不同溫度凝膠對(duì)大鼠寒區(qū)皮膚放射損傷修復(fù)的研究*

劉穎，王思潼，王秋

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1.急診醫(yī)學(xué)科，2.核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

皮膚是人體覆蓋面積最大、具有重要屏障及保護(hù)作用的器官，也因此成為極易發(fā)生損傷的部位。機(jī)體全身或局部受到放射線外照射或放射性核素沾染時(shí)，皮膚首當(dāng)其沖。皮膚受電離輻射照射引起的損傷統(tǒng)稱皮膚放射損傷。因此，關(guān)于皮膚損傷的研究也越來(lái)越受到重視。雖然大部分皮膚損傷可自然愈合，但皮膚放射損傷依靠自身的力量較難愈合，成為威脅患者生命的主要因素[1-2]。目前針對(duì)皮膚放射性損傷的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制及救護(hù)策略研究已逐步深入。我國(guó)疆域廣袤，寒區(qū)面積占陸地面積的43.5%，部分區(qū)域冬季室外溫度在-20 ℃～-30 ℃的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2 個(gè)月以上。寒區(qū)生活著大量的居民和官兵，但低溫環(huán)境下皮膚放射損傷的變化特點(diǎn)及救護(hù)策略尚不明確，需要進(jìn)一步研究[3-4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能有效促進(jìn)血管再生，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）特異表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞，膠原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）和膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）是參與皮膚修復(fù)的重要蛋白，人血小板衍生生長(zhǎng)因子D（platelet-derived growth factor D,PDGFD）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β（transforming growth factor-β,TGF-β）參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)。檢測(cè)上述蛋白和生長(zhǎng)因子水平能夠有效驗(yàn)證皮膚放射性損傷干預(yù)后的促愈合效果[5-7]。因此，本研究擬復(fù)制寒區(qū)皮膚放射損傷大鼠模型，觀察其損傷特點(diǎn)，并探討不同溫度水凝膠對(duì)寒區(qū)皮膚放射損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

20 只健康雄性SD 大鼠購(gòu)自沈陽(yáng)艾科賽斯生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK20190002。甲殼素納米纖維促修復(fù)凝膠由中國(guó)科學(xué)院金屬研究所自制并提供。VEGF、α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型復(fù)制20 只SD 大鼠隨機(jī)分為4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組，每組10 只。所有大鼠于-20 ℃低溫環(huán)境飼養(yǎng)1 周后，用2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，于背部?jī)蓚?cè)采用鍶-90照射10 min 復(fù)制SD 大鼠寒區(qū)皮膚放射損傷模型。4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠右側(cè)損傷采用相應(yīng)溫度凝膠覆蓋干預(yù)，左側(cè)不做任何處理作為模型對(duì)照（自身對(duì)照）。傷后第0、7、14、21、28、35 和42 天觀察大鼠皮膚修復(fù)情況；于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)麻醉處死所有大鼠，收集皮膚組織樣本進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 鍶-90照射后大鼠的一般情況觀察記錄大鼠的飲食攝水及體重變化；記錄大鼠照射區(qū)皮膚變化并采用皮膚半定量評(píng)分評(píng)估皮膚狀況：1.0 分為正常皮膚；1.5 分為輕度紅斑、干燥；2.0 分為中度紅斑、干燥；2.5 分為明顯紅斑、干燥脫屑；3.0 分為干燥脫屑、輕度干燥結(jié)痂；3.5 分為干燥脫屑、結(jié)痂，表皮少量結(jié)痂；4.0 分為斑片狀濕潤(rùn)脫屑，中度結(jié)痂；4.5 分為融合性濕性脫屑、潰瘍，大量深的結(jié)痂；5.0 分為開(kāi)放性傷口、全層皮膚脫落。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測(cè)將大鼠皮膚組織樣本室溫下固定于10%甲醛緩沖液中，并通過(guò)徠卡微系統(tǒng)組織處理器（ASP 300S，德國(guó)徠卡公司）將其包埋在石蠟中。進(jìn)行4 μm 厚的切片后，用蘇木精和伊紅染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.4 Western blotting 檢測(cè)在大鼠皮膚組織樣本中加入裂解液，研磨成勻漿，12 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用BCA 按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行組織總蛋白測(cè)定后，將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫封閉1 h，GAPDH 為內(nèi)參，分別用VEGF、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和GAPDH 一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 漂洗3 次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，用ECL Western 印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)VEGF、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表達(dá)，Image J 圖像分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行測(cè)量分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。將大鼠皮膚組織樣本勻漿后，10 000 r/min 離心20 min，收集上清液，加樣，37 ℃孵育30 min，洗滌后加入50 μL 酶標(biāo)試劑，37 ℃孵育30 min，顯色，終止，測(cè)定光密度值并分別計(jì)算PDGFD 和TGF-β 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況比較

