基于體外發(fā)酵研究膳食纖維復(fù)合體對老年人腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

宋瑤，譚凱燕，黃傲，馬金克，李銳定，鄭文軒，時鳳翠，于曉涵，李全陽*

（1.廣西大學輕工與食品學院，廣西南寧 530004）（2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，廣西南寧 530200）（3.廣西民族大學相思湖學院管理學院，廣西南寧 530225）

隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展與人口老齡化進程加速，如何活得更加健康長壽得到了人們越來越多的關(guān)注與研究。近十年，本團隊對廣西著名長壽地區(qū)老人開展了多次膳食方面調(diào)查，并對其飲食、代謝物特征和腸道菌群等進行研究分析，構(gòu)建了廣西長壽飲食模式。該模式以膳食纖維多糖為主，具有高膳食纖維、高維生素A、低能量、低脂肪、低蛋白質(zhì)、低膽固醇的特點[1,2]。在廣西長壽飲食模式中，提供膳食纖維的食物可分為水果、蔬菜與主食三類，根據(jù)團隊前期調(diào)查研究，代表性的水果為臍橙和香蕉，代表性的蔬菜為南瓜苗、空心菜、茶樹菇、苦荬菜和紅薯葉[3]，代表性主食為玉米、紅薯、芋頭和火麻[4]。膳食纖維與腸道菌群密切相關(guān)，并能影響腸道菌群組成比例及數(shù)量，進而對人體健康產(chǎn)生影響[5-9]。目前，對膳食纖維的研究多集中在單一膳食纖維方面，如低聚果糖[10]、低聚半乳糖[11]、山楂膳食纖維[12]等。但是對于多種膳食纖維復(fù)合的研究相對較少，在一項高脂小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)合不溶性膳食纖維對脂類代謝與合成相關(guān)的菌屬產(chǎn)生了顯著的影響[13]，Wang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合多糖膳食纖維增加了年輕大鼠乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對豐度，降低了球菌屬的相對豐度，對維持腸道微生態(tài)健康起到了積極作用。本團隊前期對衰老小鼠的研究發(fā)現(xiàn)廣西長壽飲食模式介導(dǎo)的膳食纖維復(fù)合體具有提高機體抗氧化水平、降低炎癥水平和延緩衰老的作用[15]。除此之外，暫未發(fā)現(xiàn)在體外條件下研究膳食纖維復(fù)合體對人體腸道菌群及其代謝物的研究。

研究膳食纖維對腸道菌群作用效果的方法目前有三種，分別是體外發(fā)酵實驗、動物實驗和志愿者實驗。相比于動物實驗成本高與志愿者實驗的依從性不一的問題，體外發(fā)酵方法具有高可控性且成本低，能夠更好的設(shè)置初始標準條件、確定發(fā)酵時間，也容易調(diào)控變量，精準化研究干預(yù)效果。利用體外發(fā)酵模型可以研究飲食對腸道微生物群的影響，深入了解腸道微生物群介導(dǎo)的發(fā)酵過程[16]，基于體外發(fā)酵方法的膳食研究可用于預(yù)測任何膳食物質(zhì)對健康的有益影響，或抗生素和外源性藥物的不良影響[17]。

本研究在團隊前期工作基礎(chǔ)上，擬從體外發(fā)酵角度出發(fā)，探究膳食纖維干預(yù)下老年人體志愿者糞便典型菌群及糞便菌群代謝物的變化，進一步分析潛在代謝通路及對人體有益的影響，評估廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對老年人體腸道菌群的改善作用，以期為豐富發(fā)展膳食纖維通過改善老年人體腸道菌群，促進身體健康的理論提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹菇、珍珠黃玉米、芋頭、紅薯、火麻，廣西巴馬瑤族自治縣坡月村農(nóng)貿(mào)市場；化學試劑，市售分析純；氘代重水（純度≥99.9%），青島麥可瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UP-FG-1 臺式冷凍干燥機（多歧管壓蓋型），上海優(yōu)普實業(yè)有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；T&J-Mini pod 500 mL×4 型腸道微生態(tài)恒化器模擬系統(tǒng)，迪必爾生物工程（上海）有限公司；905GP 型超低溫冰箱，賽默飛世爾科技有限公司；Light Cycler 96 實時熒光定量PCR 儀，羅氏醫(yī)學儀器公司；JBruker Avance 500 MHz 核磁共振光譜儀，德國Bruker 光譜儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膳食纖維樣品的制備與分組

