中草藥碳點(diǎn)應(yīng)用研究進(jìn)展△

王倩，李佳怡，沈夢怡，張倩，羅維芳，2*，唐于平，2*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥配伍重點(diǎn)研究室，陜西 西安 712046

2004 年，科研人員在電泳純化單壁碳納米管的過程中偶然發(fā)現(xiàn)了碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）并在2006 年首次報道了CDs 的合成[1-2]。CDs 是一種粒徑較小的新型碳納米材料，不僅有傳統(tǒng)半導(dǎo)體和熒光團(tuán)（小分子）的雙重優(yōu)點(diǎn)，還有水溶性好、毒性低及生物相容性好等特點(diǎn)。此前，對于CDs的研究主要在合成方法及性能檢測等方面，而合成CDs的前體多數(shù)為單一化合物，如檸檬酸、甘油、L-抗壞血酸、葡萄糖、檸檬酸-尿素等。采用上述化合物前體合成CDs可能會對環(huán)境和人體造成一定危害，因而阻礙了CDs的進(jìn)一步應(yīng)用。近年來，隨著中藥理論的快速發(fā)展，中草藥CDs 的研究受到廣泛關(guān)注。中草藥CDs 的合成前體是藥用植物，包括根、莖、葉、花、果實(shí)、種子和其他部分，來源廣、產(chǎn)量大。中草藥成分復(fù)雜且不均一，含有多種活性成分，可發(fā)揮抗氧化、止血、消炎鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等多種功效。本文對中草藥CDs 的合成、藥理特征及應(yīng)用研究進(jìn)行系統(tǒng)概述，并對其未來的研究前景與關(guān)鍵問題進(jìn)行展望。

1 中草藥CDs的合成

CDs的合成方法主要分為2種，分別是“自上而下”合成法和“自下而上”合成法[3-8]。前者是用較小的碳前驅(qū)體（有機(jī)小分子）經(jīng)過高溫?zé)峤?、微波輔助或水熱合成等方法制備CDs；后者是將大分子的碳單元通過電化學(xué)合成、激光灼燒或化學(xué)氧化等方法制備納米顆粒。其中，水熱合成法是一種成本低且較為環(huán)保的方法，因而被大多數(shù)研究者所采用（表1）。

表1 中草藥CDs的合成方法

1.1 水熱合成法

水熱合成法是制備中草藥CDs常用的一種方法，此方法不僅符合綠色標(biāo)準(zhǔn)，而且合成的CDs 表面不需要經(jīng)過額外的修飾與鈍化，具有毒性低的特點(diǎn)。制備前，中草藥需晾干，將其切成小塊或粉碎成粉末，然后浸泡在超純水中，待超聲處理完成，再將混合物轉(zhuǎn)移到不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，用特定的溫度加熱，即可獲得中草藥CDs。最后，將得到的懸浮液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，用透析袋透析數(shù)天即可得到純化的CDs。

1.2 高溫?zé)峤夥?/h3>

高溫?zé)峤夥ㄊ橇硪环N制備中草藥CDs 的常用方法。制備前，將中草藥CDs的前體在真空或惰性氣體保護(hù)的條件下通過高溫加熱、脫水、降解和碳化等步驟除去其中可能存在的有機(jī)物質(zhì)，并逐步轉(zhuǎn)化為CDs。此方法制備工藝簡單、成本低，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。制備時，先將中草藥放入坩堝并用適當(dāng)?shù)臏囟燃訜嶂疗涮蓟?，然后將其碾碎放入超純水中煮沸，收集上層溶液獲得CDs。最后，將溶液用0.22 μm微孔膜濾過，用透析袋透析數(shù)天得到純化的CDs。

1.3 微波合成法

微波合成法與高溫?zé)峤夥ǖ暮铣蛇^程大體相同，但前者可在較短時間內(nèi)達(dá)到預(yù)期能量，使前驅(qū)體受熱均勻。微波合成法的本質(zhì)是通過一種電磁波（波長為1～100 mm）遞送能量，引發(fā)化學(xué)鍵斷裂，可顯著縮短反應(yīng)時間，提高制備效率[22-23]。此外，有報道微波輔助水熱合成法可替代傳統(tǒng)的水熱合成法[24-25]。

