UPLC-MS/MS測定追風(fēng)透骨丸中馬兜鈴酸類成分含量△

王穎，劉繁紅，楊燕麗，何筱毅，何成軍，楊蕾*，袁軍，戴忠

1.四川省藥品檢驗(yàn)研究院 國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610097；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

追風(fēng)透骨丸是《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）收載的品種，是由制川烏、白芷、制草烏、香附（制）等23 味中藥粉碎后制成的水蜜丸，用于風(fēng)寒濕痹、肢節(jié)疼痛、肢體麻木[1]。處方中細(xì)辛含有馬兜鈴酸，馬兜鈴酸是馬兜鈴科植物中含有的系列結(jié)構(gòu)相似的硝基菲類化合物。由于馬兜鈴酸暴露造成的中毒事件引發(fā)世界范圍的廣泛關(guān)注。其中馬兜鈴酸Ⅰ被證實(shí)有明確的腎毒性、致突變性及致癌性[2]。1999 年英國率先全面禁用含馬兜鈴酸的中草藥及其制品；2001 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）也發(fā)布了禁用含馬兜鈴酸中草藥的通告，隨后幾年歐美及世界許多國家和地區(qū)，包括中國臺(tái)灣和中國香港都先后禁用含馬兜鈴酸的中草藥。2003—2004 年，國家藥品監(jiān)督管理局先后禁止關(guān)木通、廣防己、青木香的藥用；對(duì)含有馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴(yán)格按處方藥管理；要求細(xì)辛只能用根及根莖[3]，《中國藥典》2020 年版（一部）細(xì)辛檢查項(xiàng)下規(guī)定馬兜鈴酸Ⅰ限量（不得過0.001%）[1]。此外對(duì)含細(xì)辛的中成藥進(jìn)行馬兜鈴酸含量限度研究[4-7]。

查閱文獻(xiàn)，液相色譜法（LC）在馬兜鈴酸類化合物的研究中應(yīng)用較廣，主要用于中藥材、飲片及含量較高制劑的測定。《中國藥典》2020 年版（一部）細(xì)辛和辛芩顆粒均采用LC檢測馬兜鈴酸Ⅰ。此外，由于液質(zhì)聯(lián)用儀高靈敏度、高選擇性、高通量的優(yōu)勢，也已被廣泛應(yīng)用于馬兜鈴酸類成分的檢測和分析，現(xiàn)行涉及馬兜鈴酸類化合物的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法均采用LC-質(zhì)譜法（MS/MS）[5-11]。追風(fēng)透骨丸成分復(fù)雜，故本研究采用超高效液相色譜（UPLC）-MS/MS對(duì)其中馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺2種結(jié)構(gòu)類型的4個(gè)成分進(jìn)行檢測研究。

1 材料

1.1 儀器

Triple Quad 5500 型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

7批追風(fēng)透骨丸（A企業(yè)，編號(hào)為A001～A003；B企業(yè)，編號(hào)為B001～B004）。

對(duì)照品馬兜鈴酸Ⅰ（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110746-201912，純度：99.1%）；馬兜鈴酸Ⅱ（批號(hào)：PS010654，純度：99.98%）、馬兜鈴酸Ⅲ（批號(hào)：PS220701-21，純度：96.33%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ（批號(hào)：PS010658，純度：99.69%）均購于成都普思生物科技股份有限公司；乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

川烏、白芷等22 味中藥購于荷花池中藥材市場，經(jīng)四川省檢驗(yàn)研究院黎躍成主任藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨，B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～5 min，50%A；5～10 min，50%～70%A；10～12 min，70%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源電壓：5 500.0V；離子源溫度：550.0 ℃；氣簾氣壓力：20 psi（1 psi≈6 894.757 Pa）；噴霧器流量：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 追風(fēng)透骨丸中待測化合物的質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對(duì)照品適量，溶于甲醇制成的質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，用70%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，水浴回流提取1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過（0.22 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 分別取細(xì)辛以外的22 味中藥，按處方比例制備缺細(xì)辛陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺細(xì)辛陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，即可得總離子流色譜圖（TIC），進(jìn)行離子對(duì)選擇后得到各成分的提取離子色譜圖（XIC）。結(jié)果顯示，在馬兜鈴酸Ⅰ的兩對(duì)離子通道（m/z359.0→298.1，m/z359.0→296.1）和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的兩對(duì)離子通道（m/z294.0→279.0，m/z294.0→250.9），供試品溶液中均檢出與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰。在馬兜鈴酸Ⅱ的兩對(duì)離子通道（m/z329.0→268.1，m/z329.0→294.0）、馬兜鈴酸Ⅲ的兩對(duì)離子通道（m/z359.0→296.1，m/z359.0→298.1），供試品溶液未檢出與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性樣品溶液在各離子通道中均未檢出與對(duì)照品溶液一致的色譜峰，陰性無干擾，見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液的XIC

2.3.2 線性關(guān)系和定量限水平的考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，用70%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、250 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果4個(gè)成分r均大于0.999 5，線性關(guān)系良好。計(jì)算各離子通道目標(biāo)峰信噪比（S/N），考慮化合物定性需定性定量兩對(duì)離子通道均有檢出，故確定定量限時(shí)定量離子通道按S/N=10計(jì)算，定性離子通道按S/N=3計(jì)算，以同時(shí)滿足定量離子通道S/N≥10與定性離子通道S/N≥3的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為定量限。以馬兜鈴酸Ⅰ為例，質(zhì)量濃度為2.06 ng·mL-1對(duì)照品溶液進(jìn)樣量1 μL時(shí)，定量定性離子通道的S/N分別為34.2和12.3，計(jì)算定量離子通道S/N=10的質(zhì)量濃度為0.6 ng·mL-1，定性離子通道S/N=3 的質(zhì)量濃度為0.5 ng·mL-1，則最低定量水平為0.01 μg·g-1，結(jié)果見表2。

