基于裁剪適配體的納米金比色法用于金黃色葡萄球菌腸毒素A的可視化檢測(cè)

崔麗偉，魏 榮，常惟丹，岳曉禹，許文濤,2,

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，食品精準(zhǔn)營養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

金黃色葡萄球菌腸毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）所引起的食物中毒事件頻發(fā)，是影響食品安全和人類生命安全的重大隱患。當(dāng)食品中SEA的含量超過18 μg/100 g時(shí)，會(huì)引起嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致休克。據(jù)報(bào)道，2017—2020年間我國有15.2%的食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌腸毒素造成[1-3]。因此，實(shí)現(xiàn)SEA的快速定量分析檢測(cè)極為重要，是保障食品安全的一道重要防線。

現(xiàn)有的SEA檢測(cè)方法主要有分子生物學(xué)[4-5]、免疫學(xué)[6-7]、色譜法[8-9]、生物傳感器[10-12]等。這些方法均可以實(shí)現(xiàn)SEA的定量分析測(cè)定，但大多具有樣品前處理繁瑣、易出現(xiàn)假陽性、測(cè)定成本高、測(cè)定時(shí)間長、需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員等局限性。近年來，適配體由于其具有易合成、成本低的顯著特點(diǎn)，其作為識(shí)別原件的生物傳感器受到廣大研究者的青睞。核酸適配體是與靶標(biāo)具有高特異性、高親和力的單鏈DNA或RNA，常通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得，但所得到的適配體往往序列冗長，存在無效堿基，出現(xiàn)合成成本增加、親和力低等問題，所以還需進(jìn)一步優(yōu)化以滿足分析測(cè)定需求[13-14]。常見的適配體優(yōu)化策略主要有截短、突變和化學(xué)修飾，其中，截短為適配體優(yōu)化的首選策略。為了確定截?cái)嗪蟮男蛄信c靶標(biāo)具有較高的特異性、親和性和穩(wěn)定性，常常根據(jù)適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)。有研究顯示，利用分子模擬的方法能夠直接獲得結(jié)合位點(diǎn)，從而特異性地針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行截短或突變優(yōu)化[15-17]。例如，顏志超等[18]在分子模擬指導(dǎo)下對(duì)SELEX篩選所得的河鲀毒素核酸適配體進(jìn)行連續(xù)優(yōu)化，得到了親和力較高的河鲀毒素適配體。Hu Bo等[19]利用分子模擬研究DNA適配體與?？舅氐慕Y(jié)合機(jī)制，并獲得了較其他SELEX篩選結(jié)果親和力更高的適配體。

本研究擬利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對(duì)SEA適配體進(jìn)行截短指導(dǎo)和結(jié)果預(yù)測(cè)，再利用納米金顯色的方法驗(yàn)證模擬結(jié)果，以優(yōu)化得到親和力高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的SEA適配體，將其作為分子識(shí)別原件，構(gòu)建一種可視化的SEA快速檢測(cè)分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

氯金酸四水合物、檸檬酸三鈉、氯化鈉（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SEA、腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）、腸毒素C（staphylococcal enterotoxin C，SEC）由本實(shí)驗(yàn)室提供；黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）青島普瑞邦生物工程有限公司。

適配體均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，Apt1：5′-ATCTGCTGACGTTGGTCGTCATTG GAGTATC-3′；Apt2：5′-AACGTCAGCATCTGCTG ACGTTGGTCGTCATTGGAGTATC-3′；Apt3：5′-CG TCAGCATCTGCTGACGTTGGTCGTCATTGGAGTA TC-3′；Apt4：5′-CCTAACCGATATCACACTCACAG TATACCGCTCCACCAGTGTGATATCGGGATCTGC TGACGTTGGTCGTCATTGGAGTATC-3′[20]；Apt5：5′-ATCTGCTTTGGTCGTCATTGGAGTA-3′；Apt6：5′-ATCTGCTTTGGTGTATTGGAGTA-3′。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1900PC紫外-可見光分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；PL-9602G酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；HR-T16MM臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子對(duì)接模擬

