科學(xué)家成功構(gòu)建胚胎干細(xì)胞嵌合體猴

[本刊訊] 由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心劉真研究組、腦智卓越中心非人靈長類研究平臺孫強研究團(tuán)隊和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院M. A. Esteban研究組合作，首次成功構(gòu)建高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實猴胚胎干細(xì)胞可高效地貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。這對理解靈長類胚胎干細(xì)胞的全能性具重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。成果以“高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴”為題，于2023年11月9日以封面文章形式發(fā)表在《細(xì)胞》（Cell）上。

胚胎干細(xì)胞是指由著床前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在體外分離培養(yǎng)而來的多能性細(xì)胞，在模式動物構(gòu)建、細(xì)胞治療、器官再生、類器官模型等領(lǐng)域有重要作用。它有體外無限自我復(fù)制更新、誘導(dǎo)實現(xiàn)多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關(guān)鍵特征，其中胚胎注射形成嵌合體是評估胚胎干細(xì)胞多向分化潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。之前已實現(xiàn)小鼠、大鼠胚胎干細(xì)胞胚胎注射形成嵌合體，但非人靈長類胚胎干細(xì)胞嵌合體研究一直進(jìn)展緩慢。

為獲得具有高效發(fā)育潛能的胚胎干細(xì)胞。研究者建立了6種不同培養(yǎng)體系下的食蟹猴胚胎干細(xì)胞，從克隆形態(tài)、免疫熒光、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、線粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等方面，對它們進(jìn)行全面系統(tǒng)的評估。發(fā)現(xiàn)5iLAF、4CL和PXGL體系下的食蟹猴胚胎干細(xì)胞具有較高多能性，且4CL體系下的干細(xì)胞具有更好的傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性。

胚胎干細(xì)胞注射入受體胚胎后的快速凋亡是影響胚胎干細(xì)胞成功嵌合的關(guān)鍵。研究者選用綠色熒光蛋白標(biāo)記的4CL條件下的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行猴胚胎注射，通過測試干細(xì)胞注射入胚胎后的不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間的組合，得到既不影響胚胎正常發(fā)育，又能保證干細(xì)胞存活的最優(yōu)嵌合胚胎培養(yǎng)條件。5iLAF、Primed體系下的胚胎干細(xì)胞在該優(yōu)化條件下也表現(xiàn)出胚胎注射后的高存活率。將注射了4CL和5iLAF干細(xì)胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養(yǎng)到第17天，發(fā)現(xiàn)注射的胚胎干細(xì)胞仍可高效存活，單細(xì)胞測序表明猴胚胎干細(xì)胞可與受體胚胎細(xì)胞同步發(fā)育，且貢獻(xiàn)到第17天猴胚胎的不同細(xì)胞譜系中。

在系統(tǒng)性評估不同培養(yǎng)條件下，猴胚胎干細(xì)胞狀態(tài)和改進(jìn)優(yōu)化了嵌合胚胎培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，研究者將注射了綠色熒光標(biāo)記的4CL干細(xì)胞的胚胎移植到代孕母猴內(nèi)。在一只出生存活猴和一只流產(chǎn)猴中檢測到胚胎干細(xì)胞的嵌合。通過一系列嵌合體分析流程，發(fā)現(xiàn)出生存活猴中胚胎干細(xì)胞的貢獻(xiàn)比例高達(dá)70%，流產(chǎn)猴中胚胎干細(xì)胞的貢獻(xiàn)比例約20%。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序也表明注射的胚胎干細(xì)胞可以與受體胚胎細(xì)胞同步分化到出生個體猴的各種不同細(xì)胞譜系中。

胎盤組織和生殖細(xì)胞是胚胎發(fā)育和重編程過程中兩類特殊組織和細(xì)胞。胎盤組織由滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來，而生殖細(xì)胞在發(fā)育過程中要經(jīng)歷更加劇烈的表觀重編程。研究者在兩只嵌合體猴的胎盤組織中均發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)。考慮到小鼠胚胎干細(xì)胞幾乎不會貢獻(xiàn)到胎盤組織，該結(jié)果說明靈長類胚胎干細(xì)胞可能具有不同于嚙齒類的獨特的發(fā)育全能性特征。此外，兩只嵌合體猴的生殖細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)，這對后續(xù)基于該技術(shù)的遺傳修飾模型構(gòu)建至關(guān)重要。

該工作建立了系統(tǒng)評估不同培養(yǎng)條件下，猴胚胎干細(xì)胞多能性狀態(tài)的研究體系，并探索得到有利于胚胎干細(xì)胞存活的胚胎嵌合體的培養(yǎng)條件，顯著提升了胚胎干細(xì)胞注入胚胎后的存活效率，最終得到出生存活的高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的嵌合體猴，證實注入的猴胚胎干細(xì)胞可高效貢獻(xiàn)到包括胎盤和生殖細(xì)胞在內(nèi)的各種不同組織和細(xì)胞。這對于理解靈長類胚胎干細(xì)胞全能性和發(fā)育潛能具有重要意義，為建立基于猴胚胎干細(xì)胞嵌合體的基因打靶和模型構(gòu)建技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

該研究嚴(yán)格遵守生物倫理規(guī)范，所有實驗均符合國際干細(xì)胞研究學(xué)會的研究指南，并經(jīng)腦智卓越中心倫理委員會審核。

（曉 工）