依照團隊前期的提取方法制備膳食纖維。將香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹菇、珍珠黃玉米、芋頭、紅薯、火麻11 種食材在65 ℃干燥后粉粹，過60 目篩備用。依據(jù)表1 提取條件，稱取過篩后的果蔬原料適量，以對應(yīng)的固液比加入蒸餾水，混勻后于對應(yīng)溫度下進行熱水浴提取對應(yīng)的時間，提取結(jié)束后，冷卻至室溫，于10 000 r/min 離心15 min，沉淀物真空冷凍干燥得不溶性膳食纖維；上清液65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維[18]。依據(jù)表2 提取條件，稱取過篩后的珍珠黃玉米、芋頭和紅薯適量，加入蒸餾水浸泡后過200 目篩，得到濾液和濾渣1，濾液進行離心，得到上清液1 和濾渣2，濾渣1 在對應(yīng)酶添加量和液固比條件下用淀粉酶水解，然后100 ℃水浴滅酶10 min，然后調(diào)節(jié)pH 值至對應(yīng)條件，離心，得到上清液2 和沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥得到不溶性膳食纖維；上清液1 和上清液2 進行合并，65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維。稱取過篩后的火麻適量，在蛋白酶添加量為3 000 U/g，液固比10:1 mL/g條件下用蛋白酶水解，然后100 ℃水浴滅酶10 min，然后調(diào)節(jié)pH 值至9.0，進行離心，得到上清液和沉淀物，沉淀物進行洗滌干燥得到不溶性膳食纖維，上清液65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4倍體積無水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維[4]。

表1 果蔬膳食纖維的提取條件Table 1 Extraction conditions of dietary fiber from fruits and vegetables

表2 主食膳食纖維的提取條件Table 2 Extraction conditions of dietary fiber from staple foods

將提取的膳食纖維按照空心菜:南瓜苗:臍橙:苦荬菜:茶樹菇:紅薯葉:火麻:芋頭:香蕉:紅薯:玉米=1.00:1.22:2.26:2.36:3.03:3.63:4.82:5.66:7.75:7.69:29.86的質(zhì)量比混合，膳食纖維共混物與蒸餾水按1:9 的質(zhì)量比在100 r/min 下攪拌60 min，將樣品冷凍干燥得DFC。添加質(zhì)量體積分數(shù)為0.5%、1%、2%、4% DFC的女性實驗組分別用DFCF1、DFCF2、DFCF3、DFCF4表示，男性實驗組分別用DFCM1、DFCM2、DFCM3、DFCM4 表示，沒有添加DFC 的女性和男性對照組用DFCFC、DFCMC 表示。

1.3.2 志愿者腸道菌群樣品的準備

從廣西南寧市招募10 名65～75 歲志愿者，其中男女性別各半。采用如下條件篩選志愿者：身體健康狀況良好，不抽煙、不飲酒、無糖尿病、腎病、肝病和其他腸道類疾病，并且半年內(nèi)沒有服用過抗生素，3周內(nèi)沒有服用益生菌、益生元或瀉藥。樣本采集工作前，對篩選后的志愿者耐心培訓(xùn)指導(dǎo)，于早上收集新鮮的人體糞便樣品，收集好后立即放入預(yù)先備好的含冰袋的保溫盒中，盡快轉(zhuǎn)移至實驗室進行無菌分裝，冷卻后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保藏。

開始實驗前，以相同比例取5 位女性志愿者糞便樣品25 g（每人5 g），于滅菌后的225 mL PBS 溶液中，制成250 g 混合液并震蕩混勻。室溫8 000 r/min離心1 min 以去除大糞便顆粒，得到的菌懸液用于后續(xù)接種。男性組處理方法同女性組。

