HPLC法測定聚維酮碘消毒顆粒中聚維酮K30的含量

李星余，高 洋，馬亞美，孫文霞

(成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106)

2019年來，新冠病毒肺炎疫情席卷全球，導(dǎo)致大量人員死亡，因而各類消毒劑廣泛用于公共場所以及家庭的新冠病毒肺炎預(yù)防。有文獻(xiàn)研究[1-3]聚維酮碘(PVP-I)可以快速滅活冠狀病毒，并有效減少急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV-2)的醫(yī)院傳播。PVP-I是元素碘和表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)結(jié)合而成的疏松復(fù)合物(見圖1)，對于細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲等都有良好的殺滅作用，不僅可用于外科消毒，還可用于治療燒燙傷、皮膚潰瘍、婦科疾病以及預(yù)防與輔助治療性病等。

圖1 聚維酮碘結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of povidone iodine

PVP-I確切的抗菌機(jī)制尚未完全明確，應(yīng)與其能快速穿透微生物細(xì)胞壁的能力有關(guān)。Schreier等研究發(fā)現(xiàn)PVP-I對細(xì)菌細(xì)胞蛋白和酶的結(jié)構(gòu)和功能有影響，可以通過阻斷氫鍵和改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來損害細(xì)胞功能(見圖2)[4]。PVI-I的多重作用機(jī)制可以使其能夠快速殺死微生物和阻止細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)。由于其抗菌活性與一些對細(xì)胞壁的直接毒性作用相關(guān)，而不是通過特定的分子途徑(如抗生素)，耐藥性的發(fā)生可能性不大，也鮮有報(bào)道。其中PVP起載體和助溶作用，它是一種類似人體血漿蛋白的高分子聚合物，性質(zhì)穩(wěn)定，無毒、無臭、無味，具有極好的成膜、粘合、解毒降毒和緩釋的功效。PVP通過氫鍵能與碘的分子緊密絡(luò)合，有效降低了碘的腐蝕性和刺激性。目前市場上已有聚維酮碘溶液、凝膠劑、栓劑和軟膏劑等幾種劑型。筆者制備了PVP-I消毒顆粒，攜帶方便，以適用于野外受傷應(yīng)急處理。為了更好的控制本品的質(zhì)量，本研究建立了高效液相色譜法測定本品中PVP的含量。

圖2 聚維酮碘的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of povidone iodine

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters empower 3液相工作站，沃特世公司；賽多利斯BS224S型萬分之一天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-300E超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 試藥與試劑

聚維酮K30對照品(批號(hào)：BCCF-2694，由Sigma公司提供)，聚維酮碘顆粒(批號(hào)：210101，210102，210103，規(guī)格：5 g/包，四川大學(xué)提供)，乙腈為色譜純(諾爾施公司提供)；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱為Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，i.d 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(8∶92)；檢測波長為210 nm；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL；柱溫為室溫。理論板數(shù)按聚維酮K30計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液

取本品10包，混勻研細(xì)，稱取細(xì)粉80 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加水適量超聲使溶解，放至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液

取聚維酮K30對照品60 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水適量超聲使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為對照品溶液。

2.2.3 空白輔料溶液

按處方量，稱取空白輔料適量，置100 mL容量瓶中，加水適量超聲使溶解，放至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.3 方法專屬性

分別取空白輔料溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖3。結(jié)果表明：聚維酮K30的保留時(shí)間約為3.5 min，流動(dòng)相和輔料在主峰處無干擾，聚維酮K30與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，符合測定要求，本方法的專屬性良好。

圖3 空白輔料溶液(A)、聚維酮K30對照品溶液(B)和供試品溶液(C)的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of blank adjuvant solution (A)，plasdone K30 reference substance solution (B)and sample solution (C)

2.4 線性關(guān)系考察

取聚維酮K30對照品適量，精密稱定，用蒸餾水溶解制備成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的系列工作溶液。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入色譜儀，并記錄色譜圖。采用最小二乘法將峰面積(y)對溶液濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=34 459x-199.07 (r=0.999 9)，見圖4。 結(jié)果表明：在0.05～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，聚維酮K30的濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)線性圖Fig.4 Standard linear diagram

