一種基于過氧化物模擬酶活性快速檢測過氧化氫的方法*

程曉宏，楊 娟，張衛(wèi)兵

（南通市疾病預防控制中心，江蘇 226007）

過氧化氫（H2O2）有極強的氧化能力，具有漂白、消毒、氧化、防腐等作用，廣泛用于食品安全和環(huán)境保護中[1-2]。過量過氧化氫對機體有害，我國國家標準禁止食品中檢出過氧化氫殘留。目前快速檢測過氧化氫的方法主要有碘量法[3]、鈦鹽比色法[3]、電化學法[4]、熒光法[5-6]、過氧化氫酶法[7-8]、血紅素類似物模擬酶法[9]、納米粒子模擬酶法等[7-8，10]，這些方法或使用昂貴的生物酶、危險的強酸試劑，或需要復雜的儀器設備和合成工藝等，因此構(gòu)建快速、低成本和高靈敏度檢測過氧化氫的方法十分必要。

天然酶具有高催化性能、高選擇性等優(yōu)點，但存在易失活、穩(wěn)定性差、成本較高和不易制備等缺點，因而應用受限。本文提供一種快速高效、構(gòu)建簡單和廉價易得的檢測過氧化氫方法，可應用于食品安全和環(huán)境保護等領(lǐng)域，報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 圓二色譜儀（Jasco J-815，日本），電子分析天平（XS205，瑞士梅特勒公司），分光光度計（TU1901，北京普析通用公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（DK-S26，上海精宏實驗設備公司），微量臺式離心機（WIGGENS BIOCEN 22R，維根技術(shù)北京公司），超純水機（Milli-Q，密理博上海公司）。30% H2O2、Tris（三羥基氨基甲烷）、NaCl、HCl、KCl、底物ABTS［2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽］、二甲基亞砜、Triton X-100 表面活性劑均為分析純。實驗用二級純水由Millipore 純水儀制備。G4-DNA EAD4 序列為5’-CTG3（TTG3）3A-3’[11]。

1.2 溶液配置

1.2.1 緩沖溶液：稱取1.2114 g Tris、0.7455 g KCl、2.925 g NaCl 于1 L 燒杯中，加入800 mL 水溶解，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.5，加入400 μL Triton X-100，加水補充至1 L，轉(zhuǎn)移至1 L 玻璃瓶中，得到含20 mmol/L pH 7.5 Tris/HCl，20 mmol/L KCl，150 mmol/L NaCl，0.04% Triton X-100 的緩沖液。

1.2.2 G4-DNA 溶液：按照說明書要求，用1.2.1 緩沖液（1.0 mL）溶解G4-DNA（2 OD），并在95 ℃水浴加熱10 min 后迅速用冰冷卻至室溫，濃度為10 μmol/L，4 ℃靜置過夜，備用。

1.2.3 氯化血紅素（hemin）溶液：二甲基亞砜溶解適量的hemin 可得10 mmol/L 儲備液，-20 ℃以下可保存3 個月，臨用前用緩沖液稀釋成20 μmol/L hemin工作液。

1.2.4 過氧化物模擬酶構(gòu)建：將1.2.2 中的G4-DNA溶液與1.2.3 中的hemin 溶液等體積混合，室溫孵育，疏水作用即可獲得過氧化物模擬酶（濃度為5 μmol/L）。

1.2.5 底物ABTS 溶液制備：用緩沖液配置10 mmol/L ABTS 工作液，4 ℃棕色瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 過氧化氫溶液標準系列配制：臨用前，取質(zhì)量分數(shù)為30%過氧化氫溶液，先用純水稀釋100 倍，再用緩沖溶液稀釋成0、0.3、0.6、1.5、3.0、9.0、30.0、60.0 mg/L 工作曲線標準溶液。

1.3 圓二色譜試驗 測量所用緩沖液為20 mmol/L pH 7.5 Tris/HCl，20 mmol/L KCl，150 mmol/L NaCl，0.04%Triton X-100，DNA 濃度為4 μmol/L，hemin 濃度為2 μmol/L。采用400 μL 1 cm 比色皿，在220～320 nm 范圍內(nèi)掃描收集圓二色譜（500 nm/min）。所得圓二色譜均為平滑處理、扣除背景、濃度校準后的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 圓二色譜圖譜 G4-DNA EAD4 在緩沖液中以平行/反平行共存結(jié)構(gòu)，當加入hemin 后EAD4 形成更多的分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)，而反平行共存結(jié)構(gòu)明顯減少（圖1）。

圖1 EAD4 及復合物圓二色譜

2.2 檢測條件選擇 由圖1 可知，hemin 誘導平行/反平行共存結(jié)構(gòu)EAD4 形成平行結(jié)構(gòu)，使得EAD4/hemin 模擬酶具有更高的穩(wěn)定性和酶活性。因而仍選EAD4/hemin 濃度比2∶1[11]。1.2.4 中過氧化物模擬酶濃度為5 μmol/L，以1 cm 比色皿為降解反應池，較合適的總體積為2 mL 左右，比較0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μmol /L 終濃度過氧化物模擬酶對降解反應的影響。較小濃度（0.1、0.2 μmol /L）過氧化物模擬酶催化反應所需時間較長，較大濃度（1.0、2.5 μmol /L）降解所需時間較短，催化效果太好，不易區(qū)分過氧化氫濃度，故選擇中等濃度0.5 μmol /L 過氧化物模擬酶用于降解反應。

