色譜指紋圖譜相似指數(shù)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化消化復(fù)寧湯提取工藝參數(shù)*

陳莉,王盛,張迪,程蕤,汪永忠

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室,合肥 230031;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 230031)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃黏膜局部性或廣泛性的固有腺體萎縮,數(shù)量減少,黏膜層變薄,黏膜肌層變厚,或伴幽門腺化生和腸腺化生,或有不典型增生為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病[1]。世界衛(wèi)生組織已將CAG列為胃癌前狀態(tài),對患者健康生活造成嚴(yán)重影響[2]。因此有效治療和控制CAG的病程是早期胃癌預(yù)防的重點(diǎn)階段[2]。目前CAG西醫(yī)治療缺乏特效藥物[3]。中醫(yī)藥防治CAG具有全方位、多靶點(diǎn)、整體調(diào)控的優(yōu)勢,其對幽門螺桿菌(H.pylori,Hp)轉(zhuǎn)陰、胃鏡黏膜損傷修復(fù)有一定的治療效果[4]。

消化復(fù)寧湯(XHFNT)是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國醫(yī)大師、新安醫(yī)學(xué)徐氏醫(yī)家第三代傳人徐經(jīng)世先生臨癥50余載,依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)造性地提出了“肝膽郁熱,脾胃虛寒”的學(xué)術(shù)思想,將先哲四逆散合黃連溫膽湯加味所制[5]。大量臨床研究和現(xiàn)代藥理學(xué)研究均證實(shí)XHFHT對于“肝郁脾虛”型CAG的治療作用[6-9]。然該驗(yàn)方仍以湯劑形式在臨床使用,嚴(yán)重阻礙其深入研究與開發(fā),同時也給患者帶來很大的用藥困擾。因此迫切需要開展該驗(yàn)方的制劑研發(fā)工作。為保障傳統(tǒng)湯劑與現(xiàn)代化制劑關(guān)鍵質(zhì)量的一致性;本研究作者選擇多組分表征的HPLC指紋圖譜技術(shù)結(jié)合響應(yīng)面法(以指紋圖譜相似指數(shù)C、A,指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移總量和浸膏得率為實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)),采用綜合評分法,優(yōu)化XHFNT提取工藝;以期從藥效物質(zhì)轉(zhuǎn)移角度,保障制劑臨床療效的一致性,為XHFNT制劑深入研發(fā)及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 TA5003N電子天平(上海菁海儀器有限公司);BP211D十萬分之一分析天平(賽多利斯股份有限公司);Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);101A-S1鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司);R-1010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);XZ21K離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);KDC-16H離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥 姜半夏(安徽滬譙醫(yī)藥有限公司,批號:2010290392)、谷芽(安徽滬譙醫(yī)藥有限公司,批號:2111070032)、姜竹茹(安徽普仁中藥飲片有限公司,批號:2112041)、枳殼(安徽普仁中藥飲片有限公司,批號:2112241)、醋柴胡(安徽滬譙醫(yī)藥有限公司,批號:2112300212)和梅花(安徽滬譙醫(yī)藥有限公司,批號:2108290102)飲片為中藥房提供,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華主任中藥師鑒定,均符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部標(biāo)準(zhǔn);尿苷(批號:10887-202104)、腺苷(批號:10879-201703)、新橙皮苷(批號:111857-201804)、柚皮苷(批號:10722-202116)、新綠原酸(批號:0420010)、綠原酸(批號:10753-201716)、柴胡皂苷D(批號:110778-201912)、槲皮素(批號:00081-201610)、橙皮苷(批:110721-202019)、蘆丁(批號:0080-202012)、金絲桃苷(批號:111521-201809)對照品,均從中國食品藥品檢定研究院購買;色譜純甲醇、色譜純乙腈、其余試劑均為分析純,屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1多指標(biāo)成分測定的指紋圖譜研究

2.1.1供試品溶液的制備 取“2.3.1節(jié)”樣品10 mL,于3 600 r·min-1離心15 min得上清液,吸取上清液2 mL,12 500 r·min-1離心15 min,即得供試品溶液。

