紫菀酮對LPS誘導(dǎo)的氣道細胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響*

李 楨, 艾 奎

武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū)兒科,武漢 430074

氣道炎癥是慢肺阻和哮喘的主要特征之一。在慢阻肺發(fā)展和炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)和破壞性酶的過程中發(fā)揮重要作用[1]。自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)和功能的重要過程,對氣道炎癥的發(fā)生具有重要作用。自噬是一個與自噬體形成相關(guān)的動態(tài)過程,LC3作為自噬標(biāo)志物,當(dāng)自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)[2]。在OVA誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠氣道組織中發(fā)生了自噬[3-5],而在哮喘氣道炎癥中,氣道上皮細胞通過激活NF-κB與活化蛋白-1(AP-1)發(fā)生自噬。因此,抑制自噬對哮喘的氣道炎癥和黏液細胞增生均有治療作用。

mTOR(雷帕霉素靶蛋白)在調(diào)節(jié)細胞生長和代謝以響應(yīng)生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)方面起主導(dǎo)作用,mTOR信號通路與癌癥、肥胖、2-型糖尿病的進展以及衰老過程有關(guān)[6]。由于mTOR的敏感性不同,其主要在兩個復(fù)合體中發(fā)揮作用,mTOR復(fù)合體1和mTOR復(fù)合體2,而mTOR復(fù)合體1被認為是自噬的主要調(diào)節(jié)因子[6-7]。

紫菀酮是紫菀的主有效活性成分,主要在其根及根莖中積累[8],能夠抑制細胞中炎癥因子的產(chǎn)生,從而減輕肺部炎癥。但是,紫菀酮能否抑制氣道炎癥細胞中的自噬發(fā)生需要進一步研究,因此,本實驗擬在LPS誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥模型的基礎(chǔ)上,探討紫菀酮對氣道炎癥細胞自噬及機制的作用,為紫菀酮抗哮喘氣道炎癥的具體分子機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Beas-2B細胞來源武漢大學(xué)細胞庫。紫菀酮(B21703,20 mg)購自源葉生物,BEGM Bullet Kit購自Lonza(CC3170),CCK-8試劑盒購自BestBio(BB-4202),IL-6(HM10205)和TNF-α(HM10001)試劑盒購自Bioswamp,吖啶橙熒光染色檢測試劑盒購自金克隆(CC2270),Trizol購自Ambion(15596026),SYBR FAST qPCR Master Mix購自KAPA Biosystems(KM4101),Oligo(dT)18 Primer(3806)、PrimeScriptⅡRtase(2690A)和Recombinant Rnase Inhibitor(2313A)購自TaKaRa,10 mmol/L dNTP Mix購自Solarbio(PC2200)。蛋白質(zhì)Marker購自Helix(P12103),BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio(PC0020),NF-κB(PAB33379)、p-NF-κB(ab76302)、AP-1(PAB37390)、Beclin 1(PAB35215)、LC3-Ⅱ(PAB34117)、LC3-Ⅰ(PAB34124)、mTOR(PAB30674)、S6K1(PAB33261)、GAPDH(PAB36269)和Goat anti-Rabbit IgG(SAB43714)抗體購自bioswamp,p-mTOR(ab109268)抗體購自Abcam,p-S6K1(9234T)抗體購自CST。

1.2 細胞培養(yǎng)及模型構(gòu)建

將Beas-2B細胞置于37℃水浴中,待其完全融化,將細胞懸液吸至離心管中,加入4 mL完全培養(yǎng)液,400×g,離心3 min,棄上清,細胞重新懸浮于1 mL培養(yǎng)液中,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,加入4 mL完全培養(yǎng)液,置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的上皮細胞用1 μg/mL的LPS干預(yù)24 h,構(gòu)建炎癥模型[9]。

1.3 CCK-8檢測

利用不同濃度的紫菀酮(0、1、10、25、50、75、100 μmol)干預(yù)Beas-2B細胞24 h和48 h后,用CCK-8檢測細胞增殖。調(diào)整細胞懸液濃度,分于96孔板,3×103個細胞/孔,每孔100 μL,置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后按照分組加入不同濃度的紫菀酮干擾細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,48 h,加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度值。

