姜黃素超分子納米粒的制備工藝研究及表征

韓曉琴，傅超美，高飛,

姜黃素（CUR）是從天然姜科植物的根莖中提取的一種親脂性多酚類化合物，具有多種生物活性，目前已引起了廣泛的關注。研究表明其具有抗炎[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]和促進傷口愈合[4]等多種藥理作用，已被認為是一種有前途的預防和治療藥物。美國食品和藥物管理局（FDA）已將CUR列為公認的安全（GRAS）物質[5]。然而，CUR存在水中溶解性差、生物利用度較低以及在體內易被代謝等缺陷，使其作為治療藥物的開發(fā)受到一系列的挑戰(zhàn)[6,7]。

納米粒子由于其體積小，比表面積大，相較于傳統(tǒng)的給藥系統(tǒng)有很大的優(yōu)勢。適當的納米策略可以保護藥物過早被代謝，控制藥物的釋放速率，通過靶向遞送使藥物定位至靶部位以及特異性攝取等[8]。因此，納米策略對于CUR的開發(fā)具有一定的潛力。近年來，基于超分子結構和功能上的優(yōu)勢，超分子納米顯示出將主動和被動靶向策略相結合的巨大潛力。β-環(huán)糊精（β-CD）是一種常用的超分子納米體系，其具有原料易得，成本低，毒性低和生物相容性好等優(yōu)點[9]。更重要的是，β-CD的空腔可以與多種客體分子進行結合，采用將功能分子修飾在客體分子上的方式即可利用主客體相互作用方便地使環(huán)糊精載藥體系獲得靶向功能[10,11]。

因此，基于羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）的超分子體系，通過主客體作用將配體D-甘露糖（Man）修飾于客體分子金剛烷（ADA）上，使其獲得主動靶向功能[12]。此外，在超分子體系中引入pH/ROS敏感材料（聚（β-氨基酯）（PBAE）和硫代羥基乙酸酐），使其獲得雙重響應性釋放功能[13,14]。前期已成功合成該超分子聚合物材料并進行了表征，本研究將使用該超分子聚合物材料對CUR進行包載，篩選出最佳制備工藝和處方條件，以用于后續(xù)進一步的研究。

1 實驗材料

1.1 藥品和試劑

姜黃素（＞98%, MW=368.38）購自上海泰坦科技股份有限公司，批號：P1671481；二甲基亞砜（99.7%）購自北京百靈威科技有限公司，批號：L870W27；透析袋（MW=1000 Da）購自上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Litesizer 500激光粒度儀（Anton Paar，奧地利），magnetic stirrer WH610D型磁力攪拌器（德國WIGGENS公司），KQ-100E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司），Sartorius CPA225D型十萬分之一天平（德國賽多利斯公司），UPS 臺上式型純水機（四川優(yōu)普有限公司）。

2 實驗方法

2.1 Man-CUR NPs的制備及處方優(yōu)化

2.1.1 Man-CUR NPs制備方法的選擇 本實驗采用溶劑揮發(fā)法和納米沉淀法分別制備Man-CUR NPs，通過粒徑、包封率和載藥量等指標確定Man-CUR NPs的最佳制備工藝。

（1） 溶劑揮發(fā)法

將聚合物（HPβCD-S-PBAE）和Man-ADA分別溶于2.5 mL及0.5 mL甲醇中，超聲溶解，并一同緩慢滴入20 mL純水中，超聲5 min，得到載體材料。隨后將5 mg CUR溶于1 mL 甲醇中，然后滴入載體材料中，形成納米體系。持續(xù)攪拌5 h使甲醇完全揮發(fā)，得到納米體系。此外，游離 CUR 通過0.8 μm的微孔膜過濾去除。以上所有步驟都是在嚴格避光條件下進行的。

（2） 納米沉淀法

將HPβCD-S-PBAE和Man-ADA分別溶于2 mL和0.5 mL DMSO中，并一同緩慢滴入20 mL純水中，超聲5 min，得到載體材料。將5 mg CUR溶于1 mL DMSO中，然后緩慢滴入混合相中，形成納米體系。在室溫下攪拌40 min，然后將溶液轉移到透析袋(MW=1000 Da)中，在去離子水中透析4 h以除去DMSO。從而得到了 Man-CUR-NPs分散體系。此外，游離 CUR 通過0.8 μm 的微孔膜過濾去除。以上所有步驟都是在嚴格避光條件下進行的。