1.3.3 體外模擬發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基參考王閃閃[19]的方法制備。取5 個發(fā)酵罐并作標記，分別加入配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基450 mL和0.125 g 厭氧指示劑刃天青，前四組分別加入質(zhì)量體積百分比（g/mL）為0.5%、1%、2%、4%的DFC，不加DFC 組作為對照組。將發(fā)酵系統(tǒng)各部件組裝包扎后放入高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

將滅菌的發(fā)酵罐放入37 ℃恒溫水浴鍋中，設(shè)置磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為150 r/min，連接pH 電極和進氣管，通入氮氣維持厭氧的環(huán)境。待恒溫水浴鍋的溫度穩(wěn)定時向發(fā)酵罐中注射入50 mL 的新鮮懸菌液并調(diào)節(jié)pH值為6.2，保持樣品體外發(fā)酵48 h。每組做3 個平行試驗，并在48 h 定點收集樣品于樣品管中，收集后立即儲存在-80 ℃超低溫冰箱中用于后續(xù)分析。

1.3.4 發(fā)酵液樣品中DNA 的提取與檢測

發(fā)酵液中DNA的提取按照腸道微生物DNA試劑盒提取。提取完成后使用酶標儀檢測DNA 濃度及純度。用無菌超純水洗滌3 次微孔板，吸取2 μL 洗脫緩沖液對微孔板進行調(diào)零，調(diào)零后用無菌紙吸干洗脫緩沖液，將加入2 μL DNA 樣品加入樣品孔進行上機檢測，做3 組平行實驗。結(jié)果OD260/OD280值應(yīng)在1.80～2.0之間為宜。檢驗合格的DNA 樣品用作RT-qPCR 反應(yīng)的模板。

1.3.5 發(fā)酵液所提DNA qPCR 反應(yīng)

本實驗采用腸道總菌群、大腸桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬共5 種腸道菌群引物，引物序列如表3。

表3 5 種腸道菌群的引物序列Table 3 Primer sequences for 5 intestinal microbiota

按照表4 所示用量用模板、引物、RNase-Free H2O和2×SYBR Green qPCR Mix 試劑配置qPCR 反應(yīng)體系。配好后短暫離心，按照表5 設(shè)置qPCR 反應(yīng)程序設(shè)置LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀，上機檢測。

表4 發(fā)酵液提取物中DNA 的qPCR 反應(yīng)體系Table 4 qPCR reaction system of DNA in fermentation liquid extracts

表5 發(fā)酵液提取物中DNA 的qPCR 反應(yīng)程序Table 5 qPCR procedure for DNA in fermentation liquid extracts

本實驗采用的方法是相對定量法，計算公式如下：

式中：

Rx——相對表達量；

A1——待測目的基因的Ct值；

A2——待測內(nèi)參基因的Ct均值；

A3——對照目的基因的Ct均值；

A4——對照內(nèi)參基因的Ct均值；

Ct——擴增產(chǎn)物熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)（次）。

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物核磁共振檢測樣本的制備

取出存儲于-80 ℃冰箱中的發(fā)酵液樣品，在25 ℃室溫下解凍30 min，擦干離心管表面的水，渦旋30 s，準確吸取1 mL 的樣品于新的2 mL 無菌離心管中，加入500 μL 含tmsp 重水的磷酸鹽緩沖溶液（含重水比例10%，K2HPO4/NaH2PO4，pH 值7.4，質(zhì)量分數(shù)0.9%NaCl 的100 mmol/L 磷酸鹽），渦旋15 s，用液氮反復(fù)冷凍-解凍三次。將混合物均質(zhì)60 s，然后在4 ℃、8 000 r/min 下離心6 min。吸取上清液于2 mL 無菌離心管中，剩余沉淀物加入500 μL 含tmsp 重水的磷酸鹽緩沖溶液，渦旋15 s，用液氮反復(fù)冷凍-解凍三次。將混合物均質(zhì)60 s，然后在4 ℃、8 000 r/min 下離心6 min，合并2 次的上清液在4 ℃，12 000 r/min 條件下離心10 min，用移液槍準確吸取550 μL 的上清液加入到5 mm NMR 管中進行上機檢測。