2 生物學(xué)特性及藥代動力學(xué)研究

2.1 止血

中藥炮制理論記載，藥物經(jīng)碳化加工后可使其性味改變，如升降沉浮發(fā)生轉(zhuǎn)化、“澀”味增加，故表現(xiàn)出止血功效[26-28]。黃柏（Phellodendri Chinense Cortex）為清熱燥濕藥。Liu 等[9]制備了黃柏CDs，并通過小鼠斷尾和肝劃痕模型實(shí)驗(yàn)，證明了該CDs是通過激活體內(nèi)血漿纖維蛋白原（FIB）系統(tǒng)發(fā)揮止血作用。此外，黃柏CDs 的穩(wěn)定性較好，可長期儲存。碳化蒲黃（Pollen Typhae Carbonisata）為止血藥[23]。Yan 等[29]對碳化蒲黃水煎液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了新的水溶性CDs（PTC-CDs），證明此CDs 也是通過激活體內(nèi)的FIB 系統(tǒng)發(fā)揮止血功效。燈心草（Junci Medulla Carbonisata）常被用于鎮(zhèn)靜和抗焦慮，但也有研究發(fā)現(xiàn)，碳化處理的燈心草還有止血功效。Cheng 等[30]在其碳化后的水溶液中發(fā)現(xiàn)了新的CDs（JMC-CDs），并證明JMC-CDs 不僅對血小板減少和局部出血有一定抑制作用，也可激活體內(nèi)FIB 系統(tǒng)共同發(fā)揮止血功效。

2.2 抗腫瘤

中草藥已廣泛應(yīng)用于癌癥的替代治療，可通過調(diào)節(jié)癌癥基因與抗癌基因、改變表觀遺傳修飾與腫瘤微環(huán)境等發(fā)揮輔助治療作用[12]。生姜（Rhizoma Zingiberis Recens）有抗氧化、抗癌等藥理作用。Li等[11]以生姜為碳前驅(qū)體合成了具有熒光特性和生物活性的CDs，并證明其可增加抗癌基因p53的表達(dá)、抑制體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和肝癌HepG2 細(xì)胞的生長。從代謝角度看，該CDs 可在較短時間內(nèi)隨尿液排出體外，避免了潛在的生物毒性。另一項(xiàng)研究表明，生姜CDs表面含有姜黃素（curcumin）[13]，卻沒有生姜的抗癌成分6-姜辣素，再次表明中草藥經(jīng)高溫碳化后活性成分與藥理作用可能發(fā)生改變。Yao 等[31]以人參皂苷Re為前體，合成了新的CDs（Re-CDs），研究表明，Re-CDs 對癌細(xì)胞的抑制作用比人參皂苷Re更強(qiáng)，其通過上調(diào)體內(nèi)活性氧的含量和參與細(xì)胞凋亡蛋白酶介導(dǎo)途徑抑制癌細(xì)胞增殖。

2.3 抗痛風(fēng)

嘌呤核苷酸在體內(nèi)的代謝異常是誘發(fā)痛風(fēng)性疾病的首要因素。黃嘌呤氧化酶（XOD）是次黃嘌呤轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶，也是影響體內(nèi)尿酸水平的主要因素之一，其在體內(nèi)過度增加會引發(fā)高尿酸血癥[15]。別嘌呤醇對其有一定抑制作用，是臨床上治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的主要藥物之一。通常情況下，可將XOD 作為判斷中草藥CDs 有無抗痛風(fēng)活性的指標(biāo)之一。Wang 等[12]以枳實(shí)（Aurantii Fructus Immaturus）為前驅(qū)體合成枳實(shí)CDs（AFIC-CDs），發(fā)現(xiàn)AFIC-CDs 可抑制高尿酸血癥大鼠血清和肝臟內(nèi)的XOD 活性，降低大鼠體內(nèi)尿酸、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）等炎癥因子含量，減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理性損傷。