2.1.2 Man-CUR NPs制備工藝單因素考察

（1） 攪拌轉速

在制備Man-CUR NPs時，固定其他因素不變的條件下，改變攪拌轉速，分別選用攪拌轉速為200、400、600 r/min制備Man-CUR NPs，隨后分別測定粒徑、包封率和載藥量，以確定Man-CUR NPs的最佳攪拌轉速。

（2） 油水比

在制備Man-CUR NPs時，固定其他因素不變的條件下，改變油水比，分別選用油水比為1∶4、1∶5、1∶6來制備Man-CUR NPs，隨后分別測定粒徑、包封率和載藥量，以確定制備Man-CUR NPs的最佳油水比。

2.1.3 Man-CUR NPs制備處方單因素考察

（1） HPβCD-S-PBAE的用量

在制備Man-CUR NPs時，固定其他因素不變的條件下，改變HPβCD-S-PBAE的用量，分別選用HPβCD-S-PBAE用量為20、30、40 mg來制備Man-CUR NPs，隨后分別測定粒徑、包封率和載藥量，以確定制備Man-CUR NPs的最佳HPβCD-S-PBAE用量。

（2） CUR投藥量

在制備Man-CUR NPs時，固定其他因素不變的條件下，改變CUR的投藥量，分別選用CUR的投藥量為3、6、9 mg來制備Man-CUR NPs，隨后分別測定粒徑、包封率和載藥量，以確定 Man-CUR NPs的最佳投藥量。

2.2 Man-CUR NPs理化性質表征

2.2.1 Man-CUR NPs的粒徑、電位和形貌表征 使用粒度分析儀 Lite sizer 500的動態(tài)光散射（DLS）測量Man-CUR NPs的平均流體動力學粒徑（nm）、多分散指數（PDI）Zeta電位（mV）。利用透射電子顯微鏡（TEM，JEM 1200X，JEOL，日本）觀察Man-CUR NPs的形貌。

2.2.2 Man-CUR NPs中CUR的含量測定

（1） 建立CUR含量測定方法

①f56b4色譜條件

采用HPLC進行檢測。色譜儀：LC-45202-46，島津，京都，日本；色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6×250 mm），以乙腈-4%冰乙酸（48：52）為流動相；檢測波長為430 nm；柱溫：25℃；流速：1 mL/min。

②f56b4供試品溶液的制備

精密量取Man-CUR NPs納米溶液200 μL，置于5 mL離心管中，加入甲醇1.8 mL，超聲 10 min解除納米的包裹狀態(tài)，再渦旋5 min，使CUR完全釋放。將溶液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

③f56b4線性范圍

精密稱定CUR適量，加甲醇溶解，并定容至10 mL，超聲使其充分溶解混勻，得到 0.5 mg·mL-1的CUR母液。采用二倍稀釋法分別得到一系列濃度溶液，分別進樣10 μL檢測峰面積。

④f56b4方法學研究和含量測定

參照《中國藥典》 2020年版第四部 9101分析方法驗證指導原則，對穩(wěn)定性、精密度、重復性和加樣回收率進行考察。使用該方法檢測各個樣品中CUR的含量。

（2） Man-CUR NPs包封率和載藥量的測定

采用最佳制備工藝和處方制備Man-CUR NPs，通過 HPLC檢測Man-CUR NPs的包封率以及載藥量。在HPLC分析前，用甲醇溶解NPs，以破壞納米粒結構釋放CUR。每個樣品重復3次測量。再結合標準曲線和公式得出Man-CUR NPs的包封率和載藥量。

包封率%=（實際載入納米的藥物總質量/理論投入藥物總質量）×100%

載藥量%=（實際載入納米的藥物總質量/納米的總質量）×100%

2.2.3 Man-CUR NPs的穩(wěn)定性測定 將制備得到的Man-CUR NPs保存于4°C條件下，分別于1周內每天通過測定 Man-CUR NPs納米的粒徑變化，進行Man-CUR NPs的穩(wěn)定性考察。

3 實驗結果

3.1 CUR含量測定

3.1.1 色譜條件適用性 按上述色譜條件進樣樣品，如圖1所示，可見CUR色譜峰的分離度和峰型符合含量測定要求。

圖1 CUR的色譜圖

3.1.2 線性范圍 表1所示為CUR峰面積和濃度的對應關系，以CUR對照品濃度為X軸，以峰面積為Y軸，進行相關線性回歸計算。如圖2所示， 得到CUR線性回歸方程為Y=97666116.47X-348220.19R2=0.9991 ，說明CUR在 0.488～500 μg/mL線性關系良好。