對(duì)核酸適配體的結(jié)構(gòu)建模，適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過IDT網(wǎng)站（https://sg.idtdna.com）進(jìn)行預(yù)測(cè)，設(shè)置折疊溫度為25 ℃，離子條件為50 mmol/L Na＋溶液。選擇能量最小的二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入RNA Compser在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://rnacomposer.ibch.poznan.pl），將胸腺嘧啶改為尿嘧啶后生成RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)，隨后將其導(dǎo)入分子可視化程序（Visual Molecular Dynamics，VMD）軟件中，將尿嘧啶改為胸腺嘧啶，從而得到適配體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）中獲取SEA晶體結(jié)構(gòu)（ID：1ESF），隨后使用HDOCK Web服務(wù)器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）進(jìn)行分子對(duì)接，適配體為受體，SEA為配體，對(duì)接完成后，選擇能量最穩(wěn)定的復(fù)合物，使用GROMACS軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。分子動(dòng)力學(xué)自發(fā)結(jié)合模擬方法可以預(yù)測(cè)適配體與SEA的結(jié)合區(qū)域。選擇蛋白質(zhì)/核酸通用力場(chǎng)，Tip3p水模型，復(fù)合物置于水立方體中心，水立方體表面距離復(fù)合物最小距離為10 ?，先進(jìn)行預(yù)平衡，再進(jìn)行成品模擬，模擬時(shí)間為10 ns。動(dòng)力學(xué)結(jié)束后，修正復(fù)合物運(yùn)動(dòng)軌跡后，計(jì)算復(fù)合物分子模型的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）以評(píng)估構(gòu)象穩(wěn)定情況[14,19,21]。

1.3.2 納米金顯色分析

采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備納米金[22]。向每個(gè)酶標(biāo)板中分別加入50 μL金納米粒子溶液，再加入50 μL 0.3 μmol/L的適配體溶液，在酶標(biāo)板振蕩器中以37 ℃孵育10 min；加入50 μL不同質(zhì)量濃度的SEA溶液，37 ℃孵育10 min；最后加入25 μL 0.3 mol/L的氯化鈉溶液，37 ℃顯色5 min。使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，掃描波長在480～700 nm之間，記錄其在650 nm波長處與520 nm波長處吸光度的比值（A650nm/A520nm），同時(shí)以無菌水代替不同質(zhì)量濃度的SEA溶液，做空白實(shí)驗(yàn)，扣除空白后，吸光度比值記作ΔA650nm/A520nm。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了提高方法的準(zhǔn)確度以及靈敏度，在SEA質(zhì)量濃度為250 ng/mL時(shí)，采用單因素試驗(yàn)分別測(cè)定鹽溶液濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mol/L）、適配體濃度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L）、反應(yīng)時(shí)間（2、4、6、8、10、12、14 min）對(duì)ΔA650nm/A520nm的影響，獲得最佳的反應(yīng)體系。

1.3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證本方法檢測(cè)SEA的特異性，分別選用質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的SEB、SEC、AFB1、OTA和ZEN進(jìn)行特異性驗(yàn)證，SEA質(zhì)量濃度為100 ng/mL。操作同1.3.2節(jié)，將SEA分別用上述毒素代替。

1.3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

取25 g攪碎后的豬肉樣品，加入一定量的SEA，然后再加入225 mL無菌水均質(zhì)，使樣品中的SEA終質(zhì)量濃度為50、100、200 ng/mL。取均質(zhì)液在90 ℃加熱10 min，2 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。參照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 8.5軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體篩選

2.1.1 適配體設(shè)計(jì)及分子模擬結(jié)果

根據(jù)6 條適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)最長鏈適配體進(jìn)行裁剪[23]，裁剪過程如圖1所示，Apt4具有82 個(gè)堿基，具有較長的鏈，將其與SEA進(jìn)行分子模擬后，發(fā)現(xiàn)SEA和Apt4結(jié)合區(qū)域在其3′端，又由于適配體與靶標(biāo)結(jié)合區(qū)域大多在其莖環(huán)部位[24-25]，所以對(duì)其進(jìn)行裁剪，得Apt1。為了驗(yàn)證Apt1中與SEA作用的關(guān)鍵堿基序列，一方面在其5′端分別增加多余冗長堿基9 個(gè)和7 個(gè)，得Apt2和Apt3；另一方面，對(duì)其5′端的小莖環(huán)進(jìn)行裁剪，得Apt5和Apt6。將6 條適配體分別與SEA進(jìn)行10 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬，得到二者結(jié)合后的三維結(jié)構(gòu)圖（圖2A）以及RMSD值曲線（圖2B）。Apt6從圖2A可以看出適配體彎曲折疊，SEA在其空間“口袋”內(nèi)，相交處為兩者相互作用區(qū)域。RMSD值是評(píng)價(jià)構(gòu)象穩(wěn)定的重要指標(biāo)，其值越小，說明構(gòu)象與原始構(gòu)象越相近，在分子模擬時(shí)，隨時(shí)間的波動(dòng)，RMSD值越小，說明系統(tǒng)越接近于平衡狀態(tài)。如圖2B所示，6 條適配體與SEA結(jié)合后，三級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的變化。其中，Apt1和Apt4波動(dòng)最明顯，其次為Apt2和Apt3，而Apt5和Apt6相對(duì)穩(wěn)定。波動(dòng)程度越大，說明復(fù)合物空間構(gòu)象越不穩(wěn)定，越容易發(fā)生變化。分子模擬結(jié)果顯示Apt5和Apt6穩(wěn)定性較好，推測(cè)可能是核酸適配體與SEA的核心結(jié)合區(qū)，適合用于生物傳感器構(gòu)建。