1.3.7 發(fā)酵產(chǎn)物樣品的1H NMR 的測定方法

將NMR 管中的發(fā)酵產(chǎn)物樣品在298 K、1H 共振頻率為500.13 MHz的核磁共振光譜儀進行NMR圖譜檢測。使用標準Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列[RD-90°-(t-180°-t)n-ACQ]采集一維光譜，同時采用預(yù)飽和法抑制水峰。采集參數(shù)為：掃描次數(shù)NS=64，采樣點數(shù)TD=65 536，譜寬SWH=10 000 Hz，馳豫延遲RD=2 s。

1.3.8 發(fā)酵產(chǎn)物樣品1H NMR 檢測圖譜的處理與分析

使用MestReNova 14.1 軟件（Mestrelab Research S.L）對1H 核磁共振波譜進行相位和基線校正，以tmsp的化學位移0 ppm 進行定標，對化學位移區(qū)間δ0.00～9.00 ppm 的區(qū)域以δ0.001 ppm 進行分段積分，去除水共振區(qū)δ4.64～5.10 ppm 消處水信號的影響，將積分值導(dǎo)出為Excel 表格進行數(shù)據(jù)處理。

使用SIMCA-P 14.1（Umetrics，Sweden）軟件進行多元統(tǒng)計分析。采用主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）判定組間發(fā)酵液樣品總體分布情況，使用正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least-Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA）確定變量投影重要度（Variable Importance for Projection，VIP），采用VIP＞1、P＜0.05 且結(jié)合火山圖（FC＞2）的條件篩選出差異代謝物，再用生物信息學方法進一步揭示具有統(tǒng)計意義的差異代謝物的靶向代謝通路。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用Origin 2021 和Excel 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并作圖。對于發(fā)酵液代謝物的差異變化，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對樣本t檢驗，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對的Wilcoxon 非參數(shù)檢驗，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同DFC 組合對代表性人體腸道菌群中主要菌屬的影響

利用qPCR 測定不同DFC 組合發(fā)酵液48 h 腸道菌群菌屬的相對表達量，探究不同添加比例的DFC 干預(yù)下菌屬的變化。主要腸道菌群（大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌屬）的相對表達變化量如圖1 所示。

圖1 不同DFC 干預(yù)后代表性腸道菌群相對表達量Fig.1 The relative expression of representative intestinal microbiota after different DFC intervention

由圖1 可知，女性組在不同添加比例的DFC 干預(yù)下，發(fā)酵液樣品中大腸桿菌屬和擬桿菌屬的含量相對于對照組均表現(xiàn)為下降，雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的含量相對于對照組均表現(xiàn)為上升。大腸桿菌屬相對表達量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的74.27%，顯著降低了25.73%（P＜0.05），DFCF2 組為DFCFC 組的60.89%，極顯著降低了39.11%（P＜0.01），DFCF3組為DFCFC 組的52.76%，極顯著降低了47.24%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的60.60%，極顯著降低了39.40%（P＜0.01）。擬桿菌屬相對表達量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的74.89%，顯著降低了25.11%（P＜0.05），DFCF2 組為DFCFC 組的68.83%，極顯著降低了31.17%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的43.40%，極顯著降低了56.60%（P＜0.01），DFCF4組為DFCFC 組的52.88%，極顯著降低了47.12%（P＜0.01）。大腸桿菌屬與擬桿菌屬均在DFCF3 干預(yù)組中下降幅度最大。雙歧桿菌屬相對表達量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的163.37%，極顯著升高了63.37%（P＜0.01），DFCF2 組為DFCFC 組的182.00%，極顯著升高了82.00%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的249.79%，極顯著升高了149.79%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的254.34%，極顯著升高了154.34%（P＜0.01）。乳酸桿菌屬相對表達量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的151.64%，極顯著升高了51.64%（P＜0.01），DFCF2 組為DFCFC 組的189.25%，極顯著升高了89.25%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的232.99%，極顯著升高了132.99%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的225.09%，極顯著升高了125.09%（P＜0.01）。其中雙歧桿菌屬在DFCF4 干預(yù)組中上升幅度最大，但與DFCW3 干預(yù)組相差不大，乳酸桿菌屬在DFCF3 干預(yù)組中上升幅度最大。

