β-煙酰胺單核苷酸的功能和化學(xué)制備進程

齊勇，姚崇虎，沙云沖，陳森林

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 馬鞍山 243100）

NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）在人類健康中扮演著至關(guān)重要的角色，它可以促進上千種生物活性的發(fā)揮，但是，當(dāng)我們年紀(jì)越大，體內(nèi)其含量也會越低。NMN（β-煙酰胺單核苷酸）是體內(nèi)煙酰胺核糖轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+路徑最重要的中間體。近年來，NMN 的研究取得了重大進展，發(fā)現(xiàn)它具有多種生物學(xué)功能，可以有效地治療心腦血管、老年癡呆、神經(jīng)衰弱以及延緩衰老[1]等多種慢性疾病。最新的研究發(fā)現(xiàn)，NMN 能有效延長30%以上的生物模型體系的壽命[2]。同時研究還表明，NMN 可能和衰老有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)引起了社會對“不老神藥”NMN 的廣泛關(guān)注，在保健品和食品行業(yè)中引發(fā)了激烈的討論，但NMN 的抗衰老成效和機制尚未完善，存在爭議。隨著NMN 的快速發(fā)展，目前的國內(nèi)市場容量已經(jīng)超過10 噸，未來有望實現(xiàn)百噸級的規(guī)模。2010 年之前，NMN 的生產(chǎn)是通過化學(xué)方法完成的，由于技術(shù)路線的局限性，使得NMN 的價格一直保持在30 000 元/kg 以上，這嚴(yán)重阻礙了它的功能驗證和普及應(yīng)用。近年來隨著NMN 代謝途徑的深入探索和酶工程技術(shù)的不斷改善，一步酶法在NR 合成NMN 方面取得了巨大突破，使其成為NMN 生產(chǎn)的首選方式，并且在實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化之后，NMN 的生產(chǎn)成本將會降到10 000元/kg或更低，而且，如果NR合成的成本能夠得到進一步的降低，NMN 的生產(chǎn)價格將會達到五千元或更少。NMN 的生產(chǎn)正在朝著一個新的方向發(fā)展，其成本可能會大幅降低。

1 NMN在與年齡有關(guān)的疾病中的研究進程

NMN被認(rèn)為是一個重要的NAD+中間體，它通過動物實驗得到了可靠的結(jié)果：通過靜脈注射，NMN可以顯著增加包括大腦在內(nèi)的多個外圍器官的NAD+濃度；通過腹腔注射NMN，可以顯著改善海馬區(qū)和下丘腦的NAD+水平；而且，研究表明，長期口服NMN能夠顯著改善與年齡成正比的個體組織的NAD+水平。NMN 的應(yīng)用顯示出NAD+中間體具有強大的抗衰老功能，可以用于預(yù)防和治療各種衰老癥狀。

1.1 糖尿病

研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者大腦中NAD+水平明顯降低。Yoshino 等[3]建立的糖尿病小鼠模型以及挑選自發(fā)形成的糖尿病小鼠來進行研究，實驗結(jié)果表明，NMN改善了年齡誘導(dǎo)的DM 小鼠及飲食誘導(dǎo)的小鼠存在的的葡萄糖不耐受和脂質(zhì)譜問題，并且整個研究過程中非糖尿病小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)沒有受到影響。Revollo 等[4]的研究結(jié)果也同樣證明了小鼠糖耐量及胰島素分泌可以通過補充NMN 來改善。經(jīng)過Chandrasekaran 和其他人的研究，利用STz 技術(shù)構(gòu)建的糖尿病大鼠模型，也顯示出NMN的補充能夠有效提高小鼠的糖耐量和胰島素的分泌水平，即NMN對糖尿病的治療理論上存在效果。

1.2 肥胖

實驗證明，NMN 可以以劑量依賴性的方式來減少與年齡相關(guān)的體重增加。肥胖與糖尿病之間有著密切的聯(lián)系，肥胖會影響線粒體的功能，從而導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病。NMN的應(yīng)用可以有效緩解這種情況，從而達到減輕體重的目的。

