社區(qū)獲得性肺炎患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)情況及特點(diǎn)分析

侯萍萍,黃小紅,溫志園

(梅州市人民醫(yī)院兒內(nèi)科,廣東 梅州 514031)

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)是指在醫(yī)院外罹患的肺實(shí)質(zhì)炎癥,是兒科最常見疾病,也是5歲以下兒童最主要死因之一[1-2]。兒童CAP病原體種類繁多,臨床表現(xiàn)隱匿,加上兒童氣道阻力大、咳嗽反射弱,分泌物排出困難使得臨床治療較為困難[3]。早期明確病原學(xué)可及時(shí)給予針對(duì)性靶向抗感染治療,對(duì)提高兒童CAP治療效果非常關(guān)鍵。目前臨床病原體檢測(cè)主要有細(xì)菌培養(yǎng)及血清學(xué)試驗(yàn),但上述方法操作繁瑣,耗時(shí)較長,且檢測(cè)陽性率僅為30%～40%[4-5],敏感度和特異度均不高。因此,臨床亟需一種高效、敏感、準(zhǔn)確、快速的病原學(xué)檢測(cè)方法。近年來,隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展,其在病原學(xué)檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)即是利用分子診斷方法(生物芯片技術(shù))對(duì)呼吸道常見的13種病原微生物進(jìn)行核酸檢測(cè),以協(xié)助臨床精準(zhǔn)診斷、精準(zhǔn)治療的方法。既往報(bào)道顯示[6],呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)在成人CAP肺泡灌洗液檢測(cè)中具有特異度強(qiáng)、敏感度高的特點(diǎn),但在兒童CAP肺泡灌洗液檢測(cè)中的報(bào)道較少。因此,本研究對(duì)CAP患兒進(jìn)行肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè),并進(jìn)一步分析其與細(xì)菌培養(yǎng)的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年1月至2023年2月梅州市人民醫(yī)院收治并行纖維支氣管鏡肺泡灌洗的240例CAP患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合CAP相關(guān)診斷[7];(2)所有病例均行胸部CT檢查;(3)年齡29 d～14歲;(4)經(jīng)纖維支氣管鏡醫(yī)師評(píng)估,計(jì)劃行纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)標(biāo)本不符合要求;(2)新生兒;(3)醫(yī)院獲得性或非感染性肺炎患兒。240例患兒中,男性122例,女性118例,年齡(6.78±2.23)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,所有研究對(duì)象及家屬均知情同意。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 痰細(xì)菌培養(yǎng) 患兒在進(jìn)行抗生素治療前采集痰標(biāo)本。采取前30 min禁食、水,用生理鹽水漱口。常規(guī)消毒后,護(hù)士持連接負(fù)壓裝置的一次性吸痰器經(jīng)患兒口腔進(jìn)行深部吸痰,收集痰液1～2 mL,及時(shí)送至微生物室檢測(cè)。痰培養(yǎng)合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn)為:每低倍鏡視野上皮細(xì)胞<10個(gè),白細(xì)胞>25個(gè)。將合格痰液標(biāo)本接種于培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱孵育(35 ℃,5% CO2),根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落特點(diǎn)、革蘭染色及鏡下形態(tài)等,對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn),具體操作及結(jié)果判讀依據(jù)微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 肺泡灌洗液標(biāo)本獲取 由纖維支氣管鏡醫(yī)師在護(hù)士配合下完成纖維支氣管鏡操作。完善內(nèi)鏡檢查前進(jìn)行局麻或全麻,根據(jù)患兒年齡及體重選擇合適內(nèi)鏡,經(jīng)鼻將支氣管鏡送至病變支氣管內(nèi),經(jīng)支氣管鏡工作孔注入0.9%生理鹽水,注入量1 mL/kg,每次<10 mL,注入3～5次。采用負(fù)壓吸引器吸取支氣管肺泡灌洗液,棄去第1次肺泡灌洗液,將之后吸取的肺泡灌洗液分別用作細(xì)菌培養(yǎng)及呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)。

1.2.3 肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng) 將獲得的肺泡灌洗液標(biāo)本及時(shí)送至微生物室,將標(biāo)本接種于培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱孵育(35 ℃,5%CO2),根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落特點(diǎn)、革蘭染色及鏡下形態(tài)等,對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn),具體操作及結(jié)果判讀依據(jù)微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