1.4 ELISA檢測

在建模前,利用不同濃度的紫菀酮(0、1、10、25、50、75、100 μmol)干預(yù)Beas-2B細胞,再經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h和48 h后,采用ELISA檢測各組細胞中IL-6和TNF-α的水平。首先,將標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋,將6只小試管依次編好號碼,嚴(yán)格按照說明步驟進行,將每管稀釋至相應(yīng)濃度。然后進行加樣,在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)孔依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;樣本孔中先加樣品40 μL,然后再加生物素標(biāo)記的抗體10 μL,除空白孔外,每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL,用封板膜封板后置37℃培養(yǎng)箱中溫育30 min,洗滌后加入顯色液進行顯色,最終加入終止液在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)值。

1.5 吖啶橙熒光染色

將實驗分為3組:對照組、LPS組、LPS+紫菀酮(25 μmol)組。首先取AO Stain Buffer和AO Stain,按照19∶1的比例混合,配制工作液,然后取1 mL工作液覆蓋細胞,室溫避光染色15 min,然后棄去染色液,用PBS洗滌,在熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長488 nm,阻斷濾光片波長515 nm),拍照。

1.6 熒光定量qRT-PCR檢測

取1×106個細胞于1 mL的Trizol中勻漿,進行總RNA的提取,然后進行RNA逆轉(zhuǎn),將制備好的cDNA進行PCR擴增,反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 25 s(40個循環(huán))采用2-ΔΔCt計算目的mRNA的相對含量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印跡實驗(Western blot)

將蛋白質(zhì)進行提取,采用BCA試劑盒測定各組的蛋白濃度,在凝膠中(配制12%的分離膠和5%的濃縮膠)加入20 μg蛋白,選擇濃縮膠80 V 40 min,分離膠120 V 50 min電泳,恒壓90 V轉(zhuǎn)膜50 min,5 %脫脂奶粉室溫封閉4℃過夜,加入一抗(1∶1000 NF-κB;1∶1000 p-NF-κB;1∶1000 AP-1;1∶1000 Beclin 1;1∶1000 LC3-Ⅱ;1∶1000 LC3-I;1∶1000 mTOR;1∶1000 p-mTOR;1∶1000 p-S6K;1∶1000 S6K1;1∶1000 GAPDH)室溫孵育1 h,洗膜后二抗(1∶10000 Goat anti-Rabbit IgG),室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液后置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中顯色,通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值,每組重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫菀酮對Beas-2B細胞增殖活性的影響

通過CCK-8檢測不同濃度的紫菀酮干預(yù)不同時間對Beas-2B細胞增殖活性的影響。結(jié)果如圖1,干預(yù)24 h的細胞增殖活性始終低于干預(yù)48 h的細胞增殖活性。因此,后續(xù)實驗選擇干預(yù)時間為24 h。

圖1 CCK-8檢測細胞的活性

2.2 紫菀酮對LPS誘導(dǎo)的Beas-2B細胞炎癥反應(yīng)的影響

通過ELISA檢測LPS誘導(dǎo)后對細胞中IL-6與TNF-α表達的影響。如圖2,在干預(yù)24 h和48 h后,細胞中IL-6與TNF-α的水平依次隨紫菀酮濃度的增加而降低。在紫菀酮濃度為50 μmol/L和25 μmol/L時,干預(yù)24 h后細胞中IL-6和TNF-α的水平趨于一致。因此,綜合以上指標(biāo),選擇25 μmol/L的紫菀酮干預(yù)24 h進行后續(xù)實驗的研究。

圖2 Beas-2B細胞中IL-6與TNF-α表達

2.3 紫菀酮對LPS誘導(dǎo)的Beas-2B細胞NF-κB的激活及AP-1表達的影響

利用qRT-PCR檢測各組細胞NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄水平表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3),與對照組比較,LPS誘導(dǎo)后細胞中的NF-κB和AP-1的相對表達顯著升高(均P<0.05)。與LPS組比較,添加紫菀酮顯著降低了細胞中NF-κB和AP-1的相對表達(均P<0.05)。同時,我們通過Western blot檢測NF-κB、p-NF-κB和AP-1表達。如圖4所示,與對照組比較,LPS誘導(dǎo)后細胞中的p-NF-κB和AP-1的相對表達顯著升高(P<0.05)。與LPS組比較,添加紫菀酮顯著降低了細胞中p-NF-κB和AP-1的相對表達(均P<0.05)。