表2 追風(fēng)透骨丸中4個(gè)馬兜鈴酸成分的回歸方程、線性范圍及定量限

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用70%甲醇配制10 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為2.12%、4.32%、1.96%、2.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，依次于0、3、6、9、11、14、18、21、24 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為2.44%、2.30%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取粉碎混勻的樣品，平行6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果未檢出馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.093 5、1.066 0 μg·g-1，RSD 分別為2.42%、2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品粉末取粉碎混勻的樣品約1.5 g，平行6 份，分別添加混合對(duì)照品溶液100 μL，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及RSD，見表3。

表3 追風(fēng)透骨丸中4個(gè)馬兜鈴酸成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測定

7 批追風(fēng)透骨丸樣品分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09～0.41 μg·g-1，馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.62～1.30 μg·g-1，樣品中均未檢出馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ，見表4。

表4 追風(fēng)透骨丸樣品中4個(gè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 μg·g-1

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

對(duì)追風(fēng)透骨丸處方進(jìn)行分析，處方中細(xì)辛用量為100 g，制成總量為1920 g，加上煉蜜最大制成總量為3072 g，在不考慮轉(zhuǎn)移率的情況下，參考細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ的限量，制劑中馬兜鈴酸Ⅰ理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過0.33 μg·g-1，含量很低；同時(shí)由于追風(fēng)透骨丸處方成分復(fù)雜，故選擇靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的基于MRM的LC-MS/MS。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在進(jìn)行化合物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中加入銨鹽能提升馬兜鈴酸類化合物的離子化效率，提高檢測靈敏度，使用甲酸銨緩沖液或乙酸銨緩沖液對(duì)色譜分離基本沒有區(qū)別，確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）體系。4個(gè)成分中馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅲ互為同分異構(gòu)體，具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量和離子碎片，需要通過色譜柱實(shí)現(xiàn)分離后才能檢測。分別在Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、WatersACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、島津ShimPack GIST C18（100 mm×2.1 mm，2 μm）、Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 種色譜柱上考察對(duì)上述2 個(gè)成分的分離，結(jié)果均獲得良好的分離效果。考慮樣品采用甲醇直接提取，等度洗脫時(shí)，樣品溶液可能會(huì)存在一些保留較強(qiáng)的極性基質(zhì)富集于色譜柱中，故洗脫程序采用前段等度、后段梯度的洗脫方式，可最大限度避免和基質(zhì)干擾物共流出。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

馬兜鈴酸是硝基菲類化合物，在正離子模式下易得到1 個(gè)H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，或加NH4+形成的[M+NH4]+，所以用正離子模式。分別取用4 個(gè)對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，在ESI+模式全掃描方式下，馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ得到較高豐度的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰m/z294，馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ得到較高豐度的[M+NH4]+離子峰m/z359、m/z329、m/z359。在確定母離子的基礎(chǔ)上采用子離子掃描方式對(duì)子離子的碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，選擇豐度較高的碎片離子為定量離子。

3.4 提取溶劑的選擇

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[5-7,11]，考察不同溶劑對(duì)追風(fēng)透骨丸中馬兜鈴酸的提取效果。精密稱取粉碎均勻的樣品適量，分別以甲醇、乙醇、70%甲醇為溶劑，各加入溶劑25 mL 后稱質(zhì)量，超聲處理40 min（500 W，40 kHz），放冷后用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ的提取效率甲醇≈70%甲醇>乙醇，對(duì)馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的提取效率甲醇>乙醇>70%甲醇。

3.5 方法的準(zhǔn)確性

馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ在20 ng·mL-1添加水平的平均回收率分別為104.2%、75.7%、112.0%、105.4%，RSD 分別為2.8%、3.6%、3.7%、6.1%，表明方法重復(fù)性良好，但馬兜鈴酸Ⅱ的回收率較馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的回收率明顯偏低。考慮基質(zhì)可能造成的影響，比較馬兜鈴酸Ⅱ定量離子對(duì)在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值（A1）與在陰性基質(zhì)中的響應(yīng)值（A2），結(jié)果顯示A2/A1約為1.05，未表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)效應(yīng)，排除基質(zhì)抑制的影響。研究顯示，馬兜鈴酸Ⅱ在定量限添加水平回收率約為65%，同時(shí)在擬定條件下馬兜鈴酸Ⅱ的質(zhì)譜響應(yīng)明顯低于其他3 個(gè)成分，分析馬兜鈴酸Ⅱ回收率偏低的原因可能與馬兜鈴酸Ⅱ的檢測靈敏度及較低的加標(biāo)水平有關(guān)[12]。

4 結(jié)論

基于本研究建立的方法，實(shí)現(xiàn)追風(fēng)透骨丸中馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的檢測，結(jié)果未檢出馬兜鈴酸Ⅱ和馬兜鈴酸Ⅲ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ。馬兜鈴酸Ⅰ含量基本低于理論值，馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ含量相對(duì)較高。馬兜鈴酸化合物種類已報(bào)道的約178 種，按結(jié)構(gòu)主要分為馬兜鈴酸類和馬兜鈴內(nèi)酰胺類，化合物種類不同毒性差異較大。已有研究表明，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ具有腎臟毒性和潛在致癌性[13-16]，馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的毒理學(xué)研究尚不充分[17]。有必要首先對(duì)具有明確毒性的馬兜鈴酸Ⅰ建立快速準(zhǔn)確的測定方法，研究制定科學(xué)合理的限量。