2.1.2對照品溶液的制備 取尿苷、腺苷、新橙皮苷、柚皮苷、新綠原酸、綠原酸、槲皮素、橙皮苷、蘆丁、金絲桃苷對照品適量,精密稱定;加甲醇溶解,定容制得對照品溶液,濃度分別為0.740、0.720、3.675、6.890、4.100、3.420、0.344、0.160、0.530、0.121 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脫0～10 min,99.5%→99%B;10～15 min,99%→98.5%B;15～30 min,98.5%→94.5%B;30～35 min,94.5%→90%B;35～45 min,90%→85%B;45～55 min,85%→80%B;55～65 min,80%→74%B;65～75 min,74%→67%B;75～85 min,67%→63%B;85～95 min,63%→60%B;95～105 min,60%→47%B;柱溫30 ℃;流速:1 mL·min-1;梯度波長0～40 min,203 nm;40～50 min,260 nm;50～60 min,280 nm;60～105 min,203 nm;進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下,供試品色譜峰較多,且分離度較好

2.1.4線性關(guān)系考察 分別吸取0.5、2、4、8、10、20 μL,根據(jù)上述色譜條件進(jìn)樣,以各對照品的濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。

表1 10種對照品的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.1 Linear regression equation,correlation coefficient,and linear range of 10 reference substance

2.1.5方法學(xué)考察 精密吸取同一供試品溶液10 μL,按“2.1.3節(jié)”色譜條件,進(jìn)樣6次,記錄峰面積,以32號柚皮苷色譜峰為參照峰(S),計(jì)算得到各共有峰相對保留時間RSD值0.00%～1.70%和相對峰面積的RSD值0.00%～3.82%;計(jì)算尿苷、腺苷、新綠原酸、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰面積RSD值分別為:2.00%、2.12%、1.67%、0.23%、0.34%、1.30%、0.49%、1.39%、0.49%和1.23%(n=6)。精密吸取同一供試品溶液10 μL,于0、2、4、6、8、10 h按“2.1.3節(jié)”法測定,記錄峰面積,同法計(jì)算得到各共有峰相對保留時間RSD值0.00%～1.70%和相對峰面積的RSD值0.00%～3.82%;計(jì)算尿苷、腺苷、新綠原酸、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰面積RSD值分別為:2.00%、2.12%、1.67%、0.23%、0.34%、1.30%、0.49%、1.39%、0.49%和1.23%(n=6)。取同一批樣品 6 份,按“2.1.1節(jié)”制備供試品溶液,測定記錄峰面積,同法計(jì)算得到各共有峰相對保留時間RSD值0.00%～3.10%和相對峰面積的RSD值0.00%～4.80%。計(jì)算尿苷、腺苷、新綠原酸、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰平均含量分別為:0.114 1 mg·mL-1(RSD=2.70%)、0.085 2 mg·mL-1(RSD=1.47%)、1.849 9 mg·mL-1(RSD=0.91%)、3.017 3 mg·mL-1(RSD=0.14%)、0.268 5 mg·mL-1(RSD=0.33%)、0.087 0 mg·mL-1(RSD=1.30%)、7.738 7 mg·mL-1(RSD=1.30%)、0.117 0 mg·mL-1(RSD=1.61%)、3.107 6 mg·mL-1(RSD=0.64%)、0.216 8 mg·mL-1(RSD=1.03%)(n=6)。

取已知含量的樣品5 mL,加入混合對照品適量,加水定容至10 mL,按“2.1.1節(jié)”法制備供試品溶液(平行6份),測定,記錄峰面積,計(jì)算尿苷、腺苷、新綠原酸、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素回收率分別為:97.78%～101.96%(RSD=1.60%)、95.60%～101.38%(RSD=2.44%)、97.57%～102.47%(RSD=1.82%)、96.10%～101.04%(RSD=1.95%)、95.21%～101.18%(RSD=2.11%)、96.98%～100.79%(RSD=1.46%)、98.28%～102.42%(RSD=1.51%)、95.67%～101.00%(RSD=2.16%)、97.49%～100.99%(RSD=1.53%)和95.44%～100.28%(RSD=2.06%)(n=6)。以上精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)規(guī)定,說明儀器精密度好,供試品溶液穩(wěn)定,該方法重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好。

2014年，四川省水利廳將按照水利部和省委、省政府的要求，扎扎實(shí)實(shí)抓好水利各項(xiàng)工作，確保目標(biāo)任務(wù)圓滿完成。

2.1.6指紋圖譜測定 取“2.3.1節(jié)”樣品,分別按“2.1.1節(jié)”制備供試品溶液,按照“2.1.3節(jié)”色譜條件進(jìn)樣測定,并將所得到的圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”,通過多點(diǎn)校正,確定了共有峰37個,對各樣品中色譜峰進(jìn)行匹配,共匹配的10個特征峰,結(jié)果見圖1。