1.3 阿爾茨海默?。ˋD）

衰老是造成老年癡呆的一種嚴(yán)重的危險因素，其中線粒體功能障礙是其中最常見的原因。研究發(fā)現(xiàn)，NMN 可以改善老年性疾病的線粒體功能，從而有效預(yù)防老年癡呆的發(fā)生。目前有研究人員憑借此理論研發(fā)相關(guān)藥物，期望能夠改善老年人的健康狀況。同時，目前它被認(rèn)為沒有副作用，可以放心使用。

1.4 腦出血

ICH（腦出血）是一種危及生命的疾病，其發(fā)生率和致命率均極高，而幸存者也會遭受嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害。ICH的破壞過程可以劃分為兩個階段：一個是血腫的形成，它會給周圍的組織帶來機械性的破壞；另一個則是血腫導(dǎo)致的病理學(xué)改變，從而導(dǎo)致新的損害。研究結(jié)果指出，當(dāng)ICH發(fā)作1 h后，通過尾靜脈注射NMN，雖然小鼠的出血量和血腫體積無明顯變化，但發(fā)現(xiàn)NMN可以促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，并且還可以有效地緩解腦水腫、炎癥因子、體重以及細(xì)胞凋亡等問題。此外，NMN還被證實具備良好的抗凝活性，從而可以促進膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型的建立[5]。

2 NMN的合成進展

2.1 產(chǎn)品舉例

NMN 具有強大的生物活性，因此在市場上出現(xiàn)了許多以NMN 為原料的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品的主要目的是抗衰老和保健。在美國、加拿大、西班牙、日本和德國等國家，都有專門生產(chǎn)含NMN 的產(chǎn)品，其中的純度、規(guī)格和價格存在一定差異。隨著規(guī)格的增加，純度也會提升，從而使價格也相應(yīng)上漲。一般來說，每瓶六十粒，每粒130～400 mg，人民幣售價約為800～3 000元。

2.2 常用化學(xué)合成路線

NMN的化學(xué)合成研究起始較早，主要以煙酰胺、三苯甲?；?β-D-核糖、四乙酰核糖等為原料，通過糖基化、磷酸化、氨解等關(guān)鍵步驟合成。根據(jù)起始原料和保護基團的不同，主要合成路線有六條，都具有顯著的優(yōu)勢和劣勢，具體情況如下。

1981 年首次報道的以三苯甲?；?β-D-核糖為原料的合成途徑步驟短，收益高，但污染大，原料不容易獲得，收率較低，難以大規(guī)模應(yīng)用；1984 年首次報道的以Amp 為原料的合成途徑原材料易得，但反應(yīng)苛刻，存在手性分離困難的問題，無法實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用；1999年首次報道的以四乙酰核糖為原料的合成途徑步驟短，原材料易得，價格低，但具有化學(xué)污染；2002 年首次報道的以四乙酰核糖和煙酰胺為原料的合成途徑步驟較短，原材料容易獲得，易放大，具有較高的收率、工業(yè)放大容易等優(yōu)點，但具有化學(xué)污染、異構(gòu)體拆分困難、無法實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用等缺點；2004年首次報道的以煙酰胺為原料的合成途徑步驟短，每步收率高，但原料昂貴，分離相對困難，成本相對較高；2018 年首次報道的以煙酸乙酯和四乙酰核糖為原料的合成途徑步驟簡短，原材料易得，易放大，收率高，工業(yè)放大容易，但會造成化學(xué)污染，試劑成本高，純化成本高[6]。代表性的合成方法都是以四酰基β-D-核糖為起始原料的方法，具體分析如下：

