均相合成多重選擇性的新型兩親性C22高效液相色譜固定相

范二樂，蔣星宇，張加棟*，張明亮，韓海峰，，張大兵，，陳 義，3

（1.淮陰工學(xué)院 礦鹽資源深度利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，高端礦鹽功能材料智能制備國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 淮安 223003；2.江蘇漢邦科技股份有限公司，江蘇 淮安 223000；3.中國科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)科學(xué)院重點實驗室，北京 100190）

色譜固定相的性質(zhì)決定了保留機理、分離效率以及適合的分離對象［1-2］。反相液相色譜（RPLC）是目前最為常用的一類分離模式，有丁基（C4）、辛基（C8）、十二烷基（C12）、十八烷基（C18）等各種疏水性固定相［3-4］可供選擇。但RPLC 不適用于對極性特別是強極性化合物的分離。在其烷基鏈上嵌入極性基團，如脲（U）［5-7］、氨基甲酸酯［8-9］、酰胺（A）［10-14］、咪唑啉［15］、磷酸根［16］、季銨［17］等基團是改善其對極性化合物分離性能的一種有效手段。嵌入基團還能改變或引入新的選擇機制，比如酰胺基會引入氫鍵等新作用機制，因而可以成為一種多模式或混合模式分離的新型高效液相色譜（HPLC）固定相［7］。

在嵌入型固定相的研究方面，Nogueira 等［18］合成了嵌有硫醚基團的十一烷基氨基奎尼考定固定相；Qiu等［19］制備了聚1-（2-丙烯酰氧十二烷基）-3-甲基咪唑溴化銨固定相；Mallik 等［20］制得了嵌有多重酰胺的C18 固定相等。上述研究將多個基團引入色譜固定相主要存在以下問題：如功能分子的鍵合過程常在非均相反應(yīng)狀態(tài)下進行，易出現(xiàn)固定相密度波動等問題，給色譜行為考察和結(jié)果解讀等造成一定的困難；此外，非均相反應(yīng)需要較繁復(fù)的基團保護與脫保護過程，對選擇嵌入目標(biāo)基團非常不利，當(dāng)仲胺和伯胺共存時，若不用叔丁氧?；M行多次保護，很難選擇嵌入到對稱多胺化合物中［20-21］。

另一方面，在均相反應(yīng)條件下，基團可實現(xiàn)選擇性功能化，從而有效避免上述情況的出現(xiàn)。比如，對于酰胺的合成，酯在特定催化劑作用下可以實現(xiàn)多胺的選擇性酰化［22］。同時，N-?；溥蛞部梢愿哌x擇性、高效地?；?，生成酰胺，省去了繁瑣的保護和脫保護過程，且反應(yīng)條件溫和［23］。

本文利用均相反應(yīng)合成兩種新型兩親性色譜固定相。首先，在催化劑的作用下，選擇性?；铣闪薔-［3-（三甲氧基硅）丙基-N′-二十二酰乙二胺（C22-A-硅烷）；然后，利用免保護酰胺化反應(yīng)將酰胺外的仲胺轉(zhuǎn)化成脲基，制備了酰胺/脲雙嵌入的N-［3-（三甲氧基硅）丙基-N-二甲胺甲酰基-N′-二十二酰乙二胺（C22-A/U-硅烷）；最后，經(jīng)硅烷化反應(yīng)將上述兩種硅烷鍵合到硅膠載體上，得到目標(biāo)固定相C22-A 和C22-A/U。相較于非均相接枝法合成的硅膠固定相，這種均相合成目標(biāo)硅烷并鍵合至硅膠載體的方法免除了繁復(fù)的基團保護與脫保護過程，具有更高的轉(zhuǎn)化率，可保證接枝體的均一性，非常有助于固定相色譜行為的解讀。實驗結(jié)果表明，兩種新型硅膠固定相既能用于反相液相色譜分離也能用于親水相互作用色譜分離，展現(xiàn)出非常好的兩親性能，具有一定的應(yīng)用開發(fā)前景和理論研究價值。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

