1例X連鎖隱性遺傳魚鱗病合并隱睪患兒家系的遺傳學(xué)分析

林芳,景亞玲,張傳英,牟燕,鄧睿,唐麗萍,宋桂芹,趙明才,劉曉芳

(遂寧市中心醫(yī)院,1.產(chǎn)前診斷中心;2.生殖醫(yī)學(xué)中心;3.兒外科,四川 遂寧 629000;4.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)研究所,四川 南充 637000;5.遂寧市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 遂寧 629000)

魚鱗病常見四肢伸側(cè)或軀干部皮膚干燥、粗糙,伴有菱形或多角鱗狀脫屑,多由遺傳因素引起,是一組以皮膚角化障礙為主的疾病[1]。隱睪癥是指胎兒時(shí)期睪丸不能按正常發(fā)育過程沿腹膜鞘突經(jīng)腹股溝管遷移,致使一側(cè)或雙側(cè)睪丸不能下降到同側(cè)陰囊內(nèi),其病因可能與基因、激素合成與分泌、解剖以及環(huán)境因素等有關(guān),是男性生殖系統(tǒng)先天畸形中最常見的一種現(xiàn)象[2]。由不同致病基因引起的魚鱗病、隱睪癥,可伴有不同癥狀,治療方法和預(yù)后也不一樣[3]。本研究擬采用染色體G顯帶核型分析和低深度全基因組拷貝數(shù)變異測序分析(copy number variation sequencing,CNV-seq)技術(shù),對1例魚鱗病合并隱睪的患兒進(jìn)行家系遺傳學(xué)分析,以明確導(dǎo)致患兒發(fā)育異常的可能原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒,男性,3歲,以“發(fā)現(xiàn)雙側(cè)陰囊內(nèi)無睪丸1年余”就診。查體:身高92 cm,體重15 kg,神志清,精神好,心肺腹無異常,無特殊面容。雙側(cè)陰囊發(fā)育偏差,雙側(cè)陰囊空虛,其內(nèi)未觸及睪丸,在雙側(cè)腹股溝區(qū)捫及類似睪丸樣包塊,大小約為1.0 cm×0.6 cm×0.5 cm,表面光滑,活動(dòng)度可,無觸痛,不能下拉至陰囊內(nèi)。右側(cè)陰囊內(nèi)可觸及無痛性包塊,透光實(shí)驗(yàn)(+),陰莖發(fā)育偏小?；純喝砥つw干燥、彈性減退、粗糙,皮膚似魚鱗樣改變,但未治療,期間常因感冒發(fā)燒、肺炎進(jìn)行治療?；純鹤阍缕蕦m產(chǎn),第2胎2產(chǎn),父母非近親結(jié)婚,生后奶粉喂養(yǎng),2月抬頭,4月翻身,6月坐,9月站,1歲1月走,易感冒。性激素6項(xiàng):促黃體激素0.06 mIU/mL(↓),雌二醇<10.0 pg/mL(↓),泌乳刺激素28.9 ng/mL(↑),睪酮0.15 nmol/L,孕酮<0.1 ng/mL,促卵泡激素0.1 mIU/mL(↓)?；純築超提示雙側(cè)睪丸位置偏高,右側(cè)鞘膜積液。家中哥哥、舅舅及表舅也有類似皮膚和隱睪等癥狀,據(jù)此繪制系譜圖。見圖1。

1.2 染色體G顯帶核型分析

對患兒及其家庭成員的外周血進(jìn)行培養(yǎng),收獲和胰酶G顯帶,核型圖像經(jīng)蔡司全自動(dòng)染色體掃描分析系統(tǒng)掃描和采集,每張玻片采集50個(gè)核型。每個(gè)標(biāo)本至少分析8個(gè)核型和計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相。染色體的分析和命名參考《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2020)》[4]。