2.4 抗炎

脂多糖常被用來建立全身的炎癥模型，而個別中草藥卻對其有顯著的抑制作用[32-36]。例如，Wang等[28]在木炭加工的過程中發(fā)現(xiàn)了桑蠶繭（mulberry silkworm cocoons，MSC）-CDs，隨后用3 種經(jīng)典炎癥動物模型預(yù)估MSC-CDs的抗炎作用及機(jī)制，結(jié)果表明，MSC-CDs 可減輕二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳水腫、抑制乙酸誘導(dǎo)的血管通透性增高、降低由脂多糖誘導(dǎo)的炎癥模型動物體內(nèi)TNF-α和IL-6 含量，使其炎癥程度得到一定改善。曹鵬等[37]在黃芩（Scutellar Radix）炭的水煎液中分離出1 種新的碳納米類成分，該成分對二甲苯誘導(dǎo)的耳水腫癥狀有明顯的改善作用，同時也可降低急性腹膜炎小鼠腹腔的毛細(xì)血管通透性，具有一定的抗炎功效。

2.5 鎮(zhèn)痛

阿片類藥物能夠緩解和控制疼痛，5-羥色胺（5-HT）與腦啡肽（ENK）可以起到緩解疼痛的作用[26]。Zhang 等[38]利用經(jīng)典熱板實(shí)驗(yàn)、尾浸實(shí)驗(yàn)和醋酸誘導(dǎo)扭體實(shí)驗(yàn)研究碳酸姜CDs 的鎮(zhèn)痛機(jī)制，結(jié)果表明，小劑量的姜類藥物可以增加血清中ENK和β-內(nèi)啡肽含量；通過比較大、中、小3 個劑量發(fā)現(xiàn)，C57BL/6 小鼠腦組織中ENK 含量增加，表明腦阿片系統(tǒng)也參與介導(dǎo)了碳酸姜CDs 的鎮(zhèn)痛作用。此外，經(jīng)典熱板實(shí)驗(yàn)證實(shí)了碳酸姜CDs 可調(diào)節(jié)腦組織和血清中5-HT濃度，表明姜黃素與嗎啡之間有協(xié)同鎮(zhèn)痛作用，但具體機(jī)制尚不清楚。目前，尚未發(fā)現(xiàn)此CDs 使人體產(chǎn)生不良反應(yīng)，該研究可為鎮(zhèn)痛類藥物的研發(fā)提供新思路[39-44]。

2.6 藥代動力學(xué)研究

藥代動力學(xué)是闡明中藥有效成分在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄等動態(tài)過程的一門學(xué)科。雖然，中草藥CDs的本質(zhì)是一種納米材料，但其也是由合成CDs前體中包含的主要活性成分發(fā)揮藥效，因而關(guān)于其在體內(nèi)代謝與分布也是研究熱點(diǎn)，但卻鮮有文章報道此方面的研究成果。因此，即便中草藥CDs在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出良好的安全性，但體外毒性實(shí)驗(yàn)還不能證明其在整個生物系統(tǒng)中的安全性。因此，在后續(xù)研究中仍要不斷探索并將此方向作為研究重點(diǎn)[45-48]。