全多孔球形硅膠（平均直徑：5 μm，比表面積：350 m2/g，孔容：1.0 mL/g）購于日本AGC 公司；C18 改性色譜硅膠（粒徑：5 μm）購于日本富士公司；色譜柱均采用4.6 mm×150 mm 的不銹鋼柱裝填；二十二酸、N，N′-羰基二咪唑（CDI）、六甲基二硅氮烷（HMDS）、N，N-二甲氨基甲酰氯、雌激素等購于上海安耐吉化學(xué)有限公司；N-［3-（三甲氧基硅基）丙基］乙二胺（AEAPS）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜級甲苯（Tol）、甲醇（MeOH）、乙腈（MeCN）均購于國藥化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)參照物（SRM 870，SRM869b）購于美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）。掃描電子顯微鏡（SEM）為S-3000N（日本HITACHI 公司），固態(tài)13C 核磁共振儀為JNM-ECZ 600R（日本電子株式會社（JEOL）），元素分析由ElementarVario EL III型元素分析儀（德國哈瑙）完成。

1.2 固定相的制備

1.2.1 C22-A 硅膠鍵合固定相的制備稱取50 mmol 二十二酸（乙酸乙酯重結(jié)晶3 次）溶于50 mL 甲苯；共沸除水，待降溫至90 ℃后，少量多次地加入50 mmol 的CDI，反應(yīng)2 h；再加入N-［3-（三甲氧基硅基）丙基］乙二胺，繼續(xù)反應(yīng)8 h；降溫至70 ℃，減壓蒸餾除去甲苯后，加入75 mL乙腈，充分溶解后靜置冷卻結(jié)晶。產(chǎn)物C22-A-硅烷經(jīng)離心收集，用乙腈洗滌2次，干燥后待用。

稱取10 g 硅膠，在機械攪拌下懸浮于50 mL 甲苯中；加入7 g 干燥的C22-A-硅烷，回流反應(yīng)24 h；趁熱過濾，用熱甲苯洗滌3 次，70 ℃烘干。隨后懸浮于甲苯中，用六甲基二硅氮烷做封尾處理20 h。反應(yīng)結(jié)束后過濾收集C22-A 鍵合硅膠顆粒，用沸甲醇洗滌3 次，烘干后即可用于裝柱。流程如圖1 中Route 1所示。

圖1 C22-A與C22-A/U鍵合硅膠固定相的制備路徑Fig.1 Routes to prepare on-silica-bonded C22-A and C22-A/U stationary phases

1.2.2 C22-A/U 硅膠鍵合固定相制備取12 g 干燥C22-A-硅烷溶于甲苯，加入等摩爾三乙胺；在70 ℃下滴加等摩爾N，N-二甲氨基甲酰氯，反應(yīng)4 h。過濾除去三乙胺的鹽酸鹽，取濾液蒸出甲苯，再用無水乙腈洗滌后與硅膠鍵合，135 ℃回流24 h，其余處理同上。制備流程如圖1中Route 2所示。

1.3 色譜柱制備

色譜柱由勻漿液填充法制備。稱取2.2 g C22-A或C22-U/A 鍵合硅膠顆粒，懸浮于40 mL三氯甲烷中，超聲勻漿。在50 MPa液壓下，以乙腈為頂替液，將勻漿壓入不銹鋼柱管（4.6 mm×150 mm）中。裝填完成后，將色譜柱安裝至液相色譜儀上，用純甲醇沖洗30 min后備用。

1.4 色譜分析

所有色譜測試均在漢邦Newstyle 高效液相色譜系統(tǒng)上進行。該裝置配備NP 7000 二元泵、NU 3000紫外-可見檢測器、柱溫箱和Rheodyne 7725進樣器。采用等度洗脫分離，參數(shù)設(shè)定為：流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃、進樣量5 μL、紫外檢測波長254 nm。所有流動相和分析樣品在使用前均經(jīng)0.45 μm多孔膜過濾，臨用時再超聲脫氣。

RPLC：用4∶1（體積比）的甲醇/20 mmol·L-1中性磷酸鉀緩沖液分離SRM870，用9∶1（體積比）的甲醇/水分離烷基苯、烷基聯(lián)苯、三聯(lián)苯異構(gòu)體、三亞苯，用純甲醇分離SRM869b。