1.3 CNV-seq檢測分析

采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的試劑盒提取患兒及其家庭成員的外周血全基因組DNA。使用Qubit3.0熒光定量儀(thermo fisher scientific)和Exkubit dsDNA HS分析試劑盒對提取的DNA濃度進(jìn)行定量。應(yīng)用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“科諾安”(CNV-Seq)試劑盒,進(jìn)行測序文庫構(gòu)建。使用Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(thermo fisher scientific)和KAPA Library Kit (Illumina) Universal qPCR Mix (Roche)試劑盒進(jìn)行文庫定量。定量后通過NextSeq CN 500高通量測序儀完成測序(0.1 X),測序所得的Reads通過BWA軟件與人類參考hg19基因組進(jìn)行對比分析,其檢測CNV的分辨率約為>100 kb的拷貝數(shù)變異。參考ACMG評級指南[5],將測序所得CNVs數(shù)據(jù)與DGV、OMIM、DECIPHER、ClinGen、UCSC、gnomAD數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行比對,分析檢測結(jié)果中CNVs的臨床意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析

患兒及其父母和哥哥外周血細(xì)胞G顯帶核型分析均未見X染色體短臂明顯異常。見圖2。

2.2 染色體拷貝數(shù)變異檢測

患兒及其哥哥的CNV-seq檢測結(jié)果為Xp22.33p22.31(4140000-9440000)*0,缺失片段為5.3 Mb,共缺失11個(gè)OMIM基因(ANOS1、FAM9A、FAM9B、NLGN4X、PNPL4A、PUDP、STS、VCX、VCX2、VCX3A和VCX3B)。經(jīng)查詢ClinGen數(shù)據(jù)庫資源,該片段包含Xp22.31 recurrent region (includes STS)(ISCA ID:ISCA-37417)全部。有充分證據(jù)(haploinsufficiency score:3)表明該區(qū)域單倍劑量不足的患者臨床表現(xiàn)出Ichthyosis、X-linked(XLI)(OMIM:308100)的臨床表型。XLI是一種表皮脂類代謝異常疾病,X連鎖隱性遺傳,又稱為X染色體連鎖魚鱗癬,幾乎全部見于男性患者,出生時(shí)或出生不久后發(fā)病,主要臨床表征為四肢、面部、頸部、軀干、臀部常見大面積的鱗屑,以頸部、面部、軀干受累最嚴(yán)重,皮損持續(xù)存在且不隨年齡而改善,部分患者并發(fā)角膜混濁、支氣管哮喘、過敏性鼻炎等,部分女性攜帶者有輕度鱗屑出現(xiàn)在臂及脛前,CNV評級為致病性?；純耗赣HCNV結(jié)果為Xp22.33p22.31(4140000-9440000)*1,提示其染色體Xp22.33p22.31區(qū)存在5.3 Mb的雜合缺失?；純焊赣HCNV未見異常。見圖3。

3 討論

本研究中患者因隱睪就診于本院小兒外科,通過查體同時(shí)發(fā)現(xiàn)該患兒皮膚干燥,伴有魚鱗狀改變,遂充分利用多學(xué)科診療模式(multi-disciplinary treatment,MDT)優(yōu)勢,積極為患兒尋找“隱睪”的遺傳學(xué)病因。家系調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),該家系中,患兒哥哥、舅舅和表舅均有相似隱睪及皮膚表現(xiàn),但未到皮膚科進(jìn)行規(guī)范診斷及治療,因此高度懷疑X-連鎖魚鱗病(X-linked ichthyosis,XLI)可能。研究[6]提示,CNV-Seq技術(shù)能夠可靠地檢出XLI缺失型變異,是XLI的診斷的新途徑。因此遺傳咨詢醫(yī)師建議對患兒一家同時(shí)行外周血G顯帶核型分析和家系CNV-seq檢測。但由于某些原因未能采集到患兒舅舅和表舅血樣進(jìn)行檢測。遺傳學(xué)檢測結(jié)果顯示,該家系成員染色體核型分析未見明顯異常,家系CNV-seq提示患兒及其哥哥X染色體p22.33-p22.31處缺失5.3 Mb區(qū)域,共缺失11個(gè)OMIM基因(ANOS1、FAM9A、FAM9B、NLGN4X、PNPL4A、PUDP、STS、VCX、VCX2、VCX3A和VCX3B)。經(jīng)查詢ClinGen數(shù)據(jù)庫資源,該片段包含Xp22.31 recurrent region (includes STS)(ISCA ID:ISCA-37417)全部,有充分證據(jù)(haploinsufficiency score:3)表明該區(qū)域單倍劑量不足的患者臨床表現(xiàn)出Ichthyosis,X-linked(XLI)(OMIM:308100)的臨床表型,患兒母親CNV結(jié)果為Xp22.33p22.31區(qū)域同樣存在5.3 Mb的拷貝數(shù)缺失,提示患兒及哥哥該片段的缺失來源于攜帶者母親。

