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    基于HPLC指紋圖譜的沙棘葉黃酮類功效成分研究△

    2024-01-03 09:58:22王寧寧高巖張梅溫秀鳳盧順光楊志剛
    中國現(xiàn)代中藥 2023年10期
    關鍵詞:異鼠李素號峰

    王寧寧,高巖,張梅,溫秀鳳,盧順光,楊志剛*

    1.蘭州大學 藥學院,甘肅 蘭州 730030;2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所,北京 100193;3.水利部沙棘開發(fā)管理中心,北京 100058

    沙棘為胡頹子科沙棘屬植物,近年來研究發(fā)現(xiàn),其葉具有藥用價值及大健康產(chǎn)品開發(fā)潛力[1]。目前,沙棘葉已被批準為新資源食品[2]。沙棘葉中蛋白質類、氨基酸類、多糖類、有機酸類、黃酮類、萜類及微量元素等活性物質含量豐富[3],尤其是具有抗炎、肝臟保護、抗氧化等活性的黃酮類功效成分含量顯著高于果實[4]。但大部分沙棘葉在收獲果實后被歸為農(nóng)業(yè)廢料,未得到合理利用[5]。沙棘葉富含黃酮醇苷,主要是異鼠李素和槲皮素衍生物[6]。張小民等[7]按照食品安全性毒理學評價程序和方法,對沙棘茶葉進行了急性毒性實驗,結果表明以沙棘茶葉提取物對小鼠經(jīng)口灌胃,半數(shù)致死量(LD50)>10 g·kg-1(以體質量計),屬無毒級物質,可作為安全的食品開發(fā)原料。沙棘有“天然營養(yǎng)庫”的美稱,其枝葉、果渣是優(yōu)良的畜禽補充飼料[8-9]。以沙棘葉為原料開發(fā)的沙棘葉茶產(chǎn)品相關研究也較多[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),沙棘葉和沙棘葉茶中總黃酮含量豐富,主要包含以異鼠李素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷類和可水解鞣質等成分,并且具有較強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[11]。建立沙棘葉中黃酮類功效成分高效液相色譜法(HPLC)定性、定量分析方法,對沙棘葉及沙棘葉茶等相關產(chǎn)品的質量評價和質量控制具有積極意義。HPLC 等色譜指紋圖譜技術在藥品、食品質量評價和質量控制領域應用廣泛[12]。本研究建立了不同產(chǎn)地沙棘葉HPLC 指紋圖譜,采用聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地沙棘葉質量進行評價,并測定了其中異鼠李素、槲皮素、山柰酚3 種黃酮類功效成分含量,以期為沙棘葉質量控制及其黃酮類功效成分產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

    1 材料

    1.1 樣品

    2018 年9 月采集15 批沙棘葉樣品,經(jīng)蘭州大學藥學院楊志剛教授鑒定為胡頹子科沙棘屬沙棘Hippophae rhamnoidesL.的葉,測試樣品標本保存于蘭州大學藥學院。樣品信息見表1。

    表1 不同產(chǎn)地沙棘葉樣品信息

    1.2 儀器

    EasySep-3030型液相色譜儀(包括EasySep-3030型紫外檢測器、AS-2000 型自動進樣器、EasySep-3030 型二元泵,上海通微公司);BSM220.4 型電子分析天平(上海卓精科技有限公司);SB25-12D型超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

    1.3 試藥

    對照品異槲皮苷、水仙苷(純度≥98%,成都麥德生科技有限公司);蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷(純度均≥98%,成都普菲德生物技術有限公司);表沒食子兒茶素、表兒茶素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯(純度均≥98%,上海詩丹德生物科技有限公司);沙棘寧B、英國櫟鞣花酸、木麻黃鞣寧為本課題組從沙棘葉中提取分離得到,純度均≥98%;色譜級乙腈、甲醇(德國默克公司);其他試劑為分析純。