與對照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

與對照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

2.4 吖啶橙染色觀察各組細胞自噬變化

如圖5,用吖啶橙染色觀察各組細胞自噬變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,LPS組出現(xiàn)橘、紅色熒光,有很多點狀紅色斑點的酸性膜泡,自噬水平增加。而在添加紫菀酮后可以觀察到橘、紅色熒光明顯減少,自噬水平顯著降低。

圖5 吖啶橙染色結(jié)果(×200)

2.5 Western blot觀察各組細胞自噬相關(guān)蛋白及信號通路的變化

如圖6,與對照組比較,LPS組細胞中Beclin 1和LC3-Ⅱ的相對表達顯著增加(均P<0.05),LC3-Ⅰ的表達顯著降低(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+紫菀酮組的Beclin 1和LC3-Ⅱ的相對表達顯著降低(均P<0.05),LC3-Ⅰ的表達顯著升高(P<0.05)。通過檢測mTOR、p-mTOR、p-S6K1和S6K1的相對表達發(fā)現(xiàn),與對照組比較,LPS組細胞中p-mTOR和p-S6K1的表達顯著降低(均P<0.05)。與LPS組比較,LPS+紫菀酮組細胞中p-mTOR和p-S6K1的表達顯著增加(均P<0.05)。

與對照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

3 討論

自噬是細胞內(nèi)一種高度保守的分解代謝過程。細胞在發(fā)生自噬時,會產(chǎn)生一系列標(biāo)志物,如LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin 1等[10]。在自噬的調(diào)節(jié)過程中,Beclin l通過與B淋巴細胞瘤-2相互作用,在自噬過程的觸發(fā)階段發(fā)揮作用[11]。LC3作為自噬體最常用的標(biāo)記,在自噬泡的形成過程中,LC3前體被加工成可溶性LC313-1(胞漿型LC3),LC3-Ⅰ可在At97(El樣酶)和Atg3(E2樣酶)作用下跟磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3(即LC3-Ⅱ),參與自噬體膜延伸[12]。在本實驗中,通過吖啶橙染色發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)后的Beas-2B細胞中有很多點狀紅色斑點的酸性膜泡,自噬水平增加。同時,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后的Beas-2B細胞中LC3-Ⅱ和Beclin 1的表達增加,LC3-Ⅰ的表達降低。而這些情況在添加紫菀酮后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。說明紫菀酮能夠明顯抑制Beas-2B細胞自噬的發(fā)生。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸和(或)蘇氨酸蛋白激酶,作為細胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號通路,而MAPKs的底物多為轉(zhuǎn)錄因子,包括轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1等[13],與炎性細胞因子的合成和分泌密切相關(guān)。本研究中,通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),紫菀酮能夠顯著抑制NF-κB和AP-1的相對表達。NF-κB的激活能夠增加多種炎癥基因的表達,包括促炎細胞因子和炎癥相關(guān)酶類的釋放等。因此,抑制NF-κB的表達能夠減少炎癥介質(zhì)的釋放[14]。

mTOR是一種保守的絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶,作為細胞增殖、細胞生長、存活、自噬和轉(zhuǎn)錄的中心調(diào)節(jié)劑[15]。有研究證明,在OVA誘導(dǎo)的過敏性小鼠模型中,mTOR的激活能夠減少炎癥的發(fā)生[16]。mTOR信號通路能夠調(diào)控自噬的發(fā)生[17],在過敏小鼠肺中通過mTOR信號通路的激活來抑制自噬進而抑制過敏性氣道炎癥[16]。本研究中,通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn),紫菀酮能夠上調(diào)p-mTOR和p-S6K1的表達。而S6K1作為mTORC1激活后的下游調(diào)節(jié)因子,經(jīng)mTOR磷酸化后的S6K1可激活相應(yīng)核糖體S6蛋白,增加了含嘧啶序列mRNA翻譯表達核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白[18]。因此,紫菀酮通過抑制自噬有效緩解了LPS誘導(dǎo)的Beas-2B細胞氣道炎癥,而這種效應(yīng)是由mTOR通路激活介導(dǎo)的。

綜上所述,本研究通過LPS誘導(dǎo)構(gòu)建Beas-2B細胞炎癥模型,利用紫菀酮干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫菀酮能夠上調(diào)細胞中p-mTOR和p-S6K1的表達,下調(diào)NF-κB、AP-1、LC3-Ⅱ和Beclin 1表達,有效緩解了自噬的發(fā)生,其機制可能與mTOR信號通路的激活有關(guān)。