七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量及酶活性變化研究

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202310013

康亮， 盧覃培， 王德寶， 等， 2024.

七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量及酶活性變化研究 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（6）： 1118-1128.

KANG L， LU QP， WANG DB， et al.， 2024.

Changes of endogenous hormone content and enzyme activities during seed germination of Paris polyphylla" ［J］.

Guihaia， 44（6）： 1118-1128.

摘" 要：" 為探究七葉一枝花的種子萌發(fā)生理機(jī)制，該文從種胚形態(tài)上對(duì)七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程的時(shí)期進(jìn)行了劃分，并分析了不同時(shí)期種子內(nèi)源激素含量及相關(guān)酶活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明：（1）根據(jù)種胚形態(tài)可將種子萌發(fā)過(guò)程細(xì)分為8個(gè)時(shí)期，即種胚未萌動(dòng)時(shí)期（S1期）、心形胚時(shí)期（S2期）、種胚膨大時(shí)期（S3期）、胚根未突破種皮時(shí)期（S4期）、子葉柄伸長(zhǎng)和胚根突破種皮時(shí)期（S5期）、下胚軸突破種皮時(shí)期（S6期）、上胚軸伸長(zhǎng)時(shí)期（S7期）、胚根伸長(zhǎng)時(shí)期（S8期）。（2）不同萌發(fā)時(shí)期種子的α-淀粉酶活性均明顯高于β-淀粉酶。（3）超氧化物歧化酶（SOD）活性在S5期最高，S1期最低；過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性隨種子萌發(fā)進(jìn)程總體呈上升趨勢(shì)，可溶性蛋白含量隨種子萌發(fā)進(jìn)程先下降后升高。（4）吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）含量隨種子萌發(fā)進(jìn)程整體呈下降趨勢(shì)；1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）、茉莉酸（JA）、油菜素內(nèi)酯（BRs）隨種子萌發(fā)進(jìn)程整體呈上升趨勢(shì)；細(xì)胞分裂素類（CTKs）含量無(wú)顯著變化；IAA/ABA和GA3/ABA隨種子萌發(fā)進(jìn)程呈先下降后上升趨勢(shì)，而CTKs/ABA則不斷升高。（5）ABA、IAA、GA3含量與胚率呈負(fù)相關(guān)，而ACC、JA、BRs、POD、CAT、β-淀粉酶活性與胚率呈正相關(guān)。綜上認(rèn)為，七葉一枝花在不同時(shí)期種子內(nèi)源激素含量及相關(guān)酶活性各不相同，其中α-淀粉酶活性、POD活性可能與種胚胚根伸長(zhǎng)有關(guān)，GA3可能影響種胚形成，而ABA則可能抑制種胚的生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 七葉一枝花， 萌發(fā)階段， 內(nèi)源激素， 抗氧化酶， 淀粉酶

中圖分類號(hào)：" Q945.34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）06-1118-11

收稿日期： 2024-04-02" 接受日期： 2024-05-21

基金項(xiàng)目：" 廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB20238004）； 中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金專項(xiàng)（防科ZY20221502）； 廣西壯族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110598260）； 國(guó)家青年岐黃學(xué)者培養(yǎng)項(xiàng)目； 廣西醫(yī)科大學(xué)高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及杏湖學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目。

第一作者： 康亮（1986—），博士，講師，研究方向?yàn)樗幱弥参镌耘鄬W(xué)，（E-mail）55752628@qq.com。

*通信作者：" 郭宏偉，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幬镔|(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究，（E-mail）hongweiguo@gxmu.edu.cn。

Changes of endogenous hormone content and enzyme

activities during seed germination of Paris polyphylla

KANG Liang1， LU Qinpei1， WANG Debao3， ZHU Dan1， ZHU Kaiming1，

HUANG Xuejing1， GUO Hongwei1，2*

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Bioactive Molecules Research and Evaluation/Pharmaceutical College， Guangxi Medical University， Nanning 530021，

China; 2. Key Laboratory of Longevity and Aging-Diseases of Chinese Ministry of Education /Center for Translational Medicine， Guangxi

Medical University， Nanning 530021， China; 3. Guangxi Bolang Health Industry Development Co.， Ltd.， Nanning 530000， China ）