4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠照射后第14 天與第0 天的體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；照射后第14 天大鼠體重較第0 天降低。4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠同一天的體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠照射后第0天與第14天體重比較（n=10，g，±s）

表1 大鼠照射后第0天與第14天體重比較（n=10，g，±s）

組別4 ℃凝膠組37 ℃凝膠組t 值P 值第0天257.5±2.5 257.4±2.6 1.321 0.453 t 值37.051 32.435 P 值0.000 0.000第14天197.6±2.7 197.1±2.1 1.533 0.395

自身對(duì)照、4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠照射第0 天、第7 天、第14 天的皮膚損傷評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；照射后第7 天和第14 天皮膚損傷評(píng)分高于第0 天。自身對(duì)照、4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠照射第7 天和第14 天的皮膚損傷評(píng)分組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。第14 天出現(xiàn)皮膚損傷后，大鼠性情暴躁，精神亢奮，活動(dòng)增多。

表2 大鼠照射后不同時(shí)間皮膚損傷評(píng)分（分，±s）

表2 大鼠照射后不同時(shí)間皮膚損傷評(píng)分（分，±s）

組別自身對(duì)照4 ℃凝膠組37 ℃凝膠組F 值P 值F 值861.312 781.122 809.326 P 值0.000 0.000 0.000第0天1.14±0.03 1.11±0.02 1.11±0.02 1.011 0.341第7天2.51±0.10 1.79±0.11 1.29±0.05 789.822 0.000第14天3.71±0.13 2.44±0.12 1.82±0.03 738.213 0.000

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合情況

照射后，大鼠均出現(xiàn)不同程度的皮膚損傷。照射后第21 天，大鼠自身對(duì)照左側(cè)出現(xiàn)顯著性紅斑、脫皮，皮膚輕微破損但無(wú)滲出液，皮膚損傷達(dá)最大傷口破損、局部膿腫，伴有滲出液；照射后第42 天，大鼠自身對(duì)照左側(cè)創(chuàng)面有新生上皮長(zhǎng)出，與正常皮膚相似。不同溫度凝膠干預(yù)后，大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚損傷程度均有所減輕，與自身對(duì)照比較，37 ℃凝膠組大鼠促創(chuàng)面愈合效果最顯著。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠創(chuàng)面愈合情況

2.3 37 ℃凝膠減輕大鼠皮膚放射損傷病理改變

HE 染色結(jié)果顯示，照射后大鼠表皮明顯增厚，鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)量增多，少見(jiàn)鱗狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡化；真皮層可見(jiàn)少量纖維細(xì)胞，并伴有淋巴細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤(rùn)，毛囊、皮脂腺等附屬器官減少。與自身對(duì)照比較，凝膠干預(yù)后皮膚組織愈合加快，表皮層較薄，真皮層內(nèi)可見(jiàn)大量的皮膚附屬器如皮脂腺、毛囊、汗腺等，37 ℃凝膠組上皮恢復(fù)最明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠皮膚放射損傷病理改變 （HE染色×200）

2.4 37 ℃凝膠促進(jìn)大鼠皮膚放射損后血管和膠原生成相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，自身對(duì)照、4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠皮膚組織的血管和膠原生成相關(guān)蛋白VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；凝膠干預(yù)后，37 ℃凝膠組大鼠皮膚組織中VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高。見(jiàn)圖3 和表3。

圖3 大鼠皮膚放射損傷后血管和膠原生成相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 大鼠皮膚組織中血管和膠原生成蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 大鼠皮膚組織中血管和膠原生成蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別自身對(duì)照4 ℃凝膠組37 ℃凝膠組F 值P 值VEGF 0.84±0.07 1.26±0.14 1.96±0.06 141.422 0.000 α-SMA 0.58±0.11 0.62±0.08 1.41±0.12 171.322 0.000 Collagen Ⅰ0.50±0.13 0.48±0.15 1.21±0.14 218.566 0.000 Collagen Ⅲ0.47±0.07 0.45±0.08 1.15±0.18 198.233 0.000