圖2 適配體Apt6與SEA分子模擬結(jié)果（A）及不同裁剪適配體與SEA分子動(dòng)力學(xué)后的RMSD值（B）Fig.2 Molecular simulation results of Apt6 and SEA (A) and RMSD values obtained in molecular dynamics simulation of different tailored aptamers and SEA (B)

2.1.2 納米金顯色結(jié)果

利用納米金的鹽效應(yīng)實(shí)現(xiàn)SEA定量測(cè)定的可能性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3A所示。分散狀態(tài)下的納米金溶液呈現(xiàn)酒紅色（曲線a），加入鹽后，溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色，520 nm波長處的吸光度下降，650 nm波長處的吸光度上升（曲線b），鹽的加入引起納米金粒子聚集，造成顏色改變。當(dāng)納米金溶液中存在適配體時(shí)，由于靜電吸附作用，適配體吸附在納米金顆粒表面，鹽效應(yīng)減弱（曲線c），溶液顏色變化不明顯。當(dāng)納米金溶液中同時(shí)存在適配體和靶標(biāo)時(shí)，由于二者發(fā)生特異性結(jié)合，使得納米金粒子失去適配體的“保護(hù)”，引起粒子聚集，靶標(biāo)質(zhì)量濃度越大，鹽效應(yīng)越明顯（曲線d和e，A650nm/A520nm比值分別為1.28和1.31）。納米金溶液的A650nm/A520nm值與SEA含量呈正相關(guān)，可通過溶液顏色的變化實(shí)現(xiàn)SEA的定量檢測(cè)。

圖3 不同體系下溶液的吸收光譜圖（A）以及不同適配體和SEA的納米金顯色結(jié)果（B）Fig.3 Absorption spectra of different systems (A) and color development results of gold nanoparticles in the presence of different aptamers and SEA (B)

對(duì)6 條適配體（0.5 μmol/L）和SEA（250 ng/mL）的親和性和穩(wěn)定性進(jìn)行探究，平行測(cè)定6 次，結(jié)果如圖3B所示。與其他適配體相比，Apt4親和力較弱且不穩(wěn)定，這可能是由于其堿基數(shù)量較多、鏈較長引起。經(jīng)過裁剪和改造后的Apt1、Apt2和Apt3，親和力得到明顯提高，Apt2和Apt3親和力無明顯差別，這說明：一方面，裁剪效果明顯，有效堿基得到保留；另一方面，在一定程度上增加堿基數(shù)量，對(duì)親和力影響較小。與Apt1相比，經(jīng)過再次裁剪的Apt5和Apt6，親和力得到進(jìn)一步提高，且穩(wěn)定性較好，說明裁剪策略正確，有效堿基得到保留，鏈的縮短使得適配體空間結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。上述結(jié)果與分子模擬結(jié)果一致，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和測(cè)定成本綜合考慮，選擇Apt6用于后續(xù)測(cè)定。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 鹽濃度

當(dāng)體系中鹽溶液濃度小于0.3 mol/L時(shí)，ΔA650nm/A520nm值隨著鹽濃度的增大而升高，當(dāng)鹽濃度大于0.3 mol/L時(shí)，其比值趨于水平。說明鹽濃度小于0.3 mol/L，納米金粒子不能得到有效聚集，鹽效應(yīng)較小，而當(dāng)鹽溶液濃度大于0.3 mol/L時(shí)，納米金聚集現(xiàn)象明顯，適配體保護(hù)能力減弱，呈現(xiàn)穩(wěn)態(tài)。因此，0.3 mol/L為最佳鹽濃度。