魚鱗病是一種皮膚干燥伴魚鱗狀鱗屑,主要累及四肢伸側(cè)或軀干部為特征的遺傳性角化障礙性皮膚病。分為常染色體顯性遺傳性魚鱗病(包括尋常性魚鱗病、表皮松解性角化過度魚鱗病)、X-連鎖魚鱗病(X-linked ichthyosis,XLI)及常染色體隱性遺傳魚鱗病(包括板層狀魚鱗病和非大皰性先天性魚鱗病樣紅皮病[7])。XLI是其中重要的一型,主要累及男性患者,女性僅為攜帶者,男性XLI發(fā)病率為1/1 300 ～ 1/1 500[8]。男性病人一般在出生或出生后不久發(fā)病,以四肢伸側(cè)及軀干側(cè)、頸、面、耳等部位受累,出現(xiàn)全身皮膚干燥、粗糙、黑褐色的鱗屑。1978年Shapiro等[9]首先發(fā)現(xiàn)X連鎖隱性遺傳魚鱗病患者成纖維細(xì)胞類固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS),證實(shí)STS基因是其致病基因。STS基因位于全長164 kb的Xp22.31區(qū)域,包含10個(gè)外顯子和2個(gè)非編碼區(qū),其側(cè)翼序列多為低拷貝重復(fù)結(jié)構(gòu),容易造成同源重組時(shí)的缺失[10]。在正常角質(zhì)層中,STS是一種微粒體酶,能將膽固醇硫酸鹽分解為膽固醇和硫酸鹽,這一過程對表皮細(xì)胞的粘合及正常脫落起重要作用,XLI患者缺乏STS基因,角質(zhì)層中膽固醇硫酸鹽積聚,過多的膽固醇硫酸鹽堆積使表皮細(xì)胞間的黏附性增加,穩(wěn)定性增強(qiáng),導(dǎo)致皮膚角化過度,形成鱗屑[11]。XLI病例中約90%為包括STS基因在內(nèi)的Xp22.31片段缺失型,少數(shù)為小片段缺失和點(diǎn)突變[12]。

隱睪癥是另一種皮膚外癥狀,發(fā)生在大約20%的XLI患者中。XLI患者患與睪丸疾病無關(guān)的睪丸生殖細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)也增加。目前尚不清楚XLI患者隱睪癥風(fēng)險(xiǎn)增加是由于STS缺陷還是與睪丸下降有關(guān)的X染色體附近基因的同時(shí)突變所致,患者的睪丸激素水平、性發(fā)育和生育力一般正常[13]。

本家系中除STS基因缺失外,還有10個(gè)OMIM基因的缺失。研究[14-16]表明,約8%的STS基因缺失患者伴隨相鄰基因缺失,由此可導(dǎo)致更加復(fù)雜的表型,如發(fā)育異常、智力障礙、角膜混濁、支氣管哮喘、過敏性鼻炎和室間隔缺損等。本研究的患者及其哥哥和舅舅,僅表現(xiàn)魚鱗病和隱睪,未發(fā)現(xiàn)其他臨床癥狀。

綜上,按分子檢測結(jié)果和相關(guān)專家共識(shí)[17]對患者行雙側(cè)睪丸下降固定術(shù)及右側(cè)鞘狀突高位結(jié)扎術(shù);取鞘狀突組織送病檢,結(jié)果提示“右側(cè)鞘狀突”纖維組織增生。術(shù)后彩超復(fù)查提示,睪丸位于陰囊內(nèi),雙側(cè)腹股溝管稍增寬,患兒術(shù)后恢復(fù)好。皮膚行保濕治療。根據(jù)遺傳學(xué)檢測結(jié)果,遺傳咨詢醫(yī)師告知患兒雙親,在女性攜帶者與正常人婚配的后代中,由于X連鎖隱性遺傳的特性,男性后代50%的概率為魚鱗病患者,建議該家系的女性攜帶者在將來生育時(shí),應(yīng)按規(guī)范進(jìn)行產(chǎn)前診斷。