Abstract：" To investigate the germination physiological mechanism of Paris polyphylla" seeds， different stages of the germination process were divided based on the seed embryo morphology and the changing rules in endogenous hormone content and related enzyme activities were analyzed at different stages. The results were as follows： （1） The germination process of the seeds could be divided into eight stages based on seed embryo morphology： non-germinating embryo stage （S1）， heart-shaped embryo stage （S2）， embryo swelling stage （S3）， radicle not breaking through seed coat stage （S4）， cotyledon petiole elongation and radicle breaking through seed coat stages （S5）， lower hypocotyl breaking through seed coat stage （S6）， upper hypocotyl elongation stage （S7）， and radicle elongation stage （S8）. （2） The α-amylase activity in the seeds was significantly higher than β-amylase activity at all germination stages. （3） Superoxide dismutase （SOD） activity was the highest at stage S5 and the lowest at stage S1; peroxidase （POD） and catalase （CAT） activities generally increased with seed germination progress; soluble protein content initially decreased and then increased with seed germination progress. （4） The contents of hormones such as indoleacetic acid （IAA）， gibberellin （GA3）， abscisic acid （ABA）， and salicylic acid （SA） decreased overall， while 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid （ACC）， jasmonic acid （JA）， brassinolides （BRs） increased overall during seed germination. Cytokinins （CTKs） content showed no significant change. The ratios of IAA/ABA and GA3/ABA decreased initially and then increased， while CTKs/ABA continuously increased with seed germination progress. （5） The contents of ABA， IAA， GA3 were negatively correlated with embryo rate， while ACC， JA， BRs， POD， CAT， and β-amylase activity were positively correlated with embryo rate. In conclusion， the germination process of the seeds can be subdivided into eight stages based on seed embryo morphology， with varying endogenous hormone content and related enzyme activities at different stages. The activities of α-amylase and POD may be related to radicle elongation， while GA3 may affect the embryo formation， and ABA may inhibit the growth and development of the embryo.

Key words： Paris polyphylla， germination stage， endogenous hormone， antioxidant enzymes， amylase

七葉一枝花（Paris polyphylla）是百合科重樓屬植物，為《中華人民共和國(guó)藥典》收載的重樓藥材基原植物，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效（國(guó)家藥典委員會(huì)，2020），是云南白藥、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊等80多種中成藥產(chǎn)品的主要原料。當(dāng)前，我國(guó)七葉一枝花每年的消耗量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其自然生長(zhǎng)量，使其野生藥用資源面臨枯竭的威脅，而人工繁育七葉一枝花是緩解上述矛盾和促進(jìn)其可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。因此，開(kāi)展七葉一枝花人工繁育技術(shù)研究，指導(dǎo)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)人工栽培，對(duì)保護(hù)野生七葉一枝花資源、滿足臨床需求具有重要意義。

七葉一枝花的繁殖包括根莖切塊繁殖、組織培養(yǎng)和種子繁殖3種方式，其中種子繁殖因其繁殖系數(shù)大、資源消耗少而更有利于規(guī)模化種植（馬傳江等，2016）。然而，目前七葉一枝花的種子繁殖研究仍處于低級(jí)階段，種子萌發(fā)過(guò)程中生理生化指標(biāo)方面的研究還較少報(bào)道。在種子萌發(fā)過(guò)程中，淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過(guò)相關(guān)酶的作用發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而為種子發(fā)芽提供營(yíng)養(yǎng)和能量。淀粉酶主要由α-淀粉酶和β-淀粉酶組成，催化種子內(nèi)淀粉降解。隨著種子的萌發(fā)，抗氧化酶開(kāi)始清除種子休眠期積累的有害物質(zhì)活性氧（Bailly et al.， 2008），抗氧化酶系統(tǒng)中主要以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，從而維持正常的細(xì)胞代謝功能。另外，種子萌發(fā)由遺傳和環(huán)境因素共同決定，其萌發(fā)的激素調(diào)控可能是種子植物中一種高度保守的機(jī)制。有研究表明，吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellic acid，GA）等（宋松泉等，2020a， b， c）對(duì)種子萌發(fā)起著重要的生理作用。

七葉一枝花的種子萌發(fā)難，在自然條件下需要經(jīng)過(guò)2年才能萌發(fā)成苗。本團(tuán)隊(duì)在前期研究發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花種子在（20±1） ℃下干燥保存4個(gè)月可促進(jìn)七葉一枝花種子萌發(fā)，但其在萌發(fā)過(guò)程中所參與的多種酶、激素等因子的變化規(guī)律及其與種胚發(fā)育的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以（20±1）℃下干燥保存4個(gè)月的七葉一枝花種子為材料，采用顯微法觀察不同萌發(fā)階段七葉一枝花種子的顯微結(jié)構(gòu)，并采取生理生化法測(cè)定淀粉酶及抗氧化酶，同時(shí)采用質(zhì)譜法測(cè)定8種植物內(nèi)源激素的含量，分析萌發(fā)過(guò)程中胚率與酶活及內(nèi)源激素之間的相關(guān)性，以期探索七葉一枝花種子萌發(fā)的生理機(jī)制，為七葉一枝花人工繁育栽培提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料于2021年11月中旬采自廣西壯族自治區(qū)百色市羅城縣旦興村上旦屯，經(jīng)廣西藥用植物園余麗瑩研究員鑒定為七葉一枝花（Paris polyphylla）的種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)處理" 七葉一枝花種子采收后，立即洗去紅色假種皮，陰干7 d，隨后在（