2.2.2 適配體濃度

在適配體濃度小于0.3 μmol/L時(shí)，ΔA650nm/A520nm值不斷下降，當(dāng)適配體濃度大于0.3 μmol/L時(shí)，ΔA650nm/A520nm值趨于水平，如果適配體的濃度過低，則體系中的適配體無法完全保護(hù)金納米粒子，低濃度的氯化鈉就會(huì)使金納米粒子發(fā)生聚集，此時(shí)無論體系中是否有SEA存在，金納米粒子都是聚集的狀態(tài)，無法對(duì)溶液中的SEA進(jìn)行檢測(cè)。如果適配體的濃度過高，一部分適配體吸附在納米金表面，另一部分游離在溶液中，當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，優(yōu)先與游離的適配體結(jié)合，然后再與吸附在金納米粒子表面的適配體結(jié)合，這樣會(huì)大大降低方法的靈敏度。當(dāng)反應(yīng)體系的氯化鈉濃度不變時(shí)，金納米粒子團(tuán)聚的程度隨著適配體濃度的升高而不斷降低，在0.3 μmol/L處達(dá)到最低后趨于水平，表明適配體的濃度為0.3 μmol/L時(shí)，可以完全保護(hù)金納米粒子不發(fā)生聚集，且體系中的SEA更容易被識(shí)別、靈敏度最高。因此，最優(yōu)適配體濃度為0.3 μmol/L。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間

金納米粒子的團(tuán)聚程度和反應(yīng)時(shí)間有關(guān)，結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于10 min時(shí)，ΔA650nm/A520nm值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，在10 min達(dá)到最大后趨于水平，說明10 min時(shí)體系反應(yīng)完全，吸光度比值達(dá)到平衡，因此，最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，繪制納米金溶液與不同質(zhì)量濃度SEA反應(yīng)后的吸收光譜圖，結(jié)果如圖4A所示。隨著SEA溶液質(zhì)量濃度的增加，體系在520 nm波長處的吸光度不斷下降，在650 nm波長處的吸光度不斷上升，體系顏色從酒紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色（圖4A內(nèi)插圖）。以ΔA650nm/A520nm值為縱坐標(biāo)，SEA溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制二者相關(guān)性曲線，如圖4B所示，在SEA質(zhì)量濃度為5～250 ng/mL內(nèi)，線性回歸方程為Y=0.001 7X＋0.452 3，相關(guān)系數(shù)為0.984 7，檢出限為4.32 ng/mL（RSN=3）。說明該方法可實(shí)現(xiàn)SEA的快速可視化檢測(cè)。與報(bào)道的方法相比，本研究建立的方法操作簡單，檢測(cè)速度快，檢測(cè)限較低，具有一定優(yōu)勢(shì)（表1）。

表1 不同腸毒素A檢測(cè)方法的對(duì)比Table 1 Comparison of different methods for detection of SEA

圖4 不同質(zhì)量濃度的SEA吸收光譜圖（A）和線性擬合圖（B）Fig.4 Absorption spectra of SEA at different mass concentrations (A) and linear relationship between absorbance ratio and SEA mass concentration (B)

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

選用不同毒素對(duì)方法的特異性進(jìn)行研究。結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)裁剪前后的適配體對(duì)SEA、SEB和SEC均有響應(yīng)，這可能是因?yàn)镾EA與SEB、SEC具有40%～60%序列同源性，適配體對(duì)該共同結(jié)構(gòu)域具有識(shí)別位點(diǎn)[1]；但對(duì)于其他的微生物代謝的小分子毒素如ZEN、AFB1、OTA幾乎沒有響應(yīng)。說明本方法對(duì)于腸毒素的檢測(cè)具有一定的廣譜性優(yōu)勢(shì)，對(duì)于其他毒素，具有良好的特異性。

圖5 不同裁剪適配體的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of different tailored aptamers

在相同條件下，連續(xù)7 d用所構(gòu)建的傳感器測(cè)定質(zhì)量濃度為250 ng/mL 的SEA，重復(fù)測(cè)定3 次，測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值小于5%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

以豬肉作為實(shí)際樣品，通過測(cè)定加標(biāo)回收率驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果如表2所示，豬肉樣品中SEA的加標(biāo)回收率在84.00%～93.62%之間，RSD值為5.24%～6.63%。由此得出，該生物傳感器檢測(cè)的準(zhǔn)確性高、數(shù)據(jù)可靠，可以對(duì)豬肉中的SEA進(jìn)行篩選甄別。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過分子模擬，指導(dǎo)適配體裁剪，預(yù)測(cè)適配體與SEA作用區(qū)域，篩選出目標(biāo)適配體，提高適配體篩選效率，獲得長度更短、親和力更好、特異性更高、穩(wěn)定性更好的核酸適配體。將篩選得到的適配體作為信號(hào)識(shí)別原件，利用納米金的鹽效應(yīng)，構(gòu)建了一種SEA的高靈敏度、高特異性的可視化檢測(cè)方法。本方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，為基于適配體的SEA快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供了一定理論基礎(chǔ)。