    2 方法

    2.1 指紋圖譜

    供試品溶液的制備:稱取沙棘葉粉末約0.25 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱定質量,超聲提取30 min,放冷,再稱定質量,用70%甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    色譜條件:色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~40.0 min,10%~20%A;40.1~50.0 min,20%~40%A;50.1~60.0 min,40%~80%A;60.1~73.0 min,100%~10%A);進樣量為10 μL;流速為0.8 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測波長為280 nm。

    2.2 含量測定

    對照品溶液的制備:精密稱取槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品3.14、1.60、1.85 mg,分別加入甲醇配制成質量濃度為1.046 7、0.533 3、0.616 7 mg·mL-1的母液,之后用甲醇稀釋成梯度質量濃度的溶液,作為對照品溶液。

    供試品溶液的制備:稱取沙棘葉樣品粉末約0.50 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇50 mL,加熱回流30 min。精密量取續(xù)濾液25 mL,置具塞比色管中,加鹽酸3.5 mL,75 °C 水浴中加熱水解1 h,加甲醇定容至50 mL,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    色譜條件:色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(58∶42);流速為1.0 mL·min-1;柱 溫為30 ℃;進樣量為10 μL;檢測波長為370 nm。

    3 結果

    3.1 指紋圖譜

    3.1.1 方法學考察

    3.1.1.1 精密度試驗 樣品S1按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣5 次,峰1 相對保留時間的RSD 為0.48%,相對峰面積的RSD為0.96%,表明儀器精密度良好。

    3.1.1.2 穩(wěn)定性試驗 樣品S1 在貯存0、2、4、6、12、24 h 后按2.1 項下色譜條件進行分析,峰1 相對保留時間的RSD 為0.96%,相對峰面積的RSD 為4.68%,表明樣品溶液在24 h內較穩(wěn)定。

    3.1.1.3 重復性試驗 樣品S1按2.1項下方法平行制備5 份,測定,峰1 相對保留時間RSD 為0.86%,相對峰面積的RSD 為0.40%,表明該方法重復性良好。

    3.1.2 指紋圖譜 不同產(chǎn)地沙棘葉和對照品色譜圖見圖1。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012 版)軟件對15 批不同產(chǎn)地沙棘葉指紋圖譜進行相似度分析(表2),以樣品S1為參比樣品,不同產(chǎn)地沙棘葉相似度為0.647~0.910,13批樣品相似度均大于0.80,表明這些產(chǎn)地沙棘葉化學成分組成較為相似,產(chǎn)地因素對沙棘葉化學成分有一定影響;指紋圖譜共有26 個共有峰,以4 號峰為參比峰,以各共有峰對4 號峰的峰面積之比為相對峰面積,得到15 批樣品26 個色譜峰的標準化數(shù)據(jù)(表3)。通過和對照品tR比對共指認出9 個共有峰,其中4 號峰為英國櫟鞣花酸、13 號峰為沙棘寧B、14 號峰為木麻黃鞣寧、15 號峰為表兒茶素、17 號峰為表沒食子兒茶素、19 號峰為蘆丁、20號峰為異槲皮苷、21號峰為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、22號峰為水仙苷。

    圖1 沙棘葉和對照品HPLC圖

    表2 不同產(chǎn)地沙棘葉樣品HPLC指紋圖譜相似度

    表3 沙棘葉共有峰相對峰面積

    3.2 聚類分析

    聚類分析將15 批不同產(chǎn)地沙棘葉樣品聚為3 類(圖2)。其中,產(chǎn)地為新疆的樣品S5、S9、S11聚為一類;除S8 外,剩余樣品聚為一類,說明這些產(chǎn)地的沙棘葉質量較為接近,而新疆產(chǎn)地的沙棘葉與其他產(chǎn)地的沙棘葉化學成分差異較大。

