基于PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路探討“還神至圣湯”對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

劉潔，潘嘉，張力涵

阿爾茨海默?。ˋD）在中醫(yī)學(xué)屬于“呆病”、“健忘”、“癲病”等范疇，主要病機(jī)特點(diǎn)是由于年邁體虛，久病不復(fù)等導(dǎo)致五臟精氣虛衰，痰瘀阻痹，漸使腦髓虧虛，腦髓失養(yǎng)，神機(jī)失用所致。其病位在腦，歸于心，與五臟功能失調(diào)密切相關(guān)。根據(jù)中醫(yī)虛者補(bǔ)之，實(shí)則瀉之的原則，補(bǔ)益虛損，解郁散結(jié)為治則。還神至圣湯出自《辨證錄》卷四，處方記載為，人參一兩，白術(shù)一兩，茯神5錢(qián)、生棗5錢(qián)，廣木香3錢(qián)、制天南星3錢(qián)、荊芥3錢(qián)，甘草1錢(qián)、良姜1錢(qián)、附子1錢(qián)、枳殼1錢(qián)，菖蒲5分。主治呆病，具有開(kāi)郁逐痰，健胃通氣之功效。本研究采用大鼠海馬區(qū)注射Aβ25-35淀粉酶建立AD模型，研究還神至圣湯對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響、探討其可能的作用機(jī)制，為臨床上本方劑用于治療AD患者提供可靠的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

根據(jù)《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》考證的明清時(shí)期一兩約36.8 g，一錢(qián)約3.68 g，一分約0.37 g折算，參考《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）第一部推薦處方的用法用量并結(jié)合臨床醫(yī)師用藥經(jīng)驗(yàn)，將還神至圣湯處方調(diào)整如下：人參5 g，白術(shù)20 g，茯神20 g、生棗20 g，廣木香3 g、制天南星3 g、荊芥9 g，甘草3 g、良姜3 g、附子3 g、枳殼3 g，菖蒲10 g。處方共計(jì)藥材102 g為成人一天用量。依據(jù)陳奇主編《中藥藥理研究方法學(xué)》（1993年）第1版附錄二“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量換算”，以及黃繼漢發(fā)表的《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》，設(shè)定本實(shí)驗(yàn)研究藥物低、中、高劑量分別為10.2、20.4、40.8 g·kg-1，相當(dāng)于臨床劑量6倍，12倍，24倍。上述藥材均為免煎顆粒，購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，生產(chǎn)商：四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，50只，雄性♂，180-200 g，購(gòu)自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2018-19，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(川)2018-100。所有大鼠飼養(yǎng)于符合SPF的環(huán)境中（溫度20±2℃、濕度50%-70%、晝夜各12 h）。本研究經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，決議編號(hào)SYLL(2022)-054，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施過(guò)程中嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則。

1.3 試劑

AKT，P-AKT，GSK3β，PI3K（abcam，ab179463，ab192623，ab280376，ab191606）。P-GSK3β(ser9)（CST， 5558T）。BCA蛋白定量試劑盒（Thermo， PICPI23223）。Aβ25-35淀粉酶(Sigma， 0000113656）-20℃避光保存，使用前溶解在0.9%的無(wú)菌的生理鹽水，配成濃度2.0 g.L-1，37℃孵育1周，使其成聚集態(tài)，然后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ彀捅韧租c(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，WS20051129)。

1.4 儀器

68000系列大鼠腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；78001微型手持顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟公司， WMT-100)；電泳儀(美國(guó)BIORAD，mini protean 3 cell)。電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)HOEFER，TE77XP）；酶標(biāo)儀（美國(guó)PE, Victor Nivo）；成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-5200）。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物分組建模與給藥

50只SD大鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，設(shè)正常對(duì)照A組、模型對(duì)照B組、實(shí)驗(yàn)藥物低劑量10.2 g.kg-1（C組）、中劑量20.4 g.kg-1（D組）、高劑量40.8 g.kg-1（E組）。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除正常對(duì)照A組外，其余各組動(dòng)物按如下操作建立老年癡呆AD大鼠模型。各組動(dòng)物腹腔注射60 mg.kg-1戊巴比妥鈉麻醉，將麻醉大鼠固定于腦立體定位儀，剪開(kāi)頭部皮膚，暴露頭骨。于前囟后3.5 mm，中線(xiàn)旁開(kāi)2 mm，硬腦膜下2.9 mm定位雙側(cè)海馬，并用顱骨鉆鉆孔。除假手術(shù)組外，采用微量注射泵于5 min內(nèi)緩慢注射5 μL（10 μg）老化1周的Aβ25-35淀粉樣蛋白溶液于大鼠右側(cè)大腦海馬組織，假手術(shù)組注射等量無(wú)菌生理鹽水。采用齒科水門(mén)汀封閉顱骨，縫合皮膚。每日連續(xù)腹腔注射青霉素鈉10萬(wàn)U.只-1，連續(xù)3日，防止感染。模型建立后14天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。模型建立第2天，各組動(dòng)物常規(guī)灌胃給藥，每日按照100 g.mL-1常規(guī)灌胃給予大鼠，連續(xù)給藥30天，正常對(duì)照組、模型組給予等體積生理鹽水。每周對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠稱(chēng)重1次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥體積。給藥結(jié)束后24 h，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉腹股溝放血處死，并剖取大鼠大腦的左右側(cè)海馬組織，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)分為前5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)和第 6 d 的空間探索實(shí)驗(yàn)。將水迷宮圓形水池分為四個(gè)象限， 逃生平臺(tái)置于其中一個(gè)象限內(nèi)。第 1 d 至第 5 d 進(jìn)行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，每天上午和下午的固定時(shí)間訓(xùn)練一次， 將大鼠面向池壁從除平臺(tái)之外的其它三個(gè)象限隨機(jī)放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，大鼠找到平臺(tái)后或120 s內(nèi)找不到平臺(tái)（潛伏期記為120 s），則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)到平臺(tái)，在平臺(tái)上停留20 s。連續(xù)訓(xùn)練4天觀察記錄大鼠從入水到找到安全平臺(tái)所需的潛伏時(shí)間，每日以大鼠2次訓(xùn)練的潛伏期平均值作為當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)。實(shí)驗(yàn)第5 d，進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，記錄每只大鼠從入水到找到平臺(tái)所需的潛伏期時(shí)間。實(shí)驗(yàn)第6 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤掉安全平臺(tái)，大鼠從任一入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。