HILIC：用體積比為5∶95～95∶5 的乙腈/20 mmol·L-1乙酸銨緩沖液分離甲苯與胞苷，用純水分離胞苷與尿苷，用15∶85（體積比）的乙腈/0.1%甲酸水溶液分離磺胺類藥物，用3∶2的甲醇/水分離三環(huán)抗抑郁藥，用3∶1的甲醇/水分離雌激素（在230 nm檢測）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜固定相表征

2.1.1 元素分析及色譜性能表征表1 匯總了新制備的C22-A、C22-A/U 與傳統(tǒng)C18 固定相的重要參數(shù)。表1 顯示，C22-A 和C22-A/U 鍵合硅膠固定相比商品C18 固定相多出了氮元素，且C22-A/U 的相對含氮量（1.83%）約為C22-A（1.38%）的1.5倍，初步說明含氮基團（酰胺和脲基極性基團）的存在，碳、氮元素同時出現(xiàn)且比例符合理論值，說明預(yù)先合成的功能化硅烷均已成功鍵合到硅膠上。C22-A/U 和C22-A 的區(qū)別在于前者的鍵合密度（2.18 μmol·m-2）高于后者（1.89 μmol·m-2），脲基對鍵合量的提升具有促進作用。C22-A 和C22-A/U 的鍵合密度均小于C18（2.67 μmol·m-2），原因可能是二者的二十二烷基碳鏈更長，位阻更大。

表1 C22-A、C22-A/U鍵合硅膠固定相的元素分析與色譜性能表征結(jié)果Table 1 Elemental analysis and chromatographic characterization of C22-A and C22-A/U bonded silica gel

2.1.2 固態(tài)13C 核磁共振波譜分析為進一步證明硅烷配體的結(jié)構(gòu)，采用固態(tài)13C 核磁共振技術(shù)表征了新制備的C22-A固定相（圖2）。其中，化學(xué)位移174.1 ppm處為酰胺基的羰基碳振動峰，30 ppm處為亞甲基碳的主峰，對應(yīng)于長脂肪鏈的扭曲構(gòu)象，此構(gòu)象是可移動和無定形的［24］；而30.7 ppm 處的小肩峰證明了反式構(gòu)象的存在，此構(gòu)象是剛性和有序的［25］，但反式構(gòu)象不明顯。由此可見C22 的大部分鏈處于無序狀態(tài)，其原因可能是鍵合密度較低。結(jié)果表明含酰胺極性配體的硅烷成功接枝到硅膠表面，同時證實了配體結(jié)構(gòu)。

圖2 C22-A固定相的固態(tài)13C核磁共振譜圖Fig.2 Solid-state 13C NMR spectrum of C22-A

C22-A/U 固定相的固態(tài)13C 核磁共振波譜如圖3 所示，175 ppm 處與30 ppm 處的峰信號明顯，分別為酰胺和脲基的羰基碳的吸收峰以及碳二十二鏈的亞甲基碳的吸收峰，說明極性基團和碳二十二鏈成功鍵合到硅膠表面。

圖3 C22-A/U固定相的固態(tài)13C核磁共振譜圖Fig.3 Solid-state 13C NMR spectrum of C22-A/U

2.1.3 掃描電子顯微鏡表征對未鍵合硅膠和C22-A 和C22-A/U 的硅膠固定相分別進行掃描電子顯微鏡（SEM）表征，結(jié)果如圖4 所示。從SEM 圖可以看出，硅膠鍵合前后的外觀形貌無明顯變化，硅膠微球未發(fā)生粘連、破裂等不良情況，微球形狀規(guī)則、單分散性良好。由此可以證明，硅膠微球的機械強度和分離穩(wěn)定性良好，不易發(fā)生惡性形變，適于色譜柱的裝填。

圖4 裸硅膠（A）、C22-A（B）以及 C22-A/U（C）的SEM圖Fig.4 SEM images of bare silica gel（A），C22-A（B） and C22-A/U（C）