2.5 37 ℃凝膠促進(jìn)大鼠皮膚放射損后生長(zhǎng)因子分泌

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，自身對(duì)照、4 ℃凝膠組和37 ℃凝膠組大鼠皮膚組織的PDGFD、TGF-β 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；凝膠干預(yù)后PDGFD、TGF-β 水平升高，37 ℃凝膠組皮膚組織中PDGFD、TGF-β 顯著升高。見(jiàn)表4。

表4 大鼠皮膚組織中生長(zhǎng)因子水平比較 （±s）

表4 大鼠皮膚組織中生長(zhǎng)因子水平比較 （±s）

組別自身對(duì)照4℃凝膠組37℃凝膠組F 值P 值PDGFD/（μg/L）3.5±1.4 13.3±3.5 20.5±1.4 90.241 0.000 TGF-β/（ng/mL）0.53±0.07 1.13±0.46 2.33±0.07 116.332 0.000

3 討論

寒冷環(huán)境的刺激會(huì)對(duì)人體多種組織器官產(chǎn)生影響，包括呼吸系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等。和常溫條件下相比，暴露在寒冷環(huán)境下的皮膚放射損傷危險(xiǎn)性更高，但目前有關(guān)寒區(qū)皮膚放射損傷的特點(diǎn)和救治方法尚不清楚[8-9]。本研究采用SD大鼠復(fù)制寒區(qū)皮膚放射損傷動(dòng)物模型，觀察皮膚損傷特點(diǎn)，通過(guò)病理學(xué)和檢測(cè)大鼠皮膚組織的血管和膠原生成相關(guān)蛋白VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達(dá)，以及大鼠皮膚組織的PDGFD、TGF-β 水平，進(jìn)一步明確了不同溫度凝膠對(duì)寒區(qū)皮膚放射損傷修復(fù)的作用。

甲殼素納米纖維促修復(fù)凝膠在創(chuàng)面愈合時(shí)間，皮膚附屬結(jié)構(gòu)修復(fù)方面展示出了理想的效果。分析原因可能是水凝膠能夠提供濕性愈合環(huán)境，其特殊性對(duì)干燥壞死的傷口具有更大的應(yīng)用前景。此外，水凝膠形態(tài)能夠?qū)诃h(huán)境進(jìn)行物理保護(hù)，防止細(xì)菌的滲透，還能起到舒緩和冷卻的作用，從而減輕疼痛，加快血管和膠原生成，促進(jìn)組織修復(fù)，加快傷口愈合[10-11]。對(duì)單純的寒冷損傷首先考慮復(fù)溫，基于此本研究驗(yàn)證了寒冷環(huán)境下皮膚放射性損傷后不同溫度凝膠復(fù)溫并促修復(fù)作用。37 ℃凝膠效果最顯著。快速融化復(fù)溫是凍傷急救的重要措施，也是凍傷治療的關(guān)鍵，也可以直接影響各種治療的效果，以及組織能否保留或保留多少的問(wèn)題。凍傷凍結(jié)組織應(yīng)立即用溫水浸泡，以使凍區(qū)迅速解凍，縮短凍結(jié)期。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，37 ℃凝膠組大鼠干預(yù)后皮膚損傷愈合相關(guān)蛋白VEGF、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達(dá)和生長(zhǎng)因子PDGFD，TGF-β 水平較自身對(duì)照和4 ℃凝膠組升高；證明在凝膠的作用基礎(chǔ)上37 ℃復(fù)溫可能對(duì)寒區(qū)皮膚放射損傷救治發(fā)揮有益作用[12-14]。

綜上所述，本研究明確低溫環(huán)境下，鍶-90 照射后造成大鼠皮膚損傷；37 ℃凝膠相比于4 ℃凝膠更有益于寒區(qū)皮膚放射損傷愈合。本研究結(jié)果有助于提高寒區(qū)皮膚放射損傷的認(rèn)識(shí)，為寒區(qū)皮膚放射損傷尋找有效的修復(fù)策略提供理論基礎(chǔ)。