2.3 免疫印跡Western blot實(shí)驗(yàn)

將大鼠右側(cè)海馬組織勻漿加入RAPI裂解液至細(xì)胞完全裂解后充分震蕩。裂解后的樣品于4℃，12000 r·min-1離心15 min，取上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。根據(jù)BCA方法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白變性。按照上樣量為15 μg蛋白，計(jì)算上樣量。電泳結(jié)束后用PVDF膜轉(zhuǎn)印。5%脫脂奶粉液封閉1 h，一抗，根據(jù)說(shuō)明書(shū)稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h或4℃孵育過(guò)夜。 二抗，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照1:1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次5 min。滴加 ECL 工作液并曝光拍照， 用 Image J 軟件定量分析目的蛋白條帶，進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.5 結(jié)果

2.5.1 還神至圣湯對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 Mor-ris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠平臺(tái)逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間的百分比明顯減少( P＜0.05) 。與模型對(duì)照組相比，還神至圣湯（相當(dāng)于原生藥）10.2、20.4、40.8 g.kg-1劑量組平臺(tái)逃避潛伏期明顯減少，穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比明顯增加( P＜0.05)。說(shuō)明還神至圣湯各劑量可改善由Aβ25-35淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見(jiàn)表 1，表2。

表1 還神至圣湯對(duì)AD大鼠平臺(tái)逃避潛伏期的影響（± s，n=10）

表1 還神至圣湯對(duì)AD大鼠平臺(tái)逃避潛伏期的影響（± s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組△P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

平臺(tái)逃避潛伏期（s）D1D2D3D4D5正常對(duì)照組NS57.8±16.050.6±14.841.3±9.732.9±10.926.3±8.6模型對(duì)照組NS69.9±5.5△65.10±6.6△57.4±15.2△46.90±11.5△38.2±10.6△藥物低劑量組10.261.5±8.4*52.9±13.5*43.1±8.5*33.4±12.3*27.5±6.5*藥物中劑量組20.461.1±8.1*53.5±14.2*44.00±7.8*32.9±11.7*28.4±10.2*藥物高劑量組40.853.5±7.2*52.60±15.9*43.20±12.0*33.1±13.2*27.1±7.8*組別劑量g.kg-1

表2 還神至圣湯對(duì)AD大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比的影響（± s，n=10）

表2 還神至圣湯對(duì)AD大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比的影響（± s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組△P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別劑量g.kg-1穿越平臺(tái)次數(shù)/n 目標(biāo)象限停留時(shí)間/%正常對(duì)照組NS5.2±1.536.8±11.4模型對(duì)照組NS2.8±1.6△22.2±6.4△藥物低劑量組10.24.4±1.0*29.3±8.1*藥物中劑量組20.44.5±1.4*29.7±9.1*藥物高劑量組40.84.3±1.2*30.1±8.4*

2.5.2 還神至圣湯對(duì)AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3 β、p-GSK3β蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組PI3K、p-Akt、p-GSK3β在ser9位點(diǎn)蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）,而AKT、GSK3β蛋白含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與模型對(duì)照組比較，還神至圣湯各劑量組AKT、GSK3β蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）; 而20.4 、40.8 g.kg-1劑量組PI3K、p-Akt蛋白含量增加明顯，20.4 g.kg-1劑量組p-GSK3β在ser9位點(diǎn)蛋白含量也明顯增加（P＜0.05）。模型對(duì)照組p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值明顯降低（P＜0.05），而20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1劑量組比值相對(duì)模型對(duì)照組有明顯增加（P＜0.05），表明還神至圣湯中、高劑量可上調(diào)由Aβ25-35淀粉樣蛋白引起的AD模型大鼠海馬組織PAkt、p-GSK3β在ser9位點(diǎn)蛋白含量表達(dá)（表3、4、圖1-3）