2.2 色譜固定相性能分析

2.2.1 殘余硅羥基活性與疏水選擇性色譜固定相多數(shù)鍵合在硅膠載體上，常會殘留硅羥基等非特異性吸附活性位點，易導(dǎo)致峰拖尾、柱效下降等問題。合成的新型固定相在靠近硅膠表面一端碳鏈上嵌有脲與酰胺基團，鏈之間在此處易形成氫鍵，可能形成覆蓋活性位點的大網(wǎng)絡(luò)，從而可以有效屏蔽活性位點產(chǎn)生的不利影響；同時嵌入基團也可能影響固定相的疏水選擇性和芳香選擇性。為此，采用仿SRM870［26］五組分配方進行色譜表征：其中，以尿嘧啶測量死時間，以堿性阿米替林考察硅膠表面殘余硅羥基的活性，以甲苯和乙苯測定疏水選擇因子。

如圖5 所示，阿米替林在C18 柱上拖尾明顯，保留時間長（圖5A），而在C22-A 和C22-A/U 上出峰對稱且快速（圖5B、C），表明嵌入的酰胺和脲基能有效屏蔽硅羥基的不利作用。如表1 所示，相較于阿米替林在常規(guī)C18 固定相的拖尾因子（2.84），其在C22-A 和C22-A/U 的拖尾因子分別為1.07 和1.06，表明雙重嵌入的極性基團極大地降低了固定相硅羥基的活性，為堿性化合物的分離奠定了基礎(chǔ)。

圖5 自配仿SRM870在 C18（A）、C22-A/U（B）和C22-A（C） 柱上測得的色譜圖Fig.5 Chromatograms of laboratory-prepared SRM870 eluted by C18（A），C22-A/U（B） and C22-A（C） columns

由表1 可知，C22-A 和C22-A/U 由于嵌入了親水基團會抵消一些碳鏈的疏水作用，柱效比應(yīng)用于RPLC的C18差，αEtB/Tol也稍低于C18，但足以基線分離甲苯和乙苯，初步表明利用該方法制備的兩種極性嵌入型固定相可以用于RPLC分離。

2.2.2 形狀選擇性兩種新固定相還具備形狀分辨能力，可用多環(huán)芳烴混合物SRM869b［27-28］的色譜分離（圖6）來檢驗。SRM869b 的選擇因子（αTBN/BaP）小于1.0 時為強形狀選擇性，大于1.7 時為弱選擇性，介于1.0～1.7 時為中等強度選擇性。C22-A/U 和C22-A 對四苯并芘和苯并芘的選擇因子介于1.0～1.7 之間（分別為1.32、1.40），為中等強度選擇性；而C18 測得值為1.80，形狀選擇性更弱。

圖6 用 C18（A）、C22-A/U（B）和C22-A（C）柱測得的SRM869b色譜圖Fig.6 Chromatograms of SRM869b eluted by C18（A），C22-A/U（B） and C22-A（C） columns

以鄰三聯(lián)苯（o-Ter）、間三聯(lián)苯（m-Ter）、對三聯(lián)苯（p-Ter）、三亞苯（Tri）為樣品，分析了新固定相對平面異構(gòu)體的識別能力，其中Tri 和o-Ter 的長寬比接近，但分子平面結(jié)構(gòu)不同，其αTri/o-Ter可度量固定相的平面選擇性［29］，結(jié)果是：C22-A/U（2.29）＞C22-A（2.18）＞＞C18（1.45）。這說明帶有酰胺和脲兩種羰基極性基團的C22 烷基鏈能強化固定相的平面識別能力。C22-A 對多環(huán)芳烴異構(gòu)體良好的形狀識別能力，是因為固定相與多環(huán)芳烴之間存在羰基π-苯π 相互作用，而脲基與酰胺結(jié)構(gòu)相似，結(jié)果顯示嵌有酰胺、脲基雙重基團的固定相的形狀選擇性略優(yōu)于單酰胺的C22-A。