A.空白;B.混合對照品;C.供試品;3.尿苷;4.腺苷;15.新綠原酸;18.綠原酸;27.蘆丁;28.金絲桃苷;32.柚皮苷;33.橙皮苷;34.新橙皮苷;36.槲皮素。圖1 空白、混合對照品、供試品的HPLC指紋圖譜 A.blank;B.mixed reference substance;C.samples;3.uridine;4.adenosine;15.neochlorogenic acid;18.chlorogenic acid;27.rutin;28.hyperoside;32.naringin;33.hesperidin;34.neohesperidin;36.quercetin.Fig.1 HPLC fingerprint of blank,mixed reference substances and sample

2.1.7指紋圖譜相似度指數(shù)計(jì)算 根據(jù)指紋圖譜檢測結(jié)果,以各樣品37個特征峰的最大值組成的集合作為參比指紋圖譜,計(jì)算各樣品的相似度指數(shù)(C)和相似度指數(shù)(A)。

2.1.8含量測定 根據(jù)指紋圖譜檢測結(jié)果,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)成分的含量,并計(jì)算樣品中有效成分的總含量。

2.2干浸膏得率測定

2.2.1干浸膏制備 取樣品,精密吸取提取液25 mL至干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,蒸干,于105 ℃干燥至恒重。

2.2.2干浸膏得率計(jì)算 干浸膏得率=(干浸膏×10)/藥材總量×100%。

2.3提取工藝實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

2.3.2RSCCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過中心組合響應(yīng)面法對加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)三個因素各選三個水平進(jìn)行試驗(yàn),見表2。根據(jù)Box- Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[10,11]原理確定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果,見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.2 Factors and levels table of response surface experiment

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及綜合得分結(jié)果Tab.3 Response surface experimental design scheme and response value results n=3

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for regression model

XHFNT制備工藝中加水量、提取時間和提取次數(shù)交互作用對XHFNT綜合評分的響應(yīng)面曲線及等高線見圖2。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

得出XHFNT的最佳供試品溶液制備方法為:加水量8.952倍,提取時間1.495 h,提取次數(shù)2.999次,XHFNT色譜指紋圖譜綜合得分預(yù)測值為100.09分。結(jié)合實(shí)際操作方法和方差分析結(jié)果,確定最佳供試品溶液制備方法為:加水量9倍,提取時間1.5 h,提取次數(shù)3次,根據(jù)回歸方程得出理論上XHFNT口服液色譜指紋圖譜綜合得分為100.333分。

2.4工藝優(yōu)化條件驗(yàn)證 在上述優(yōu)化后的工藝條件下,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),3次測定結(jié)果的綜合評分分別為:93.67、98.69、97.90,均值為96.75,RSD為2.79%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值相近(P=0.148);說明響應(yīng)面分析法提供的模型比較平穩(wěn),較真實(shí)地?cái)M合了實(shí)際情況。

