督脈灸對腎陽虛大鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及ATP含量的影響

羅彩云，王志福，戴榮水，蘭艷艷，龐莉娜

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

腎陽虛是臨床常見證型之一，普遍存在各個系統(tǒng)疾病中，改善腎陽虛證候?qū)膊“l(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸起著至關(guān)重要的作用。腎陽虛的發(fā)生、發(fā)展與線粒體密切相關(guān)［1］，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛模型動物肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)不完整，甚至線粒體消失［2］。可見，肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)受損可能是腎陽虛發(fā)生的主要病理機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)督脈灸可明顯改善腎陽虛畏寒、怕冷等癥狀，但其作用機(jī)制尚不明確。故本研究從肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的角度，初步探討督脈灸治療腎陽虛的作用機(jī)制，為其在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量（280±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生成許可證號：SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室中心SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。大鼠每日光照12 h 明暗交替，在室溫（22±1）℃、濕度50%～70%環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批（FJTCM-IACUC 2022025）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 艾絨購自南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 氫化可的松注射液（山西省芮城縣獸藥有限責(zé)任公司，貨號：56688）；電鏡固定液、ATP 含量檢測試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司（貨號：G1102、BC0305）；無水乙醇、丙酮均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；D3024R 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海啟前電子科技有限公司）；MX-F 渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；JB-P5 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；UC7 超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；HT7700 透射電鏡（日本Hitachi 公司）；Epoch 酶標(biāo)檢測儀（美國Bio-Tek 公司）；Ultra 45°鉆石切片刀（瑞士Daitome 公司）；LC-2030 高效液相色譜儀［日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司］；YHM-2kg 0.01 英衡電子秤（惠州市英衡電子科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24 只SD大鼠分為空白組、模型組和督灸組，每組8 只?？瞻捉M不予造模；模型組和督灸組按25 mg/kg 皮下注射氫化可的松注射液，每日1 次，連續(xù)注射7 d，當(dāng)大鼠體質(zhì)量和肛溫均明顯降低，并表現(xiàn)出畏寒肢冷、卷縮扎堆等狀態(tài)時(shí)，提示腎陽虛大鼠造模成功［3］，見表1。

表1 3 組造模前后體質(zhì)量、肛溫比較（±s）

表1 3 組造模前后體質(zhì)量、肛溫比較（±s）

注：與造模前比較，1） P＜0.05；與空白組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組督灸組肛溫/℃35.19±0.36 35.21±0.35 35.01±0.24 34.38±0.301）2）35.04±0.45 34.48±0.311）2）n888時(shí)間造模前造模后造模前造模后造模前造模后體質(zhì)量/g 295.75±3.77 337.88±4.991）300.00±9.61 277.57±15.931）2）298.75±9.32 277.75±11.211）2）

2.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將督灸組大鼠固定于鼠板上，充分暴露背部，剔除背部施灸部位的毛發(fā)。以督脈為中心，將長8 cm、寬4 cm 的純棉薄布平鋪于督脈上，將打碎好的姜泥做成底寬1 cm、頂寬0.5 cm、高0.5 cm 的梯狀，平鋪在純棉薄布上；將厚約1 cm 艾絨鋪于姜泥之上，點(diǎn)燃艾絨，至其完全燃盡。在皮膚與棉布之間放置2 個溫度控制器，控制灸溫在38 ℃，若高于38 ℃則再墊一層棉布。隔日1 次，連續(xù)督脈灸4 次?？瞻捉M和模型組大鼠同督灸組固定在鼠板上，但不予督脈灸干預(yù)。

2.3 取材 3 組大鼠取材前一晚禁食過夜，次日早上按1 mL/100 g 腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠后［4］，剖開大鼠腹腔，快速取下肝臟，用預(yù)冷PBS 緩沖液清洗，過濾紙吸凈殘留在肝組織表面的PBS 緩沖液，用剪刀將肝組織分成2 份，一部分置于4 ℃、2.5%戊二醛電鏡固定液中，用于透射電鏡觀察。另一部分肝組織放置于冰浴上剪碎成泥狀，按體質(zhì)量（g）∶提取液體積（mL）=1∶9 的比例稱取0.1 g肝臟組織，加入0.9 mL 生理鹽水進(jìn)行冰浴勻漿，制備成10%勻漿液，在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，提取上清液至另一EP 管中，加入500 μL 氯仿充分震蕩混勻，置冰上備用，用于肝細(xì)胞線粒體ATP 含量測定。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 體質(zhì)量及肛溫測定 應(yīng)用電子秤、體溫計(jì)測定3 組干預(yù)前后體質(zhì)量、肛溫，并記錄。

2.4.2 肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)觀察 取出2.5%戊二醛電鏡固定液中備用的肝組織，常規(guī)石蠟包埋、修塊、定位、超薄切片后用透射電鏡觀察組織切片，先在低倍視野（×1 000～5 000）下確定觀察區(qū)域，然后在高倍視野（×10 000～50 000）下觀察肝細(xì)胞線粒體的分布、形態(tài)變化。