2.2.3 親水作用分析C22-A 和C22-A/U 嵌有強極性親水基團，具有兼容100%水為流動相的可能性。以純水為流動相分離了胞苷和尿苷。在純水流動相中，多次重復(fù)進樣獲得的保留時間（表2）不隨進樣次數(shù)縮短，說明二者均具有可被水完全浸潤的特征［7］。

表2 由C22-A和C22-A/U測得的胞苷和尿苷的保留時間變化Table 2 Retention time changes of cytidine and uridine measured by C22-A and C22-A/U

以甲苯和胞苷為基準(zhǔn)物，在HILIC模式下測得了兩者的保留因子隨流動相中乙腈比例變化的曲線。圖7A顯示，在C22-A上胞苷的保留因子只在很窄的范圍內(nèi)隨乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加而增強，可見C22-A表現(xiàn)出典型的HILIC 保留機制，不具備混合色譜模式特征。對于C22-A/U（圖7B），甲苯的保留因子隨乙腈體積分?jǐn)?shù)的下降而上升，是典型的RPLC 特征；而胞苷的保留因子則先降后升，呈現(xiàn)U 型曲線，具有混合模式保留特征。通過調(diào)節(jié)流動相的組成和配比［30］，可實現(xiàn)C22-A 和C22-A/U 在不同模式下的分離，極大地方便了操作。

圖7 在C22-A（A）和 C22-A/U（B）上測得的甲苯與胞苷保留因子隨流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的變化曲線Fig.7 Retention factor plots of toluene and cytidine against volume fraction of acetonitrile in the mobile phases measured on C22-A（A） and C22-A/U（B） columns

2.3 新型色譜固定相應(yīng)用

2.3.1 堿性化合物的分離為考察新制備固定相對堿性化合物的分離能力，以阿米替林等7種三環(huán)抗抑郁藥組成的混合物作為分析物對兩種色譜柱進行了評價（圖8），7種堿性化合物40 min內(nèi)在兩種色譜柱上全部被洗脫，且峰形較好。C22-A/U 對阿莫沙平和多塞平表現(xiàn)出更優(yōu)越的分離能力，這也體現(xiàn)了嵌入脲基的優(yōu)勢，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因還有可能是C22-A/U 的含碳量高于C22-A?？傮w來說，此兩種固定相對堿性化合物具有良好的識別能力，嵌入極性酰胺基和脲基的C22 固定相在一定程度上可以解決傳統(tǒng)C18固定相對堿性化合物分離拖尾嚴(yán)重或保留不足的問題。

圖8 7種三環(huán)抗抑郁藥在C18柱（A）、C22-A/U柱（B）和C22-A柱（C）上的色譜圖Fig.8 Chromatograms of 7 types of tricyclic antidepressants on C18（A），C22-A/U（B） and C22-A（C） columns

2.3.2 雌醇（酮）類化合物的分離使用C22-A、C22-A/U和C18柱分離含雌三醇、雌酮以及兩種雌二醇異構(gòu)體的四組分溶質(zhì)（圖9），結(jié)果表明C22-A和C22-A/U 可以實現(xiàn)4種雌激素的完全分離，而C18未能完全分離，說明兩種極性嵌入固定相對雌激素的多環(huán)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的親和力。其中，C22-A/U 對雌酮和雌二醇異構(gòu)體的選擇性遠高于C22-A，說明溶質(zhì)和脲基之間氫鍵相互作用的重要性。

圖9 4種雌激素在C18柱（A）、C22-A（B）柱和C22-A/U柱（C）上的色譜圖Fig.9 Chromatograms of 4 types of estrogens on C18（A），C22-A（B） and C22-A/U（C） columns

3 結(jié) 論

本文建立了兩親性色譜固定相的均相合成新方法，制備了兩種新型色譜固定相C22-A和C22-A/U。它們既具有C22 長鏈烷基末端，又具有能屏蔽載體殘余活性的脲和酰胺強極性基團。通過對不同標(biāo)樣和實際樣品的成功分離，證實兩種新型色譜固定相除了疏水性和親水性特征外，還具有較好的形狀選擇性，既能用于RPLC又能用于HILIC，可極大地擴大其應(yīng)用范圍，具有較高的實用價值和開發(fā)潛力。