紅景天苷對離體血管的張力作用研究

陳潔，張雅婷，安文喬，陳小睿，張藝，張三印，孟憲麗，王小博

血管張力是血管類疾病診斷的重要指標(biāo)，血管張力失調(diào)是血管類疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程，也是此類疾病繼續(xù)加重的主要原因[1]。心血管類疾病是導(dǎo)致人類死亡的元兇之一。其具有高患病率、高致殘率、高死亡率的特點[2]，嚴(yán)重威脅了人類健康。此類疾病侵襲人體各類血管，其中腦動脈、頸動脈、冠脈、主動脈是主要的罹患部位。因此針對血管張力變化開發(fā)的藥物和治療途徑成為解決血管類疾病的突破口[3]。近年來，傳統(tǒng)藏藥紅景天在防治心血管疾病的醫(yī)療運用中取得了良好的成效[4,5,6]。因此進(jìn)一步探究紅景天防治心血管疾病的作用機(jī)制具有著重要的臨床意義。本文旨在探討紅景天的主要活性成分紅景天苷對不同組織離體血管張力的藥理作用以及引起血管最大舒縮的濃度。

1 材料

1.1 藥物

紅景天苷是藏藥紅景天的提取物，為其有效成分之一，分子式為C14H20O7。本實驗所用紅景天苷（98%，貨號S25475）購自上海源葉生物科技有限公司。紅景天苷溶液配制如下：

紅景天苷溶液制備 溶劑：PSS溶液。溶質(zhì)濃度：SAL（1500 μg·mL-1）。

1.2 動物

正常雄性Sprague-Dawley大鼠，5～7周齡，220～250 g，購自成都恩斯維爾生物科技有限公司。許可證號SCXK(湘)2019-0004。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在22～27℃，相對濕度維持在45%～55%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。動物在飼養(yǎng)一周后開始實驗。

1.3 試劑

分析純碳酸氫鈉（ N a H C O3， 批號：2020061001）；分析純葡萄糖（D-glucose，批號：20070115）；分析純磷酸二氫鉀（KH2PO4，批號：20160517）；分析純氯化鈣（CaCl2，批號：2020080301）；分析純氯化鎂（MgCl2，批號：201604068）；分析純氯化鈉（NaC，l批號：2015021401）；均購自成都市科龍化工試劑廠；4-羥基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號：S872）購自山東西亞化學(xué)股份有限公司。9,11-二脫氧基-11a,-亞甲基環(huán)氧前列腺素（U46619，批號：D8174）購自成都瑞信生物技術(shù)有限公司。本實驗所用各溶液配制如下：

PSS溶液制備 溶劑：超純水。溶質(zhì)濃度：NaCl（6891.2 μg·mL-1）, KCl（350.15 μg·mL-1）,CaCl2（277.5 μg·mL-1）, KH2PO4（163.3 μg·mL-1）,MgCl2（244 μg·mL-1）, NaHCO3（2100 μg·mL-1）,D-glucose（1982.2 μg·mL-1）和HEPES（1191.5 μg·mL-1），PH=7.4。

KPSS溶液制備 溶劑：超純水。溶質(zhì)濃度：NaCl（467.2 μg·mL-1）, KCL（4476 μg·mL-1） ,CaCl2（277.5 μg·mL-1）, KH2PO4（163.3 μg·mL-1）,MgCl2·6H2O（244 μg·mL-1）, NaHCO3（2100 μg·mL-1）, D-glucose（1980 μg·mL-1）和HEPES（1191.5 μg·mL-1）， PH=7.4[7]。

1.4 實驗設(shè)備

DZKW-S-4型水浴鍋（上海躍進(jìn)有限公司）；BSA124S-CW型Sartorius精密天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；離體血管620M微血管張力測定系統(tǒng)（丹麥DMT公司）；Power Lab生物信號采集分析系統(tǒng)及張力換能轉(zhuǎn)換器（美國ADinstruments公司）；SZX2-ILLT解剖顯微鏡（日本Olympus公司）；PHS-3C精密pH測定儀（衢州艾普計量儀器實力供應(yīng)商）；04400506實驗室純水系統(tǒng)（Millipore公司）；可調(diào)式移液槍（Thermo Fisher Scientific公司）；MLT0201型張力換能器、Labchart專業(yè)軟件（埃德儀器國際貿(mào)易有限公司）。