2.3 前兩種合成路線

方法1：

方法2：

這兩條合成路線都是通過脫去四乙酰β-D-核糖中的1 位OAc 基團，生成三氟甲磺酸基β- 煙酰胺核糖中間體，由于1 位OAc 基團不易脫去，需要用昂貴的TMSOTf 活化四乙酰核糖中的1 位OAc，使其更容易離去，另外，得到的三氟甲磺酸基β-煙酰胺核糖中間體極性較大，分離純化比較難，需要通過活性炭色譜分離，因此收率較低，工藝放大難。

2.4 第三條合成路線

第一步是將四?；?β-D-核糖與乙酰氯+甲醇或易制毒氣體氯化氫反應(yīng)，制1-氯-2，3，5-三?；?β-D-核糖，首先這步會得到1-氯-2，3，5-三?；?β-D-核糖和1-氯-2，3，5-三?；?α-D-核糖的混合物，這兩個非對映異構(gòu)體一同參與后面的氨解反應(yīng)和脫保護反應(yīng)，得到β-煙酰胺核糖和α-煙酰胺核糖的混合物，然后經(jīng)有機溶劑漿洗以除去α-煙酰胺核糖雜質(zhì)。由于β-煙酰胺核糖和α-煙酰胺核糖為非對映異構(gòu)體，通過有機溶劑漿洗的方法很難完全除去α-煙酰胺核糖雜質(zhì)，該雜質(zhì)會參與后面的磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物NMN 的異構(gòu)體α-煙酰胺單核苷酸，這個異構(gòu)體與目標(biāo)產(chǎn)物NMN 也為非對映異構(gòu)體，很難分離，影響了目標(biāo)產(chǎn)物NMN 的質(zhì)量。其次，由于1 位OAc 基團不易被取代，且在鹽酸體系中分子中的保護基R 容易部分脫去，因此，需用大過量（10個當(dāng)量以上）酰氯在低溫（-25～-20℃）下反應(yīng)。另外工藝的第二步以昂貴的TMSOTf 為催化劑，生成三氟甲磺酸基β-煙酰胺三乙酰核糖，再脫去三?；笠驳玫诫y以分離純化的三氟甲磺酸基β-煙酰胺核糖；脫保護中需用甲醇鈉等強堿在較低溫度（-5℃）、較長時間（24 h）等條件下才能脫去三個酰基。因此，這個方法不僅收率低，操作繁瑣，產(chǎn)品質(zhì)量也難以保證[7]。

3 生物合成路線

NMN的生物合成包括發(fā)酵法和酶法。發(fā)酵法由于自身原因，生產(chǎn)效率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。2018年，一種基于NMN 代謝相關(guān)酶的基因工程大腸桿菌發(fā)酵制備NMN，其產(chǎn)量達到15.42 mg/L[8]，這一成果提高了NMN 的生物合成效率，有助于工業(yè)化生產(chǎn)。相比傳統(tǒng)的發(fā)酵法，這種方法具有更高的效率，可以更有效地利用菌體本身的資源，從而實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[8]。在2020年，一項研究即利用大腸桿菌設(shè)計了一種新的生物合成途徑來合成NMN，具有顯著的優(yōu)點，即不需要其他的輔助因子，但是獲得的NMN的產(chǎn)量非常低，只有1.5 mmol/L[9]（0.5 g/L），沒有太多的工業(yè)價值。但在2020年底，成功地構(gòu)建了一種基因工程重組大腸桿菌，它能夠攝取葡萄糖和煙酰胺，其中包括NiaP、PunC和NAMPT酶，最終可以使NMN 產(chǎn)量達到6.79 g/L[10]，這是目前發(fā)酵法制備NMN報道中最高的產(chǎn)量。下面是對幾種生物制備方法的具體分析：