圖1 PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖3 各組大鼠GSK-3β磷酸化/GSK-3β比較

表3 還神至圣湯對(duì)AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影響（± s，n=10）

表3 還神至圣湯對(duì)AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影響（± s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

p-GSK3β/β-actin正常對(duì)照組NS0.496±0.0090.852±0.0110.446±0.0270.844±0.0450.394±0.030模型對(duì)照組NS0.377±0.015△0.892±0.0720.287±0.015△0.843±0.0260.289±0.055△藥物低劑量組10.20.389±0.0090.860±0.0200.317±0.0370.838±0.0550.397±0.156藥物中劑量組20.40.439±0.035*0.868±0.0200.382±0.056*0.752±0.0960.410±0.134藥物高劑量組40.80.452±0.029*0.849±0.0070.396±0.034**0.845±0.0030.441±0.077*組別劑量g.kg-1PI3K/β-actinAkt/β-actinp-Akt/β-actinGSK3β/β-actin

表4 還神至圣湯對(duì)AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影響（± s，n=10）

表4 還神至圣湯對(duì)AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影響（± s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，*P＜0.01

組別劑 量g.kg-1p-Akt/AKTp-GSK3β/GSK3β正常對(duì)照組NS0.533±0.0390.461±0.011模型對(duì)照組NS0.328±0.013△0.345±0.056△藥物低劑量組10.20.356±0.0360.517±0.160藥物中劑量組20.40.440±0.064*0.560±0.103*藥物高劑量組40.80.476±0.040**0.495±0.092*

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一種以進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是中老年癡呆的主要原因。臨床上以近似記憶力下降為明顯特征，并逐步發(fā)展為注意力、計(jì)算力、執(zhí)行力等下降的全面癡呆，同時(shí)伴有精神人格改變及日常生活能力下降，給患者、家庭及社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重困擾及負(fù)擔(dān)。隨著全球人口老齡化的快速進(jìn)展，AD的發(fā)病率逐年增加。據(jù)2021年《中國(guó)阿爾茨海默病報(bào)告2021》，我國(guó)AD發(fā)病率已超過(guò)1000萬(wàn)人口，全球超5000萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2050年，全球AD患者數(shù)量將上升至1.52億。

目前比較認(rèn)可AD的發(fā)病機(jī)制為：①Tau蛋白異常聚集，成對(duì)的螺旋狀纖維轉(zhuǎn)化為 NFTs，微管穩(wěn)定性降低導(dǎo)致突觸丟失，神經(jīng)元功能受損，最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)元死亡。②大腦海馬區(qū)β-淀粉樣蛋白在細(xì)胞外沉積形成老年斑SP。③突觸連接丟失及突觸功能異常；④相關(guān)基因?qū)W說(shuō)，如APP、PSEN1/2、ApoE基因等；⑤免疫異常學(xué)說(shuō)，大腦中過(guò)度的炎性反應(yīng)激活引起神經(jīng)元損害和死亡；⑥早期細(xì)胞因子功能障礙。[1,2]

還神至圣湯出自《辨證錄》卷四，主治呆病，具有開(kāi)郁逐痰，健胃通氣之功效。方中諸藥合用，扶正祛邪，標(biāo)本兼顧，為呆病治療之良方。本課題基于方劑治療呆病的中醫(yī)理論及臨床經(jīng)驗(yàn)，研究方劑對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究表明，還神至圣湯10.2 g.kg-1、20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1劑量組可明顯減少AD模型動(dòng)物平臺(tái)逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比 ( P＜0.05)，表明藥物可改善由 Aβ25-35淀粉樣蛋白致AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

PI3K /Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)抗凋亡，參與細(xì)胞增殖、分化的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Akt是PI3K信號(hào)通路下游靶分子，在PI3K依賴(lài)激酶( PI3K-dependent kinase，PDK) 的作用下，Akt的磷酸化被激活調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移細(xì)胞的生存功能，調(diào)控下游蛋白。GSK3β是Akt主要下游靶分子之一，也是Tau蛋白磷酸化關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶[3,4]，GSK-3β在Ser9位點(diǎn)磷酸化能抑制Tau蛋白磷酸化，從而抑制 Aβ的聚集[5]。PI3K /Akt /GSK3β信號(hào)通路與AD神經(jīng)元的形態(tài)及功能結(jié)構(gòu)改變具有相關(guān)性，并能夠維持神經(jīng)干細(xì)胞存活，影響AD的發(fā)生和發(fā)展[7,8]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位點(diǎn)蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）, 而AKT、GSK3β蛋白含量無(wú)明顯變化（P＞0.05），導(dǎo)致Aβ聚集增加，模型動(dòng)物腦內(nèi)PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路活性明顯降低。還神至圣湯20.4、40.8 g.kg-1中、高劑量可上調(diào)PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位點(diǎn)蛋白含量，從而上調(diào)p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β的比值，抑制Aβ聚集，降低其神經(jīng)毒性作用。

綜上所述，還神至圣湯可改善 AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制與PI3K /Akt /GSK3β信號(hào)通路有關(guān)，但更具體的機(jī)制還有待更加深入的研究。