    圖2 不同產(chǎn)地沙棘葉聚類分析

    3.3 主成分分析

    將26 個共有峰峰面積導入SIMCA-P 14.1 軟件,對所有樣品進行主成分分析,除樣品S8 外,沙棘葉樣品被分為2 類(圖3),新疆產(chǎn)地樣品S15、S11 和S9 距離其他產(chǎn)地的樣品較遠,說明新疆產(chǎn)地的沙棘葉和其他產(chǎn)地沙棘葉成分差異較大,這與聚類分析結果一致。

    圖3 不同產(chǎn)地沙棘葉主成分分析

    3.4 含量測定

    3.4.1 方法學考察

    3.4.1.1 線性關系考察 按2.2 項下色譜條件進樣分析,以混合對照品不同質量濃度為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,計算回歸方程,見表4。

    表4 槲皮素、山柰酚、異鼠李素的回歸方程、線性范圍和r

    3.4.1.2 精密度試驗 樣品S1按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄相對保留時間和相對峰面積,槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為0.93%、1.68%、1.89%,相對峰面積的RSD分別為2.60%、2.82%、3.36%,表明儀器的精密度良好。

    3.4.1.3 穩(wěn)定性試驗 按2.2項下條件制備樣品S1供試品溶液,在0、2、4、6、12、24 h后進行分析,槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為1.21%、1.80、0.33%,相對峰面積的RSD分別為2.04%、4.13%、3.22%,表明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

    3.4.1.4 重復性試驗 將樣品S1按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液,測定,槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD分別為1.74%、1.30%、1.35%,相對峰面積的RSD 分別為1.39%、3.32%、2.03%,表明該方法的重復性較好。

    3.4.1.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的沙棘葉粉末6份,每份約0.25 g,分別精密加入已知含量的異鼠李素、槲皮素、山柰酚對照品溶液,按2.2項下方法制備供試品溶液,再按2.2 項下色譜條件測定,記錄峰面積并計算平均加樣回收率,結果顯示,槲皮素、山柰酚、異鼠李素的平均加樣回收率分別為106.40%、103.65%、106.37%,RSD分別為2.23%、2.21%、2.79%。

    3.4.2 樣品測定 對不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量進行測定,結果見表5。不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.12%~0.33%、0.07%~0.32%、0.10%~0.49%。甘肅產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.18%~0.30%、0.13%~0.21%、0.16%~0.30%;山西產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.12%~0.33%、0.09%~0.17%、0.10%~0.26%;新疆產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.19%~0.27%、0.10%~0.15%、0.17%~0.49%。由此可知,產(chǎn)地對沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量影響較大,新疆生長的沙棘葉中異鼠李素含量較其他產(chǎn)地高,可能和其生長環(huán)境、采收時間等因素相關。

    表5 不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數(shù)(,n=6) %

    表5 不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數(shù)(,n=6) %

    4 討論

    本研究建立了不同產(chǎn)地沙棘葉的指紋圖譜,相似度及聚類分析結果表明,不同產(chǎn)地沙棘葉化學成分有一定差異。英國櫟鞣花酸、沙棘寧B 和木麻黃鞣寧3 種共有鞣質類成分具有較強的抗炎活性和抗肥胖活性[13]。表兒茶素、表沒食子兒茶素、水仙苷、蘆丁、異槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有體外降血糖活性[14]。對15批不同產(chǎn)地沙棘葉樣品中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量進行測定,結果表明,在不同產(chǎn)地樣品中這3 個黃酮類成分含量差異較大。山西忻州的樣品中槲皮素質量分數(shù)最高,為0.33%;內蒙古鄂爾多斯的山柰酚質量分數(shù)最高,為0.32%;新疆塔城樣品中異鼠李素質量分數(shù)最高,為0.49%。這可能和沙棘生長環(huán)境、采收時間等因素相關。建議將槲皮素、山柰酚和異鼠李素作為沙棘葉及其相關產(chǎn)品質量控制的指標成分。

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