3.1 發(fā)酵法

國內(nèi)外科研人員對發(fā)酵法合成NMN 也進行了大量的研究。發(fā)酵法過程比較復(fù)雜，因為它包含了多種酶的復(fù)雜系統(tǒng)。除了反應(yīng)條件外，催化過程還可能受到其他非目標(biāo)酶的影響。發(fā)酵法利用NAMPT 催化PRPP 轉(zhuǎn)化為NMN，其中的焦磷酸鹽（PPi）是一種副產(chǎn)品。Burgos 等［11］證明，PPi 的水解有利于反應(yīng)平衡向NMN 的生產(chǎn)方向轉(zhuǎn)移。通過添加焦磷酸酶（PPase）消除PPi，NMN的產(chǎn)量增加了約50%，可能是因為副產(chǎn)品PPi的降解促進了反應(yīng)過程［12］。但由于宿主細(xì)胞內(nèi)其余非目標(biāo)酶的存在，在催化過程中可能會發(fā)生底物、中間產(chǎn)物和NMN合成的最終產(chǎn)物的消除。在發(fā)酵法中，有研究表明細(xì)胞內(nèi)的底物轉(zhuǎn)入和產(chǎn)物轉(zhuǎn)出是影響NMN產(chǎn)量的另一個關(guān)鍵因素［13］，NAM 進入到工程菌細(xì)胞內(nèi)是合成NMN 所必需的首要條件。在篩選的6個煙酸轉(zhuǎn)運基因（NiaP）中，來自布氏菌的NiaP表現(xiàn)出對NAM最高的吸收活性。在表達NiaP 的基因工程菌中，NMN 的產(chǎn)量提高約25%。NMN在細(xì)胞中會通過NMNAT催化作用轉(zhuǎn)化為NAD，從而導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。因此除了下調(diào)NMNAT 外，避免這種轉(zhuǎn)化的另一個策略是將NMN 輸出到細(xì)胞外。而PRPP 和NAM 向NMN 的轉(zhuǎn)化是可逆的，這就表明NMN在細(xì)胞內(nèi)的積累可能會阻礙產(chǎn)品在細(xì)胞內(nèi)的形成。

3.2 D-5-磷酸核糖和煙酰胺作為原料

以D-5-磷酸核糖和煙酰胺為原料，在ATP 存在下，在磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPPs）和煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）的催化下，制備β-煙酰胺單核苷酸，如專利CN 2018109407295 公開了這種方法，底物的轉(zhuǎn)化率可達86.9%～89.8%。又如WO 2018/023206 公開了以煙酰胺和5′-磷酸核糖基-1′-焦磷酸（PRPP）為原料，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體（F180A）的催化作用下制備NMN，底物煙酰胺轉(zhuǎn)化率可達66%。

3.3 煙酰胺核糖（NR）作為原料

以煙酰胺核糖（NR）為起始原料，在煙酰胺核糖核苷激酶（Nicotinamide Ribonucleoside Kinase，NrK）和ATP 的作用下，一步反應(yīng)得到NMN，收率高，產(chǎn)品純度高。其中專利CN 2016112456194，以煙酰胺核糖（NR）為底物，在ATP 等磷酸供體存在下，在來自釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的煙酰胺核糖激酶的催化下反應(yīng)24 h生成β-煙酰胺單核苷酸，純化后β-煙酰胺單核苷酸純度大于95%。

4 展望

鑒于NMN 具有抗衰老等功能以及具備安全性較高、熱穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，同時NMN在延緩衰老方面具有一定的功效，其中對于帕金森病、阿爾茨海默病、糖尿病、肥胖等疾病的治療效果較優(yōu)［14］。由于目前NMN 的合成仍然艱難，其面臨操作復(fù)雜、產(chǎn)品純度低、收率低以及成本高昂等問題。在今后的研究中，可利用基因工程技術(shù)，采用全細(xì)胞生物催化方法合成NMN，最終構(gòu)建出一個完整、高效的β-煙酰胺單核苷酸全細(xì)胞催化和分離純化體系，為NMN 的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)今我國在醫(yī)療健康方面應(yīng)用NMN 的占比較大，而在食品方面的應(yīng)用卻寥寥無幾。隨著業(yè)內(nèi)對NMN安全性及效果的進一步探索研究，將會有更多與NMN 相關(guān)的保健品用于生活中，造福人類。