1.2.4 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè) 采用核酸提取試劑提取患兒肺泡灌洗液標(biāo)本中DNA和RNA(提取步驟按照試劑盒說明進(jìn)行),將提取到核酸與十三項(xiàng)呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增試劑混合后(按照擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,將擴(kuò)增后樣本進(jìn)行雜交檢測(cè)。使用Luminex Magpix液相芯片檢測(cè)平臺(tái),通過聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行雜交顯色,并完成檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)容包括13種臨床常見呼吸道病原體(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸桿菌、結(jié)核分枝桿菌)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]形式描述,組間比較行獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn)/Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰細(xì)菌培養(yǎng)

240例痰液標(biāo)本中,細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽性44例,陽性率18.34%(44/240)。各病原檢測(cè)率均不高,其中以流感嗜血桿菌(9.17%)及肺炎鏈球菌(5.83%)為主。見表1。

表1 痰細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果[n(%)]

2.2 肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

240例肺泡灌洗液標(biāo)本中,細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽性者19例,陽性率7.93%。各病原菌檢測(cè)陽性率較低,其中感染病原體以肺炎鏈球菌(3.75%)及流感嗜血桿菌(2.08%)為主,且檢測(cè)出1例煙曲霉復(fù)合菌。見表2。

表2 肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果[n(%)]

2.3 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)

240例肺泡灌洗液標(biāo)本中,呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果陽性者140例(58.33%),140例陽性患兒共檢測(cè)出病原體162株。其中,革蘭氏陽性菌84株,其中,肺炎鏈球菌78例、金黃色葡萄球均6例、耐甲氧西林葡萄球菌0例、以肺炎鏈球菌為主,占比為48.15%(78/162);革蘭氏陰性菌34株,其中,肺炎克雷伯菌2例、銅綠假單胞菌4例、鮑曼不動(dòng)桿1例、嗜麥芽窄食單胞菌5例、流感嗜血桿菌19例,嗜肺軍團(tuán)菌0例、大腸埃希氏菌2例,結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌1例,以流感嗜血桿菌為主,占比為11.72%(19/162);支原體衣原體44株,以肺炎支原體為主,占比為26.54%(43/162)。見表3。

表3 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果

2.4 三種檢測(cè)方式陽性率比較

240例患者中,痰細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性44例,陰性196例,陽性率18.34%(44/240);肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性19例,陰性221例,陽性率7.92%(19/240);肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢出陽性140例,陰性100例,陽性率58.33%(140/240)。肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)的陽性率高于痰細(xì)菌培養(yǎng)及肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)。見表4?？紤]到細(xì)菌培養(yǎng)不能檢測(cè)出肺炎支原體和衣原體,去掉肺炎支原體及衣原體的單一陽性病例39例,痰細(xì)菌培養(yǎng)總例數(shù)201例,陽性和陰性例數(shù)分別為44例和157例;肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)總例數(shù)201例,陽性和陰性例數(shù)分別為19例和182例。此時(shí)肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)的陽性率仍高于痰細(xì)菌培養(yǎng)及肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)。見表5。

表4 三種檢測(cè)陽性率比較[n(%)]

表5 去掉肺炎支原體及衣原體單一陽性病例后三種檢測(cè)陽性率比較[n(%)]

2.5 不同年齡組肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)病原體分布情況比較

<2歲、2～5歲,>5歲年齡組患兒的病原體感染率分別為44.00%(22/50)、61.27%(87/142)及64.58%(31/48)。<2歲年齡組感染率最低,低于2～5歲(χ2=4.493,P=0.034)及>5歲組(χ2=4.178,P=0.041),2～5歲組及>5歲組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.168,P=0.682)。

140例陽性患兒共檢測(cè)病原體162株,排名前三的是肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌;其中<2年齡組感染以肺炎鏈球菌為主,占比為53.85%(14/24);2～5歲年齡組感染以肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌為主,占比分別為52.94%(54/102)、21.57%(22/102)、12.75%(13/102);>5歲年齡組以肺炎支原體及肺炎鏈球菌為主,占比分別為50.00%(18/36)、27.78%(10/36)。見表6。

表6 不同年齡段肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)病原體分布情況[n(%)]