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取空白輔料，按處方量加入聚維酮K30對照品適量，用蒸餾水制成低、中、高三種濃度(0.48、0.60、0.72 mg/mL)的聚維酮K30工作也溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，按外標(biāo)法分別測定并計(jì)算低、中、高三種濃度的回收率及RSD。結(jié)果(見表1)表明高、中、低3個(gè)濃度的回收率為98.18%～101.88%，RSD為0.61%～1.34%，符合測定要求，本方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 進(jìn)樣精密度

取聚維酮K30對照品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，峰面積分別為20 398、20 541、20 419、20 455、20 353 、20 241，峰面積的RSD為0.49%(n=6)，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)：210101)，按照“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，精密量取20 μL注入色譜儀，并記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中聚維酮K30的含量。6份樣品中聚維酮K30的百分含量分別為62.65%、61.98%、 62.13%、 62.52%、63.11%、62.92%，RSD為0.70%(n=6)，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，將供試品溶液放置室溫條件下，于不同時(shí)間(0、1、2、3、4、6、8 h)分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)的峰面積分別為17 270、17 362、17 431、17 376、17 078、17 329，RSD為0.72%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h穩(wěn)定性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

分別改變色譜柱品牌(Welchrom C18：4.6 mm×200 mm，5 μm、Kromasil C18：150 mm×4.6 mm，5 μm、Hypersil C184.6 mm×250 mm，5 μm)、流動(dòng)相流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)、檢測波長(205 nm、210 nm、215 nm)，其他色譜條件不變，評估測定條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)測定結(jié)果不受影響的承受程度。結(jié)果在不同品牌色譜柱條件下，聚維酮K30的測定含量分別為62.92%、62.95%和62.32%，RSD為0.64%(n=3)；在不同流速條件下的平均含量分別為61.32%、62.32%和60.48%，RSD為1.22%(n=3)；在不同波長條件下的平均含量分別為61.20%、62.32%和60.42%，RSD為1.97%(n=3)。結(jié)果表明本方法的耐用性良好。

2.9 樣品含量測定

取3批聚維酮碘顆粒樣品，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，并按外標(biāo)法計(jì)算每批樣品中聚維酮K30的含量。結(jié)果各批樣品中含聚維酮K30的含量分別為60.90%、60.50%、61.22%。

3 結(jié) 論

隨著局部和全身性抗生素的耐藥性不斷增加，越來越多的證據(jù)表明[5]，局部皮膚感染應(yīng)優(yōu)先使用消毒劑而不是局部和全身性抗生素治療。作為局部傷口治療的替代品，消毒劑往往對微生物具有殺滅作用，并且比抗生素具有更廣泛的抗菌活性。此外，與大多數(shù)抗生素相比，消毒劑針對微生物細(xì)胞生物學(xué)各個(gè)方面的多種作用機(jī)制而降低了出現(xiàn)耐藥性的可能性。此外，世界衛(wèi)生組織最近的一項(xiàng)指南提倡在圍手術(shù)期使用良好的消毒劑[6]，同時(shí)減少全身性抗生素的使用。臨床上理想的消毒劑應(yīng)該具有以下性質(zhì)如殺菌譜廣，有效濃度低，穿透生物膜、壞死組織和焦痂的能力強(qiáng)，獲得性抗性的發(fā)生率低，和良好的局部耐受性。在傷口護(hù)理中，僅少數(shù)消毒劑能夠同時(shí)用于感染疾病的預(yù)防和治療，其中就包括碘載體和聚乙烯吡咯烷酮碘。

PVP本身無抗菌作用，在生產(chǎn)過程中PVP形成微小包腔載體，將碘離子絡(luò)合在微囊的腔體內(nèi)，形成PVP-I，從而增加碘的溶解性，同時(shí)減少揮發(fā)性。另外，PVP對細(xì)胞膜具有親和作用，能將碘直接引到細(xì)菌物胞表面，這對提高碘的抗菌活性有重要意義。目前測定PVP含量的方法包括紫外分光光度法[7]、排阻色譜法[8]等，存在靈敏度不高，操作過程繁瑣等問題，因而筆者根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，建立了HPLC-UV法測定聚維酮碘消毒顆粒中聚維酮K30的含量。取聚維酮K30對照品進(jìn)行紫外掃描(200～400 nm)，在200～230 nm波長處有末端吸收，為減少輔料和其他溶劑的干擾，選用210 nm為檢測波長。本試驗(yàn)進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)的測定聚維酮碘顆粒中聚維酮K30的HPLC法，也為其他消毒制劑或藥品中聚維酮K30的含量測定提供思路。