EAD4/hemin 模擬酶的過氧化物酶活性較強，反應3 min 即可觀察到顏色變化，可用于定性篩查過氧化氫；反應5～15 min 后顏色基本穩(wěn)定，可用于半定量分析過氧化氫；反應超過20 min 后顏色可能會因為過量的過氧化氫漂白而褪色。故選擇催化反應3 min 用于快速定性篩查，催化反應5 min 用于半定量分析。

2.3 定性篩查過氧化氫 取100 μL 5 μmol/L EAD4/hemin 過氧化物模擬酶、100 μL 2 mmol/L ABTS 底物于比色皿中，分別加入1.8 mL 30 mg/L 過氧化氫標準溶液，反應3 min 后肉眼可觀察到空白與過氧化氫溶液顏色的差異（圖2）。

圖2 過氧化氫模擬酶快速篩查過氧化氫

2.4 半定量分析過氧化氫 取100 μL 5 μmol/L EAD4/hemin 過氧化物模擬酶、100 μL 2 mmol/L ABTS 底物于比色皿中，分別加入1.8 mL 過氧化氫標準溶液系列（0.3、0.6、1.5、3、9、30、60 mg/L），反應3 min 后肉眼觀察30 mg/L 與60 mg/L 濃度過氧化氫的體系溶液顏色相近，反應5 min 后肉眼觀察0.3 mg/L 與0.6 mg/L 濃度過氧化氫的體系溶液顏色相近。因而舍棄0.3 mg/L 和60 mg/L 兩個過氧化氫濃度點，將其他濃度過氧化氫反應后的溶液作為標準比色卡色階（圖3），用于過氧化氫半定量分析。

圖3 過氧化氫模擬酶半定量分析過氧化氫標準色階圖

2.5 定量分析方法的工作曲線、 檢出限、 精密度用分光光度計檢測底物ABTS 氧化產(chǎn)物自由基陰離子（ABTS-，414 nm）吸光度，結(jié)果顯示過氧化氫在0.3～30.0 mg/L 范圍內(nèi)線性較好，其線性回歸方程為y=0.0277x+0.046，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。以3 倍空白偏差除以回歸方程斜率求得檢出限為0.1 mg/mL。平行7 次測定1.0 mg/mL H2O2，相對標準偏差（RSD）為2.9%。

2.6 干擾實驗 采用1.0 mg/mL H2O2對雨水中可能存在的Ca2+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Cd2+、Fe3+、Al3+、Zn2+、SO42-、NO3-、PO43-、Cl-等常見的離子和食品中可能存在的苯甲酸、山梨酸、叔丁基對苯二酚等常見的防腐劑和抗氧化劑進行考察，均未發(fā)現(xiàn)明顯干擾。食品飲料中的亮藍、檸檬黃、莧菜紅等色素添加劑和蘇丹紅、羅丹明等違禁染料會干擾目視半定量分析，但不影響光度計定量分析。

2.7 樣品分析

2.7.1 陽性泡椒鳳爪過氧化氫檢測：稱取粉碎均勻的可食部分試樣1 g（精確到0.01 g），加2 mL 緩沖液搖勻，靜置3 min 后進行定性篩查和半定量分析。如圖4A 所示，泡椒鳳爪中含有少量過氧化氫殘留，溶液濃度約為1.5 mg/L（定量分析為1.30 mg/L），泡椒鳳爪過氧化氫含量約為3 mg/kg（定量分析為2.60 mg/kg）。

圖4 過氧化氫模擬酶快速篩查和半定量分析

2.7.2 污染地區(qū)雨水過氧化氫檢測：量取50 mL 污染地區(qū)雨水，靜置3 min 后進行定性篩查和半定量分析。如圖4B 所示，該雨水中含有少量過氧化氫殘留，溶液濃度約為0.6 mg/L（定量分析為0.64 mg/L），雨水過氧化氫含量約為0.6 mg/kg（定量分析為0.64 mg/kg）。

2.8 回收率實驗 同時做空白試驗、方法對照和加標回收試驗，結(jié)果顯示回收率96.0%～102.6%，說明可靠性較好。見表1。

表1 測定7 次鳳爪、雨水、自來水中過氧化氫定量分析結(jié)果 mg/kg

3 討論

分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)的G4-DNA 與hemin 孵育構(gòu)建的模擬酶具有很強的過氧化物酶活性[11]，因而可用于快速檢測過氧化氫。G4/hemin 復合模擬酶在弱堿性環(huán)境下有較高活性，因此，接近人體液pH 7.5被選擇用于分析。由于分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)G4 上下兩端具有疏水環(huán)境，可與疏水性的hemin 形成π-π 堆積，且G4 與hemin 最佳濃度比為2∶1[11]。

本文建立的基于過氧化物模擬酶快速檢測過氧化氫的方法構(gòu)建簡單，只需G4-DNA 與hemin 室溫孵育；G4-DNA 可通過DNA 合成儀大量合成獲得，試劑成本不高；整個分析時間較短，反應時間僅需3～5 min，常溫下即可進行，可肉眼快速定性篩查，可通過比較標準色階卡半定量分析，也可通過光度計精確定量。該方法具有構(gòu)建簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，值得推廣應用。