3 討論

3.1指紋圖譜表征范圍的確定 筆者所在課題組前期對XHFNT處方藥味進(jìn)行了文獻(xiàn)研究,結(jié)果顯示:方中谷芽酵母菌具有調(diào)節(jié)胃腸道功能,輔助消化的作用;淀粉酶和維生素B增加胃酸和胃蛋白酶分泌,有助于消化[12]。梅花中含有綠原酸、槲皮素、蘆丁、金絲桃苷等[13],其中綠原酸可以通過抗氧化性,抑制中性粒細(xì)胞浸潤及炎性介質(zhì)的釋放,對鹽酸或者非甾體抗炎藥誘導(dǎo)的消化性潰瘍產(chǎn)生保護(hù)作用[14];槲皮素可使胃癌細(xì)胞S期及G2/M期細(xì)胞所占比例減少,阻斷了G0/G1期細(xì)胞向S期及G2/M期移行過渡,出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞堆積增多的現(xiàn)象,從而抑制胃癌細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增殖指數(shù)隨槲皮素濃度增加而下降,槲皮素具有下調(diào)癌細(xì)胞熱休克蛋白(heatshockprotein70,HSP70)和表面生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表達(dá)、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用[15];蘆丁可以調(diào)節(jié)胃黏膜組織中一氧化氮合成酶cNOS/iNOS的活性,調(diào)節(jié)一氧化氮NO的生成,從而減輕淋巴細(xì)胞組織浸潤和促進(jìn)胃壁黏液分泌,對大鼠胃出血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion,GI/R)損傷胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)作用[16];梅花中金絲桃苷(Hyperin,Hyp)對乙醇性胃黏膜損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制與Hyp抗氧化作用和促進(jìn)NO水平恢復(fù)正常有關(guān)[17]。枳殼中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷不僅能雙向調(diào)節(jié)胃腸平滑肌,增加胃腸平滑肌收縮節(jié)律性,還對Hp具有良好殺滅作用,且其殺菌作用可隨濃度增加而明顯增強(qiáng)[18];辛弗林可以通過平滑肌細(xì)胞膜上的乙酰膽堿受體、腎上腺素受體、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受體調(diào)節(jié)、以及對平滑肌細(xì)胞的直接作用,來調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動[19]。姜半夏中鳥苷和腺苷參與DNA代謝過程,具有抗腫瘤活性;姜半夏精氨酸、蘋果酸和γ-氨基丁酸有顯著的抑制胃液分泌作用,可降低胃液酸度、增加腸道蠕動且降低奧狄括約肌張力,從而促進(jìn)膽汁分泌[20];β-谷甾醇可使胃組織內(nèi)皮素-1(endothelin 1,ET-1)mRNA表達(dá)水平顯著降低,降低ET-1水平起到促進(jìn)胃潰瘍愈合的作用[21]。竹茹多糖能夠顯著調(diào)節(jié)人體腸道菌群,并促進(jìn)其代謝產(chǎn)生有益于機(jī)體健康的短鏈脂肪酸[22]。柴胡所含有效成分柴胡多糖不僅能增強(qiáng)B細(xì)胞和T細(xì)胞活性,促進(jìn)白細(xì)胞介素-2合成分泌,起到免疫調(diào)節(jié)作用,還能影響腫瘤細(xì)胞S期DNA合成和蛋白質(zhì)代謝,有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[22];研究發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷a具有抗腫瘤作用[23],柴胡皂苷d促進(jìn)十二指腸平滑肌的收縮活動,增強(qiáng)其平均收縮力,其作用機(jī)制可能是通過增強(qiáng)L型鈣離子通道的活性促進(jìn)外鈣內(nèi)流而實(shí)現(xiàn)[24]。以上表明酵母菌、淀粉酶、維生素B、辛弗林、竹茹多糖、柴胡多糖、鳥苷、腺苷、β-谷甾醇、精氨酸和γ-氨基丁酸,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、綠原酸、新綠原酸均可能為XHFNT的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),因此筆者在本實(shí)驗(yàn)選擇HPLC指紋圖譜技術(shù)對該區(qū)域成分進(jìn)行表征,最終得到共有指紋峰37個,用對照品標(biāo)定出腺苷、新綠原酸、綠原酸等10個成分。

3.2指紋圖譜檢測波長的確定 實(shí)驗(yàn)中比較了203、230、280、300、250、210、330和370 nm波長處的指紋圖譜,結(jié)果在203 nm處出峰的數(shù)量較多,且色譜分離度較好;但是部分成分(金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷)吸收度較低,為準(zhǔn)確反映各成分含量,通過波長切換法,對此波段化學(xué)成分吸收波長進(jìn)行調(diào)整,故更改為0～40 min為203 nm、40～50 min為260 nm、50～60 min為280 nm、60～105 min為203 nm。

3.3提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)指標(biāo)選擇 指紋圖譜相似度指數(shù)C(余弦相似度)值接近1時,表示與參比色譜相比,從整體上是相似的;指紋圖譜相似度指數(shù)A值表示在不考慮每一個色譜峰的峰面積在總體色譜峰的占比情況下,與參比色譜相比各共有色譜峰峰面積差異的平均值,因此當(dāng)A值接近1時,表明與參比色譜在各色譜峰峰面積上接近;因此將相似度指數(shù)C值、A值結(jié)合,可以從整體和細(xì)節(jié)上把控樣品色譜與參比色譜的相似性[25]。本研究在提取工藝優(yōu)化中,以RSCCD實(shí)驗(yàn)樣品色譜指紋圖譜中,各共有色譜峰峰面積最大值,作為參比色譜的峰面積,計(jì)算各樣品色譜的相似度指數(shù)C值、A值,若C值與A值均接近1,表明樣品色譜與參比色譜(由各共有峰封面積最大組成)整體上相似,且樣品色譜各共有峰峰面積均接近最大值。因此本研究采用相似度指數(shù)C值、A,同時結(jié)合多指標(biāo)成分的總含量,以及浸膏得率為指標(biāo),采用綜合評分法,優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù),可以從整體和細(xì)節(jié)上兩個角度把控活性成分轉(zhuǎn)移情況,保障活性成分的高轉(zhuǎn)移率。

綜上,本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜相似度指數(shù)技術(shù)結(jié)合響應(yīng)法,優(yōu)選XHFNT的最佳提取工藝參數(shù),為該制劑的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。