男性組在不同添加比例DFC 干預(yù)下，發(fā)酵液樣品中大腸桿菌屬和擬桿菌屬的含量相對于對照組均表現(xiàn)為下降，雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的含量相對于對照組均表現(xiàn)為上升。大腸桿菌屬相對表達量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的71.08%，極顯著降低了28.92%（P＜0.01），DFCM2組為DFCMC組的55.01%，極顯著降低了44.99%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC組的44.02%，極顯著降低了55.98%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的45.42%，極顯著降低了54.58%（P＜0.01）。擬桿菌屬相對表達量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的73.22%，極顯著降低了26.78%（P＜0.01），DFCM2組為DFCMC組的65.72%，極顯著降低了34.28%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC組的53.14%，極顯著降低了46.86%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的54.10%，極顯著降低了45.90%（P＜0.01）。大腸桿菌屬與擬桿菌屬均在DFCM3 干預(yù)組中下降幅度最大。雙歧桿菌屬相對表達量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的148.35%，顯著升高了48.35%（P＜0.05），DFCM2 組為DFCMC組的177.80%，極顯著升高了77.80%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC 組的228.71%，極顯著升高了128.71%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的221.68%，極顯著升高了121.68%（P＜0.01）。乳酸桿菌屬相對表達量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的141.77%，顯著升高了41.77%（P＜0.05），DFCM2組為DFCMC 組的172.20%，顯著升高了72.20%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC 組的206.11%，極顯著升高了106.11%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC組的209.98%，極顯著升高了109.98%（P＜0.01）。其中雙歧桿菌屬在DFCM3 干預(yù)組中上升幅度最大，乳酸桿菌屬在DFCM4 干預(yù)組中上升幅度最大，與DFCM3 干預(yù)組相差不大。

通過對比發(fā)現(xiàn)膳食纖維復(fù)合體對大腸桿菌屬的抑制作用男性組較強，對擬桿菌屬的抑制作用女性組較強，對雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的增值能力女性組較大，DFC 添加量為2%時的效果最優(yōu)。王津等[25]研究顯示最優(yōu)膳食纖維比例為2%的茶膳食纖維可對腸道菌群有益生調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果與上述學者的研究結(jié)果相似，說明體外發(fā)酵時膳食纖維的添加量不是越多越好。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維組合對年輕小鼠具有良好抗衰老效果[3]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外發(fā)酵條件下，廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后，老年志愿者糞便發(fā)酵液中雙歧桿菌屬與乳酸桿菌屬相對含量增加顯著，大腸桿菌屬與擬桿菌屬相對含量顯著減少。體外發(fā)酵培養(yǎng)下，糞便中的菌群能夠利用膳食纖維進行發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這會抑制大腸桿菌屬和擬桿菌屬等繁殖，也會促使雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬等有益菌進行繁殖[26]。趙文婧等[27]發(fā)現(xiàn)谷子（小米）中的可溶性膳食纖維對大腸桿菌有顯著的抑制作用，且均呈現(xiàn)濃度依賴性。張峰等[28]發(fā)現(xiàn)高膳食纖維飲食可以降低擬桿菌的數(shù)量。Daniel 等[29]對比大量研究發(fā)現(xiàn)膳食纖維干預(yù)，特別是果聚糖和低聚半乳糖，可提高雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的糞便豐度。本研究與趙文婧與張峰的研究相比對大腸桿菌和擬桿菌屬的相對表達量進行了測定，通過更加直觀的數(shù)據(jù)表明了DFC 對大腸桿菌和擬桿菌屬的抑制作用；本研究與Daniel 的研究相比發(fā)現(xiàn)，體外條件下廣西長壽飲食模式介導(dǎo)的DFC 干預(yù)后雙歧桿菌和乳酸桿菌屬的相對表達量更高。表明廣西長壽飲食模式介導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體可以較好的調(diào)節(jié)腸道微生物組成，從而改善人體健康狀態(tài)。

2.2 發(fā)酵液樣品1H-NMR 圖譜標定

對發(fā)酵液樣品譜圖進行1H-NMR 圖譜定標及積分，典型圖譜見圖2，根據(jù)每種代謝物的化學位移和信號多樣性，結(jié)合先前報道文獻[30-32]和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB；http://www.hmdb.ca/）鑒定并量化了41 種代謝物。