3 其他應(yīng)用

3.1 生物傳感器

重金屬離子可通過土壤、植物和水源等途徑進(jìn)入到環(huán)境中，其含量一旦超標(biāo)就會對人體和環(huán)境造成不良影響，如體內(nèi)Fe3+的含量發(fā)生異常波動可能引發(fā)人體慢性心力衰竭[49-52]?，F(xiàn)有檢測方法，如光譜、色譜及電化學(xué)等方法，不僅過程復(fù)雜而且成本較高[53-55]。部分中草藥CDs可直接與重金屬離子反應(yīng)，引起CDs內(nèi)部電子轉(zhuǎn)移并形成穩(wěn)定絡(luò)合物，出現(xiàn)熒光淬滅或增強(qiáng)現(xiàn)象。Sun等[33]以枸杞子（Lycii Fructus，LF）為前驅(qū)體，合成了新的水溶性LF-CDs，該CDs 表面富含羥基并基于LF-CDs 和Fe3+的內(nèi)濾效應(yīng)使CDs 發(fā)生熒光淬滅。Hg2+屬于劇毒性金屬離子，Sun 等[41]用梔子（Gardeniae Fructus）在不經(jīng)過任何表面修飾與鈍化的情況下，合成“開-關(guān)”型氮硫共摻雜CDs（N/SCDs），用于Hg2+與半胱氨酸的檢測。此外，還有眾多中草藥CDs都可用于金屬離子的檢測（表2）。

表2 中草藥CDs檢測各種金屬離子

3.2 生物成像

中草藥CDs的本質(zhì)是一種粒徑較小且易被細(xì)胞吸收的納米材料。由于CDs結(jié)構(gòu)中存在缺陷態(tài)與晶格缺陷態(tài)，所以具有一定的熒光可調(diào)控性。目前，已有多篇文獻(xiàn)報道中草藥CDs在細(xì)胞及活體組織成像方面有較好的效果[18,20-21,47-48,60-61]。Thota等[62]以檸檬草（Lemon Grass Herb，LGH）為前體合成的LGH-CDs除具有毒性低、生物相容性良好的特點(diǎn)外，還能夠上轉(zhuǎn)換熒光，使LGH-CDs 具有較強(qiáng)的穿透能力和較小的組織損傷性等特點(diǎn)。此外，還有許多中草藥CDs都可應(yīng)用于此領(lǐng)域（表3）。中草藥CDs在生物成像領(lǐng)域的主要研究對象是細(xì)胞，而以微生物、原生動物及植物等為研究對象的生物成像還相對較少。

表3 能夠生物成像的中草藥CDs

4 總結(jié)與展望

CDs 作為一種新型碳納米材料有著優(yōu)異的生物學(xué)特性、靈敏性、光致發(fā)光性和穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于離子檢測、生物成像和傳感等領(lǐng)域。中草藥CDs 作為CDs 的一個全新分支，具有綠色、安全的特點(diǎn)，也被廣泛應(yīng)用于上述領(lǐng)域。中草藥CDs 在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用可為今后治療學(xué)的發(fā)展提供新思路。中草藥CDs 也有一定缺陷，如CDs 最常用的合成方法是水熱法和微波輔助法，導(dǎo)致CDs 的熒光強(qiáng)度和粒徑大小并不穩(wěn)定，因而尋求一種穩(wěn)定、高效的合成方法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

此外，中草藥CDs 合成的前驅(qū)體不同，其藥理活性也存在一定差異。在中藥材高溫碳化過程中，藥材中某些有效成分可能分解或產(chǎn)生新的有效成分。目前，中草藥CDs 在治療疾病方面已有初步的成效和進(jìn)展，但在治療機(jī)制和有效成分分析等方面的研究還相對較少，可作為今后中草藥CDs 研究的一個方向。其次，雖然中草藥CDs 在體內(nèi)細(xì)胞成像與傳感方面表現(xiàn)出良好的安全性，但經(jīng)長期治療其是否會在體內(nèi)積累并發(fā)生不良反應(yīng)尚不清楚。中草藥CDs 的本質(zhì)是納米粒子，所以其在體內(nèi)的代謝途徑也是今后研究的挑戰(zhàn)之一?？傊?，中草藥CDs 在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用還處于初級階段，未來有廣泛的發(fā)展空間和無限可能。

中草藥CDs 合成的前體多來源于植物，而對動物類藥物卻涉及較少，后期可開展對動物類藥物CDs 的探索研究。此外，中草藥在提取完成后，藥渣中是否仍含有部分活性成分，以及用藥渣提取合成CDs也可作為今后的研究方向。