3 討論

兒童因自身免疫力低下及呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完善,是呼吸系統(tǒng)疾病高發(fā)人群,CAP是兒童占比最高的疾病,也是全球兒童發(fā)病率和死亡率最高的疾病[8]。引起兒童CAP的病原體十分復(fù)雜,加上不同地區(qū)、不同年齡段及不同季節(jié)病原體構(gòu)成比亦有顯著差異[9]。因此,為實(shí)施精準(zhǔn)靶向治療,提高兒童CAP治愈率,需對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)分析。隨著纖維支氣管鏡的成熟應(yīng)用,肺泡灌洗液作為檢測(cè)標(biāo)本被廣泛應(yīng)用。研究[10]顯示,肺泡灌洗液直接取材于病變部位,可避免上呼吸道正常菌群污染,能更準(zhǔn)確反映肺部病原學(xué)。本研究中,CAP患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)陽性率高于痰培養(yǎng)和肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng),表明肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)可提高CAP患兒病原體檢測(cè)陽性率,對(duì)臨床診療具有較高價(jià)值。

一直以來,痰液作為最常規(guī)且最易獲得的標(biāo)本在臨床上廣泛使用,但痰液標(biāo)本不僅在采集時(shí)易被污染,在培養(yǎng)過程中也易被污染。同時(shí),CAP患兒年齡小,配合度低,不愿配合深部吸痰取得標(biāo)本。而標(biāo)本獲取是檢測(cè)病原體準(zhǔn)確性的關(guān)鍵[11]。相較于痰液,肺泡灌洗液是通過支氣管鏡取得,直接來源于病灶,不易受上氣道正常菌群干擾,樣本質(zhì)量更高[12]。因此,肺泡灌洗液標(biāo)本可準(zhǔn)確反映呼吸系統(tǒng)疾病病原體情況。李小夢(mèng)等[13]研究表明,對(duì)痰培養(yǎng)陰性的原發(fā)性肺隱球菌病患者,肺泡灌洗液培養(yǎng)是其有效診斷手段。本研究顯示,呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)陽性率高于痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng),由此表明,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)可作為CAP患兒病原體診斷的最適方案。本研究中,肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)陽性率低于既往結(jié)果,原因可能與本研究肺泡灌洗液標(biāo)本是在經(jīng)驗(yàn)性治療3～4 d后取得有關(guān),也可能與本研究中肺炎支原體感染占比較高有關(guān),而細(xì)菌培養(yǎng)僅能診斷細(xì)菌感染,對(duì)支原體感染無法診斷。雖然痰培養(yǎng)和肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率不及肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè),但二者能診斷出十三項(xiàng)之外的細(xì)菌,如本研究肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)液診斷出1例煙曲霉復(fù)合菌。一旦診斷出此種不常見呼吸道細(xì)菌,經(jīng)過藥敏試驗(yàn)可指導(dǎo)臨床用藥,提高臨床治愈率[12,14]。

導(dǎo)致CAP的病原體較復(fù)雜,臨床上易存在單一感染與混合感染的情況,但通過傳統(tǒng)痰液及肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)較難發(fā)現(xiàn)混合感染而準(zhǔn)確診斷。本研究中,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)可同時(shí)檢出兩種或多種病原體。其中,陽性率最高的肺炎鏈球菌和肺炎支原體多以單一感染存在,流感嗜血桿菌單一感染與混合感染比例接近;而肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞、銅綠假單胞菌多以混合感染的形式存在。因此,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)是CAP患兒有效診斷手段,尤其是有助于臨床明確混合感染病原體,避免經(jīng)驗(yàn)性用藥,減少不必要的抗生素聯(lián)用。

有研究對(duì)195個(gè)國家下呼吸道感染數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,2016年全球死于肺炎的兒童有100萬左右,其中,<5歲兒童占比為15%左右[15]。因此,本研究將5歲作為一個(gè)臨界點(diǎn)。分析不同年齡組患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)病原體分布情況顯示:<2歲年齡組感染率最低,低于2～5歲及>5歲組。原因可能是小嬰兒感染多以病毒感染為主,而呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)主要包含下呼吸道常見的8種病原菌及5種其他病原體,不包含病毒。本研究還顯示,排名前三的病原體是肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌;其中,肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌占比均以2～5歲年齡組最高。<2年齡組感染以肺炎鏈球菌為主;2～5歲年齡組感染以肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌為主;>5歲年齡組以肺炎支原體及肺炎鏈球菌為主。由此表明,肺炎鏈球菌是導(dǎo)致兒童CAP最主要原因。近年來流行病學(xué)研究[16-17]顯示,肺炎支原體已逐步成為兒童CAP的重要致病菌,其檢出率為20%～40%,本研究檢出43株,檢出率為26.54%(43/162)。本研究中,>5歲是肺炎支原體占比最高人群,亦與上述結(jié)果一致。

綜上,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項(xiàng)檢測(cè)可提高CAP患兒病原體陽性率,是一種確定CAP病原體種類有效方法,值得臨床推廣使用。