表1 線性范圍濃度與峰面積對應表

圖2 CUR標準曲線

3.1.3 精密度 精密吸取同一對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣 6次，進樣量為10 μL，記錄CUR峰面積，結果見表2，計算CUR的峰面積RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

表2 精密度結果

3.1.4 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，24 h按上述色譜條件下進樣10 μL測定CUR的峰面積，結果見表3，計算其 RSD為0.53%，實驗結果表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩(wěn)定性。

表3 穩(wěn)定性結果

3.1.5 重復性 取同一批納米溶液，按照供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，并且按照上述色譜條件進樣10 μL進行分析測定，結果見表4，計算CUR含量均值為46.95 μg/mL， RSD為0.05%，表明該條件下CUR含量測定的重復性良好。

表4 重復性結果

3.1.6 加樣回收率 取已知含量的納米溶液，平行移取6份，使每份為 1 mL，并加入49.8530 μg/mL的CUR對照品溶液1 mL和甲醇 1 mL，按上述色譜條件進樣10 μL進行測定，實驗結果見表5，計算得到CUR的平均回收率為101.48%， RSD為0.10%。結果表明CUR的加樣回收率良好。

表5 加樣回收率結果

3.2 Man-CUR NPs的制備工藝優(yōu)化

3.2.1 Man-CUR NPs制備方法的選擇 在制備載藥納米粒子的方法中，納米沉淀法是最簡單的。這種方法是基于再水介質中的有機溶液沉淀載藥聚合物顆粒。其他方法包括溶劑蒸發(fā)、乳劑溶劑擴散、電噴霧和納米噴霧干燥等[15,16]。我們選用納米沉淀法和溶解揮發(fā)法制備Man-CUR NPs，對兩種方法得到的納米制劑進行粒徑、包封率和載藥量的測定，實驗結果如圖3和表6所示。可以觀察到溶劑揮發(fā)法制備的納米粒粒徑在190 nm左右（圖3A），且包封率較低；而納米沉淀法制備的納米粒粒徑在144 nm左右（圖3B），其粒徑分布均一，包封率較高。因此最終選擇納米沉淀法制備Man-CUR NPs。

表6 Man-CUR NPs制備方法的篩選結果（n=3）

圖3 溶劑揮發(fā)法（A）與納米沉淀法（B）制備的Man-CUR NPs粒徑分布圖

3.2.2 Man-CUR NPs 制備工藝單因素考察

（1）攪拌轉速

從圖4和表7可知，攪拌轉速為600 r/min時（圖4C），納米粒的粒徑偏大，包封率較低；200 r/min（圖4A）制備得到的納米粒雖然粒徑小但是分布不均一；400 r/min（圖4B）制備得到的納米粒粒徑小且分布均一，包封率較高。綜上，選擇400 r/min的攪拌轉速，此時制備的 Man-CUR NPs粒徑小、分布均一且包封率較高。

表7 攪拌速度對Man-CUR NPs的影響（n=3）

圖4 Man-CUR NPs不同攪拌速度的粒徑分布圖

（2）油水比

從圖5和表8可知，油水比為1∶5（圖5B）和1∶6（圖5C）制備得到的納米粒徑均較小，但油水比為1∶6制備的納米粒出現寬峰，表明粒徑分布不均一，且包封率較低；油水比為1∶4（圖5A）制備得到的納米粒徑較大，且包封率較低。因此綜合考慮，選擇油水比為1：5進行制備，此時得到的納米粒粒徑均一且分散性好、包封率較高。

表8 油水比對Man-CUR NPs的影響（n=3）

圖5 Man-CUR NPs不同油水比的粒徑分布圖

3.2.3 Man-CUR NPs制備處方單因素考察

（1）HPβCD-S-PBAE的用量

由圖6和表9可以看出，當HPβCD-S-PBAE的用量為20 mg（圖6A）時，Man-CUR NPs的粒徑較大且包封率較低；當HPβCD-S-PBAE的用量為30 mg（圖6B）和40 mg（圖6C）時，Man-CUR NPs的粒徑均小于200 nm，并且分布均一，包封率較高，表明合成的聚合物具有一定的裝載能力。因此在選擇HPβCD-S-PBAE的具體用量時可以根據CUR的投藥量以及經濟性進行考慮。