2.4.3 肝細(xì)胞線粒體ATP 含量檢測 取出置冰上備用的上清液，在10 000 r/min、4 ℃下離心3 min，取上清，將上清液加樣于酶標(biāo)板孔中，余操作嚴(yán)格按照大鼠ATP 含量檢測試劑盒說明書測定步驟進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3 組體質(zhì)量、肛溫比較 見表2。

表2 3 組體質(zhì)量、肛溫比較（±s）

表2 3 組體質(zhì)量、肛溫比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

肛溫/℃35.24±0.64 34.70±0.36 36.28±0.392）組別空白組模型組督灸組n888體質(zhì)量/g 365.62±8.12 311.42±16.671）315.13±12.48

3.2 3 組大鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化 空白組大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)量豐富，大部分線粒體膜完整，嵴存在，膜內(nèi)基質(zhì)均勻。模型組大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯減少，分布不均勻，部分線粒體核膜模糊，嵴減少，出現(xiàn)嚴(yán)重的膜破損、崩解。督灸組大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)量較多，形態(tài)較完整，基質(zhì)淺，嵴少量斷裂、變短，個別損傷嚴(yán)重者可見灶性改變。見圖1。

圖1 3 組大鼠肝組織電鏡圖（×50 000）

3.3 3 組肝細(xì)胞線粒體ATP 含量比較 見表3。

表3 3 組肝細(xì)胞線粒體ATP 含量比較（±s） μmol/g

表3 3 組肝細(xì)胞線粒體ATP 含量比較（±s） μmol/g

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ATP 4.12±0.15 3.24±0.661）4.09±0.202）組別空白組模型組督灸組n888

4 討 論

腎陽是溫煦、推動、調(diào)節(jié)人體各種生命活動的原動力，為諸陽之本。腎陽虧虛，一切生命活動動力不足，溫煦、推動、調(diào)節(jié)功能下降，臟腑功能衰退，導(dǎo)致各種嚴(yán)重疾病發(fā)生。線粒體是機(jī)體能量代謝的主要場所，碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)素最終均在線粒體中被氧化磷酸化并釋放能量（ATP），細(xì)胞活動所需95%能量均來自線粒體，故線粒體又被認(rèn)為是機(jī)體生命活動動力工廠［5］。線粒體在細(xì)胞增殖、代謝和凋亡等過程中起著至關(guān)重要的作用［6］，在功能上調(diào)控能量的產(chǎn)生、電子傳遞鏈、細(xì)胞信號、凋亡和程序性細(xì)胞死亡，線粒體的功能紊亂會導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題［5］?？梢姡嗅t(yī)的“腎陽”對機(jī)體的溫煦、推動、調(diào)控作用與現(xiàn)代生物學(xué)“線粒體能量代謝”對生命活動的推動、調(diào)控作用有著共通之處，中醫(yī)“腎陽”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)能量物質(zhì)“ATP”有著共性的含義［7］。

線粒體由雙層膜構(gòu)成，其內(nèi)膜結(jié)構(gòu)在能量轉(zhuǎn)換功能中起著主要作用。線粒體內(nèi)膜內(nèi)為基質(zhì)，內(nèi)膜高度摺疊形成許多嵴伸入基質(zhì)，增加了內(nèi)膜表面積。線粒體內(nèi)膜上分布有電子傳遞復(fù)合物和線粒體代謝相關(guān)酶蛋白分子，故線粒體結(jié)構(gòu)與ATP 合成密切相關(guān)。若線粒體嵴膜破壞、線粒體腫脹將引起線粒體電子傳遞受阻，氧化磷酸化解偶聯(lián)，產(chǎn)能下降，導(dǎo)致ATP 合成減少［8］。肝臟中存在著大量線粒體，是機(jī)體調(diào)節(jié)能量和存儲能量的重要器官。研究表明，腎陽虛模型大鼠肝臟細(xì)胞線粒體腫脹，內(nèi)膜邊緣模糊不完整，嵴排列紊亂，出現(xiàn)云絮樣變，甚至斷裂消失，電子密度變低，基質(zhì)顏色較淡，部分線粒體空泡樣變性、消失；肝臟組織Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性顯著降低，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化的產(chǎn)能過程障礙，ATP 含量減少，體質(zhì)量、體溫顯著降低［2，7，9-10］。綜上所述，腎陽虛發(fā)生與肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)受損，ATP 合成障礙存在密切相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示：① 腎陽虛大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯減少，分布不均勻，部分線粒體核膜模糊，嵴減少，甚至出現(xiàn)膜破損、崩解，結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，提示肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞可能是腎陽虛的重要病理基礎(chǔ)。② 督脈灸可有效促進(jìn)腎陽虛大鼠肛溫回升，可明顯改善腎陽虛畏寒、怕冷的癥狀。③ 督脈灸干預(yù)可使腎陽虛大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)量增多，分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)得以修復(fù)，ATP 含量增加，提示督脈灸可能通過修復(fù)肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，增加ATP含量，進(jìn)而提高機(jī)體線粒體能量代謝，從而改善腎陽虛證候。