的基因組編碼3 個DNA 組裝基因（orf66、orf68和orf69），SAPYZU-15 的基因組編碼1 個DNA 組裝基因（orf117），SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均包含2 個DNA 包裝基因（分別為orf48、orf49、orf52和orf53）。其中SAPYZU-15編碼的DNA 包裝基因與噬菌體LSA2308[33]的氨基酸序列具有95.9%的相似性；LSA2308 的爆發(fā)量約為407 PFU/cell。DNA 包裝蛋白可以有效地將DNA 泵入尾部噬菌體原衣殼中，加速噬菌體的組裝[34]。噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 的基因組中分別包含3 個和1 個尾部蛋白基因（分別為orf108、orf110、orf158和orf142），噬菌體SAPYZU-SapM13編碼5 個尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾管蛋白基因（orf57）和主要尾部蛋白基因（orf58和orf62）等；而SAPYZU-SapM14編碼6 個尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾部蛋白基因（orf57、orf61、orf62）等。這些獨特的尾部蛋白基因可能是此4 株噬菌體具有廣泛的裂解譜的原因。其中SapYZU-15含有的尾蛋白基因與噬菌體KSAP11[35]的基因組氨基酸序列有95.90%的相似性。KSAP11 具有廣泛的裂解譜，對30 株SA菌株（包括MSSA 和MRSA 菌株）具有裂解活性。噬菌體SAPYZU-04 包含1 個穿孔素基因（orf53）和3 個裂解酶基因（orf52、orf100和orf102），SAPYZU-15 包含1 個穿孔素基因（orf107）、5 個裂解酶基因（orf103、orf105、orf149、orf153和orf155）；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組均只包含1 個穿孔素基因（分別為orf70和orf2）和1 個裂解酶基因（分別為orf71和orf3）。穿孔素基因在裂解過程中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜去極化，調(diào)節(jié)裂解時間[36]。其中SAPYZU-15 基因組中有2 個裂解酶基因（orf103和orf155）與MR003 具有較高的氨基酸序列相似性（97.90%和99.00%），MR003[37]是高效的SA烈性噬菌體。因此，在這些基因的協(xié)同作用下，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 潛伏期更短，裂解量更高。此外，溫和噬菌體基因組中的整合酶基因和CI阻遏蛋白是決定其生命周期的重要因素，整合酶基因通過催化兩個DNA 分子之間重組使得噬菌體在宿主染色體中進(jìn)行基因的整合和切除[38]，并且溫和噬菌體通過CI 阻遏蛋白阻斷裂解基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而進(jìn)入溶原周期；而抗阻遏蛋白控制噬菌體在侵染時進(jìn)入裂解周期[39]。本文的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14基因組編碼特異性整合酶證明它們具有溶原性，均預(yù)測到抗阻遏蛋白，但是未預(yù)測到CI阻遏蛋白和噬菌體抗性基因，可能導(dǎo)致溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在宿主譜測定時易進(jìn)入裂解周期，上述結(jié)果與Tian 等[13]的研究結(jié)果一致。

圖8 全基因組分析Fig.8 Whole genome analysis

3 結(jié)論

金黃色葡萄球菌嚴(yán)重威脅食品安全，同時也是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題之一。因此，迫切需要開發(fā)安全可靠的生物防治方法，以提高公共衛(wèi)生水平，確保消費者安全。本研究分離的烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 效價均達(dá)到109PFU/mL，而且具有較寬的裂解譜，兩株噬菌體對51 株SA 菌株的裂解率均高達(dá)100%；在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)、pH值在3～12 范圍內(nèi)均保持良好活性；潛伏期較短、裂解能力強，裂解量分別高達(dá)每個細(xì)胞210 和322 PFU。全基因組序列分析結(jié)果顯示 SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均包含多種DNA 代謝基因、多個裂解酶基因、獨特的DNA 包裝基因及尾部蛋白基因。因此，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 是一種更合適、更有前景的生物防治選擇，有望應(yīng)用于控制食品中金葡菌的污染。