2.3 發(fā)酵48 h DFC3 干預(yù)組與對照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計分析

DFC3 干預(yù)組與對照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計分析結(jié)果見圖3。

圖3 DFC3 干預(yù)組與對照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計分析Fig.3 Multivariate statistical analysis of intestinal microbiota metabolites in DFC3 intervention group and control group

如圖3 所示，DFC3 干預(yù)組與對照組樣品腸道菌群代謝物的分布可以分開，其中DFCF3 組PCA 模型的累計解釋率R2X=0.855，得到2 個主成分，DFCM3 組PCA 模型累計解釋率R2X=0.765，得到2個主成分，此處的PCA 模型是可以參考的。PCA 模型得分圖表明，體外發(fā)酵后DFC3 組和對照組之間存在良好的分離，表明該模型可以較好地區(qū)分發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物。

2.4 DFC3 組差異代謝物的篩選

根據(jù)腸道菌群的結(jié)果可知，DFC3 組是最優(yōu)的，以DFC3 組為主分析代謝物的變化。由圖4a 及圖4c的火山圖（FC＞2）和圖4b 及圖4d 的OPLS-DA 評分圖中的VIP 值（VIP＞1），篩選出明顯不同的代謝物，并將其選為潛在的代謝標志物，再與對照組相比，辨識廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對于糞便菌群代謝物產(chǎn)生的生化影響作用（表6 與表7）。

圖4 DFC3 組的火山圖與VIP 值圖Fig.4 Volcano map and VIP value map of DFC3 group

表6 DFCF3 組與對照組相對比的差異代謝物Table 6 The differential metabolites of DFCF3 group compared with control group

表7 DFCM3 組與對照組相對比的差異代謝物Table 7 The differential metabolites of DFCM3 group compared with control group

由表6 可知，與女性對照組相比，DFCF3 組共有12 種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中，異丁酸、丙酸、甲酸相對豐度顯著增加（P＜0.01），蛋氨酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙三醇、天冬氨酸、精氨酸、甲基組氨酸的相對豐度顯著減少（P＜0.01）。由表7 可知，與男性對照組相比，DFCM3 組共有9種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中異丁酸、丙酸、丁酸鹽、甲酸相對豐度顯著增加（P＜0.01），組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸相對豐度顯著減少（P＜0.01）。對比DFCF3 組與DFCM3 組的差異代謝物變化發(fā)現(xiàn)，共有的差異代謝物有異丁酸、丙酸、甲酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，且變化趨勢相同。其中，DFCF3 組中異丁酸、丙酸、甲酸的FC 值均高于男性DFCM3 組，DFCF3組中組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸的FC 值均低于DFCM3 組，DFCF3 組天冬氨酸的FC 值高于DFCM3 組。

DFC 干預(yù)下，志愿者糞便中的腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸在維持腸道健康和促進動物和人類粘膜免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[33]，還防止胃腸道中病原體的附著和過度生長[34]。Sara 等[35]的研究表明，富含高纖維的飲食模式可有效增加腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸。黃妙如等[36]的研究發(fā)現(xiàn)金柚幼果膳食纖維具有提高結(jié)腸內(nèi)容物質(zhì)酵解反應(yīng)發(fā)生速度的作用，產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸。上述結(jié)果與本研究的結(jié)果相似。在膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后，志愿者糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸水平顯著升高，主要原因可能是膳食纖維有效促進可降解纖維的細菌增值代謝。因此，廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體干預(yù)老年志愿者糞便后，短鏈脂肪酸的升高可能會促進粘膜免疫反應(yīng)，增強人體腸道健康。

根據(jù)表6 與表7 可知，DFC3 組相對于對照組葡萄糖相對豐度顯著下降。Jee 等[37]研究發(fā)現(xiàn)當葡萄糖濃度處于低水平時對機體健康呈現(xiàn)有益作用，Townsend等[38]研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖會阻礙有益菌在腸道定植。本研究中膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后的實驗組β-葡萄糖相對含量下降，并結(jié)合有益菌相對含量增加，表明廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對腸道有益菌的定制起到了一定的促進作用，可能增強機體健康狀態(tài)。