2 方法

2.1 分組給藥

選取SD大鼠大腦中動脈、基底動脈、頸動脈、肺動脈、冠狀動脈、腹主動脈、胸主動脈、腸系膜動脈、股動脈，各6段制備血管環(huán)。分別設(shè)置空白組，實驗組在浴槽內(nèi)進(jìn)行不同濃度的紅景天苷給藥處理：0.3，1.5，3，6，9，15，30，60.1，120.1，240.2，480.5，961，1111.1，1261.2，1411，1561，1711，1861 μg·mL-1。如果加藥給到1861 μg·mL-1，血管仍有明顯收縮，需持續(xù)給藥到血管無明顯變化。若加到1861 μg·mL-1仍無明顯效果，可直接加到2336 μg·mL-1。

2.2 大鼠動脈環(huán)制備

2.2.1 腦動脈環(huán)制備 取健康雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后快速取出完整腦組織放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)裝滿4℃ PSS 溶液。將腦組織仰放，找到大腦中動脈和基底動脈。剪出2 mm的血管環(huán)、用兩根直徑25 μm，長1.5 cm的鎢絲穿過血管環(huán)。將血管環(huán)放入鉗口并分別固定在DMT浴槽內(nèi)同側(cè)的2個螺絲上。再將浴槽放在DMT上，調(diào)節(jié)血管張力后平衡30分鐘。實驗過程中浴槽內(nèi)溶液持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體，溫度控制在37℃。全程使用生物 powerlab機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄血管張力。

2.2.2 冠狀動脈環(huán)制備 取健康雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后快速取出心臟放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)裝滿4℃ PSS 溶液并用針灸針固定心臟的位置。在顯微鏡下小心剔除血管周圍組織，依次分離出冠脈的室間隔支、室壁支和前降支，剪出2 mm的血管環(huán)。余下步驟同上。

2.2.3 肺動脈環(huán)制備 取健康雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后快速取肺組織放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)裝滿4℃ PSS 溶液并用針灸針固定肺組織的位置。在顯微鏡下小心剔除血管上的脂肪分離出動脈血管。剪出2 mm的血管環(huán)，余下步驟同上。

2.2.4 腸系膜動脈環(huán)制備 取健康雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后快速剪取一段腸組織放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)裝滿4℃ PSS 溶液并用針灸針固定腸的位置。在顯微鏡下小心剔除腸系膜血管上的脂肪分離出動脈血管。剪出2 mm的血管環(huán)，余下步驟同上。

2.2.5 大動脈環(huán)制備 取健康雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后快速取出一截胸主動脈放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)裝滿4℃ PSS 溶液。注意被鑷子夾取的那部分血管活性較差，需在培養(yǎng)皿中剪去。剪出2 mm的血管環(huán)。余下步驟同上。頸總動脈、腹主動脈、股動脈操作同胸主動脈，上述所取血管如圖1所示。

圖1 實驗所取血管示意圖

2.3 血管環(huán)的活性、穩(wěn)定性驗證

待上述血管環(huán)張力穩(wěn)定后，將浴槽內(nèi)的PSS溶液更換成5 mL KPSS溶液。維持10 min后用5 mL PSS溶液清洗三次每次間隔3 min。待血管環(huán)張力再次穩(wěn)定后將溶液更換成5 mL KPSS溶液，維持10 min。觀測血管收縮曲線，第一次用KPSS溶液刺激，血管收縮應(yīng)大于2毫牛，表示血管活性良好。第二次用KPSS溶液刺激，血管收縮的幅度相差不超過10% 說明血管穩(wěn)定性良好?？捎糜谙乱徊綄嶒灐?/p>