表9 不同HPβCD-S-PBAE用量對Man-CUR NPs的影響（n=3）

圖6 Man-CUR NPs不同HPβCD-S-PBAE用量的粒徑分布圖

（2）CUR投藥量

由圖7和表10可看出，當CUR投藥量為3 mg（圖7A）、6 mg（圖7B）和9 mg（圖7C）時，CUR均可以被很好地包載，且粒徑大小分布均小于200 nm。因此，我們可以根據具體需要的濃度調整CUR的投藥量，以適應不同給藥濃度的需求。

表10 不同CUR投藥量對Man-CUR NPs的影響（n=3）

圖7 Man-CUR NPs不同CUR投藥量的粒徑分布圖

3.2.4 Man-CUR NPs制備工藝的確定 通過考察，確定采用納米沉淀法制備Man-CUR NPs，攪拌轉速采用400 r/min，油水比選擇1：4，HPβCD-S-PBAE用量30～40 mg均可，CUR投藥量根據需要濃度進行選擇，3～9 mg均可。最終制備工藝為：準確稱取HPβCD-S-PBAE 30 mg，Man-ADA 4 mg分別溶于2.5 mL和0.5 mL DMSO中，并一同緩慢滴入20 mL純水中，超聲5 min，得到載體材料。準確稱取6 mg CUR溶于1 mL DMSO中，然后緩慢滴入載體材料混合相中，形成納米體系。在室溫下以400 r/min的轉速攪拌40 min，然后將溶液轉移到透析袋（MW=2000 Da）中，在去離子水中透析4 h以除去DMSO。通過0.8 μm 的微孔膜過濾去除游離 CUR。最終得到Man-CUR NPs。

3.3 Man-CUR NPs理化性質表征

3.3.1 粒徑、電位和形貌表征 由圖8A可知，納米的粒徑分布圖呈現正態(tài)分布，沒有出現不均一的小峰或寬峰，表明所制得的納米粒具有較為均一的粒徑。Man-CUR NPs的粒徑約為143.44±2.05 nm (圖8A)，Zeta電位約為+16.6±0.21 mV(圖8B)。TEM的圖像也證實了Man-CUR NPs為均一的球形結構(圖8C)。由表11可知，聚合物對CUR的包載率為90.24%±1.49%，載藥量為 8.54±0.08%。這些數據表明Man-CUR NPs具有可控的藥物負載和狹窄的粒徑適合于遞送 CUR 用于進一步的研究。

表11 Man-CUR NPs的表征

圖8 Man-CUR NPs的表征：（A）Man-CUR NPs粒徑分布圖；（B）Man-CUR NPs Zeta電位分布圖；（C）Man-CUR NPs TEM圖像

3.3.2 穩(wěn)定性考察 Man-CUR NPs的穩(wěn)定性實驗結果如圖9所示，放置 7 d后，未觀察到溶液出現沉淀或絮狀物，納米的粒徑在180～200 nm左右，表明該制劑的穩(wěn)定性較好，可滿足實驗需求。

圖9 4°C保存Man-CUR NPs的粒徑變化

4 討論

為了改善CUR的溶解度及生物利用度，目前已將CUR制成脂質體[17]，納米混懸劑[18]， 膠束[19]及聚合物納米粒[20]等。其中聚合納米粒子是目前研究最多的CUR納米體系，它們由天然或合成聚合物制成，這些聚合物可被生物降解。此外，基于β-環(huán)糊精構建的超分子材料已被廣泛應用于藥物遞送、細胞成像和細胞治療等研究中[21]。因此，本研究采用超分子聚合物作為載體材料，對CUR進行包載，使其具備主動靶向及響應性等功能，為姜黃素作為治療藥物的開發(fā)提供一個新的思路。本研究成功制備了CUR超分子納米粒，并確定了其最佳制備工藝和處方。實驗結果表明該納米粒粒徑較小，分布均一，具有良好的包封率和載藥量；TEM圖像呈圓滑完整的球形結構。接下來，我們將進一步研究該超分子納米粒在疾病治療方面的應用潛力。