2.5 DFC3 組與對照組相比差異代謝物的代謝途徑分析

為衡量得出的差異代謝物是否反映了其代謝途徑的協(xié)同變化，使用MetaboAnalyst 5.0 分別將女性組12種差異代謝物和男性組9 種差異代謝物進行代謝物組富集分析和途徑分析。選擇Home sapiens 路徑數(shù)據(jù)庫和Fisher 檢驗對代謝標志物進行路徑富集分析，選擇Hypergeometric Test 和Relative-betweeness Centrality對所影響的通路進行拓撲分析，被顯著改變的代謝標志物會被映射到與其相關(guān)的代謝路徑上，并用來解釋代謝結(jié)果。根據(jù)影響閾值大于0.1 和P＜0.05 這兩個條件篩選潛在的目的代謝通路，結(jié)果如圖5，女性組與男性組均有2 種潛在的代謝途徑，分別為：（1）組氨酸代謝，（2）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。

圖5 DFC3 組與對照組相比差異代謝物路徑富集分析和拓撲分析Fig.5 Pathway enrichment analysis and topological analysis of different metabolites in DFC3 group compared with control group

DFC3 組相對于對照組組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸相對豐度顯著下降。越來越多的證據(jù)表明，像氨基酸和短鏈脂肪酸的細菌代謝產(chǎn)物是宿主生理學的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[39]，腸道氨基酸可以有效預(yù)測機體健康狀況，在診斷疾病方面具有良好潛力[40]。氨基酸作為微生物產(chǎn)生SCFAs 的前體，對于合成在信號通路和代謝中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能的各種生物活性化合物至關(guān)重要[41]。Neis 等[42]研究表明蘇氨酸、賴氨酸和谷氨酸可用于丁酸鹽的合成。色氨酸是化學上最復(fù)雜的氨基酸，幾乎可以在其結(jié)構(gòu)中的每個原子上進行生化轉(zhuǎn)化，使其成為多種轉(zhuǎn)化的最佳基質(zhì)[43]，腸道微生物利用色氨酸酶將色氨酸代謝為吲哚，然后吲哚進入宿主門靜脈循環(huán)，在肝臟中轉(zhuǎn)化為硫酸吲哚酚，接著由腎臟排出，高濃度時具有腎毒性[44]。腸道微生物群對組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的微生物代謝導(dǎo)致許多與疾病相關(guān)的化合物[45]，組氨酸經(jīng)腸道菌群可代謝為丙酸咪唑，在T2DM 患者中發(fā)現(xiàn)丙酸咪唑升高，并通過激活p38γ-p62-mTORC1 通路106 損害胰島素信號傳導(dǎo)[46]。高苯丙氨酸可能引起苯丙酮尿癥及神經(jīng)系統(tǒng)的損害等，其中神經(jīng)系統(tǒng)損害尤為明顯，可引起精神障礙、智力缺陷、運動減退等[47]。本研究中膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后的實驗組蘇氨酸、苯丙氨酸及組氨酸相對含量下降，表明廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的抗衰老膳食纖維復(fù)合體能夠促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，可能減少患病風險，增強機體健康狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究探究了體外發(fā)酵條件下老年志愿者糞便典型腸道菌群及腸道菌群代謝物的變化。結(jié)果表明：與不加膳食纖維的對照組相對，廣西長壽飲食模式指導(dǎo)下的抗衰老膳食纖維復(fù)合體對老年志愿者腸道典型菌群起到了明顯的正向化調(diào)控作用，增加了有益菌雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的豐度，減少了有害菌大腸桿菌屬和擬桿菌屬的豐度。女性組共篩選出12 種差異代謝物，分別為異丁酸、丙酸、甲酸、蛋氨酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙三醇、天冬氨酸、精氨酸和1-甲基組氨酸，涉及組氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成這兩條代謝途徑；男性組共篩選出9 種差異代謝物分別為異丁酸、丙酸、丁酸鹽、甲酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，涉及組氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成這兩條代謝途徑。對豐富發(fā)展膳食纖維通過改善老年人體腸道菌群促進身體健康的理論提供了一定的參考。