2.4 血管張力測定

使用氯化鉀60 mmol·L-1收縮血管，待血管收縮達(dá)到坪臺后開始給藥。實驗組：在浴槽內(nèi)累積加入不同濃度的SAL。對照組：SAL 0 μg·mL-1。以高鉀溶液（4476 μg·mL-1）所致的收縮為100%，計算SAL的血管舒張強(qiáng)度，并計算抑制率。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±S表示，t檢驗法用于兩組之間比較，單因素方差分析法用于多組間比較。用Graph Pad Prism 6計算IC50值。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對大腦中動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的大腦中動脈（MCA）張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖2（C）所示。Sal對KCl預(yù)收縮MCA表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，當(dāng)給藥濃度為60.1 μg·mL-1時，Sal對MCA造成最大收縮，最大收縮率為65.43±17.89%（P＜0.01）；濃度大于961 μg·mL-1后，濃度依賴性舒張MCA，并在1261 μg·mL-1時達(dá)到最大舒張率49.01%±22.04%（P＜0.05）,如圖2（A）所示。其IC50值為1241.4 μg·mL-1，如圖2（B）所示。

圖2 紅景天苷對大腦中動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.2 紅景天苷對大腦基底動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的大腦基底動脈（BA）張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖3（C）所示。與空白對照組比較。Sal對KCl預(yù)收縮BA表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，當(dāng)給藥濃度為9 μg·mL-1時，Sal對BA造成最大收縮，最大收縮率為20.09±6.11%（P＜0.01）；給藥濃度濃度達(dá)到961 μg·mL-1后，濃度依賴性舒張BA，最大舒張率為96.47±7.90%（P＜0.01）。如圖3（A）所示。其IC50值為1230.3 μg·mL-1，如圖3（B）所示。

圖3 紅景天苷對大腦基底動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.3 紅景天苷對頸總動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對U46619（3.333×10-2 μg·mL-1）預(yù)收縮的頸總動脈（CCA）張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖4（C）所示。與空白對照組比較，Sal對CCA表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用。Sal對頸總動脈雖表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，但其作用不強(qiáng)，且與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。如圖4（A）所示。其IC50值為11498.7 μg·mL-1，如圖4（B）所示。

圖4 紅景天苷對頸總動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.4 紅景天苷對肺動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的肺動脈（PA）張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖5（C）所示。與空白對照組比較，Sal對PA表現(xiàn)出濃度依賴性舒張血管的作用。當(dāng)給藥濃度達(dá)到480.5 μg·mL-1以上時有顯著性差異，當(dāng)給藥濃度為2336 μg·mL-1時，Sal對PA造成最大舒張，最大舒張率為99.20±1.79%

圖5 紅景天苷對肺動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.5 紅景天苷對冠脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的冠脈張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖6（C）所示。與空白對照組比較，Sal對冠脈表現(xiàn)出濃度依賴性舒張血管的作用。當(dāng)給藥濃度達(dá)到480.5 μg·mL-1以上時有顯著性差異，當(dāng)給藥濃度為1111.1 μg·mL-1時，Sal對冠脈造成最大舒張，最大舒張率為100%（P＜0.01）；如圖6（A）所示。其IC50值為125.7 μg·mL-1，如圖6（B）所示。

圖6 紅景天苷對冠脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.6 紅景天苷對胸主動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的胸主動脈張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖7（C）所示。與空白對照組比較，Sal對胸主動脈表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，但收縮作用不強(qiáng)。給藥濃度為 60.1 μg·mL-1時，產(chǎn)生最大收縮，最大收縮率為 16.08%±3.96%（P＜0.01）；濃度達(dá)到 961 μg·mL-1后，表現(xiàn)出濃度依賴性舒張作用，最大舒張率可達(dá)到 97.23%±1.67%（P＜0.01）。如圖7（A）所示。其IC50值為1488.9 μg·mL-1，如圖7（B）所示。

圖7 紅景天苷對胸主動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.7 紅景天苷對腹主動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的腹主動脈張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖8（C）所示。與空白對照組比較，低濃度時（0.3-6 μg·mL-1）Sal對腹主動脈表現(xiàn)出較弱的收縮作用；隨著濃度增大，其對腹主動脈表現(xiàn)出較強(qiáng)的舒張作用其舒張血管的趨勢基本呈濃度依賴性，最大舒張率為87.50%±12.15%（P＜0.01）。如圖8（A）所示。其IC50值為759.3 μg·mL-1，如圖8（B）所示。

圖8 紅景天苷對腹主動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.8 紅景天苷對腸系膜動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的腸系膜動脈張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖9 (C)所示。與空白對照組比較，給藥濃度為0.3-480.5 μg·mL-1時，Sal對腸系膜動脈表現(xiàn)為收縮血管作用；之后隨著濃度增大，作用表現(xiàn)為濃度依賴性舒張，并在2011 μg·mL-1時達(dá)到最大舒張86.06%±11.48%（P＜0.01）；如圖9（A）所示。其IC50值為1491 μg·mL-1，如圖9（B）所示。

圖9 紅景天苷對腸系膜動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

3.9 紅景天苷對股動脈的作用

紅景天苷（Sal）組對KPSS溶液預(yù)收縮的股動脈張力變化的濃度-效應(yīng)記錄圖，如圖10 (C)所示。與空白對照組比較，給藥濃度為0.3-480.5 μg·mL-1時，Sal對股動脈表現(xiàn)為收縮血管作用；之后隨著濃度增大，作用表現(xiàn)為濃度依賴性舒張，并在2011 μg·mL-1時達(dá)到最大舒張90.08%±14.15%（P＜0.01）；如圖10（A）所示。其IC50值為1227 μg·mL-1，如圖10（B）所示。

圖10 紅景天苷對股動脈的張力調(diào)節(jié)（±S，n=6）

4 討論

傳統(tǒng)藏藥紅景天生長于高海拔（1600～4000 m）、高寒和缺氧地區(qū)。藏醫(yī)藥典籍《四部醫(yī)典》也有關(guān)于紅景天的記載，言其“性平、味澀、善潤肺、能補(bǔ)腎、理氣養(yǎng)血。主治周身乏力、胸悶、惡心、體虛等癥。《中華抗衰老醫(yī)學(xué)》記載紅景天：味甘澀性平，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、補(bǔ)腎、壯陽、強(qiáng)心、補(bǔ)血、活血等功效，用于治療貧血、低血壓、自主性血管張力不足，老年心功能衰竭等癥。提示紅景天可能調(diào)節(jié)血管張力。紅景天苷（salidroside, SAL）是傳統(tǒng)藏藥紅景天的主要活性成分。具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗代謝失調(diào)和神經(jīng)保護(hù)[8,9]的作用。已有研究證實紅景天苷可以通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α 基因表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮收縮 因子內(nèi)皮素-1 的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮舒張因子 NO 合酶表達(dá)，從而改善低氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮舒縮功能障礙[10]。但紅景天苷對不同類型的血管的調(diào)節(jié)作用尚不明確。為了確定紅景天苷對血管張力調(diào)節(jié)的作用，我們選擇了動脈血管中九種代表性血管進(jìn)行研究。

高鉀溶液（4470 μg·mL-1的KCL）是誘導(dǎo)離體血管收縮常用的物質(zhì)，為了觀察紅景天苷對收縮狀態(tài)下動脈條張力的影響，我們采用高鉀溶液預(yù)收縮血管條。實驗結(jié)果：（1）根據(jù)IC50顯示紅景天苷對血管舒張作用效果從強(qiáng)到弱：冠狀動脈＞腹主動脈＞股動脈＞肺動脈＞基底動脈＞大腦中動脈＞胸主動脈＞腸系膜動脈＞頸總動脈。（2）SAL對腦中動脈、基底動脈、胸主動脈、腹主動脈、腸系膜動脈、股動脈有雙向調(diào)節(jié)作用，隨著SAL給藥濃度增加，上述動脈均有收縮后舒張的趨勢。SAL濃度依賴性舒張肺動脈、冠狀動脈血管。

血管張力調(diào)節(jié)主要有內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性兩種方式[11]。血內(nèi)皮依賴性調(diào)節(jié)是指可以通過內(nèi)皮細(xì)胞控制釋放血管張力調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)血管張力；如釋放型利鈉肽等調(diào)節(jié)血管舒張，釋放內(nèi)皮素和血栓素A2 等來控制血管收縮。非內(nèi)皮依賴性可以通過刺激血管，調(diào)節(jié)血管平滑肌上的鈣、鉀離子通道來控制血管收縮。有關(guān)紅景天苷對血管作用的具體機(jī)制，我們將在隨后的研究中采用一氧化氮合酶抑制劑、鈣離子通道阻滯劑、鉀離子通道阻滯劑等系列工具藥進(jìn)行進(jìn)一步深入探討。