20±1）℃下干燥保存120 d。于2022年4月開(kāi)始育苗，育苗采用蛭石+育苗盆法，育苗盆大小為22 cm × 15 cm × 8 cm，盆內(nèi)有小格，育苗時(shí)每小格放置1粒種子，每盆40粒，育苗20盆。育苗時(shí)，先潤(rùn)洗蛭石，蛭石以手握不出水為宜，在育苗盆底部鋪墊（2±0.5）cm厚蛭石，放置種子（種子先用自來(lái)水浸泡24 h，再用500 mg·L-1 GA3浸泡24 h），上面覆蓋約0.3 cm厚的蛭石。育苗盆置于（20±1）℃的種子發(fā)芽箱中培養(yǎng)110 d，期間不定期補(bǔ)水，補(bǔ)水以保持蛭石表面濕潤(rùn)為宜。

根據(jù)七葉一枝花種子的種胚形態(tài)和不同發(fā)育階段，將種子萌發(fā)過(guò)程劃分為8個(gè)時(shí)期，即育苗1 d的種子標(biāo)記為S1期，育苗15 d的種子標(biāo)記為S2期，育苗29 d的種子標(biāo)記為S3期，育苗44 d的種子標(biāo)記為S4期，育苗58 d的種子標(biāo)記為S5期，育苗72 d的種子標(biāo)記為S6期，育苗96 d的種子標(biāo)記為S7期，育苗110 d的種子標(biāo)記為S8期。在58 d與72 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，以胚根突破種皮且發(fā)芽的種子為萌發(fā)種子，萌發(fā)率（%）=（每個(gè)取樣時(shí)期的發(fā)芽種子粒數(shù)/取樣的總種子粒數(shù)）×100。

1.2.2 種子顯微結(jié)構(gòu)觀察及形態(tài)測(cè)定" 于S1-S6期隨機(jī)取10粒大小一致的種子，將種子從中間縱切，使用FAA固定液固定，隨后采用番紅固綠染色法制成永久玻片。將玻片放在OLYMPUS正置熒光顯微鏡BX53下觀察、拍照，利用CellSens Dimension軟件測(cè)量種子胚乳橫徑、胚乳縱莖及胚縱徑，并計(jì)算胚率（普甜等， 2023），胚率（%）=（胚縱徑/胚乳縱徑）×100。S7-S8期由于胚根過(guò)長(zhǎng)，因此改在根系掃描儀EPSON 2000上進(jìn)行圖像采集，之后利用WinRHIZO軟件分析胚乳橫徑、胚乳縱莖和胚縱徑。

1.2.3 酶活測(cè)定" 取1.0 g種子3份，先加入1 mL蒸餾水和少量石英砂，磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，再加入4 mL蒸餾水浸提15 min，期間搖動(dòng)數(shù)次。于1 200×g下離心10 min，取上清液定容至10 mL，即為α-淀粉酶、β-淀粉酶待測(cè)酶液。另取0.5 g種子3份，分別加入5 mL的磷酸鈉緩沖液（pH 7.8），研磨成勻漿后于8 000×g下離心20 min，取上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和可溶性蛋白。α-淀粉酶和β-淀粉酶活性參考李小方和張志良（2016）的方法，SOD、POD、CAT、可溶性蛋白測(cè)定參考張志良等（2009）的方法。

1.2.4 內(nèi)源激素的提取和測(cè)定" 取大小一致的種子5粒，置于液氮研磨后稱量100 mg，分別加入1 170 μL乙腈-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V），10 μL ISMix-A（混合內(nèi)標(biāo)A），20 μL ISMix-B（混合內(nèi)標(biāo)B），渦旋60 s，低溫避光超聲25 min， -20 ℃靜置過(guò)夜，在4 ℃ 14 000×g下離心20 min，先取上清液900 μL至96孔去磷脂板中正壓過(guò)濾，再加入200 μL乙腈-水-甲酸溶液（80∶19∶1， V/V）洗脫1次，液氮吹干濾液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)用200 μL甲醇∶水（1∶1， V/V）進(jìn)行復(fù)溶。采用Waters I-Class LC超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相：A液為0.05%甲酸-水溶液，B液為0.05%甲酸-乙腈。樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，柱溫45 ℃，流速為400 μL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL。洗脫梯度： 0～10.0 min，2%～98%B；10.0～10.1 min，98%～2%B；11.1～13.0 min，2%B。采用5500 QTRAP質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在正/負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。5500 QTRAP ESI 源條件： 離子源溫度（Source Temperature）500 ℃，霧化氣壓（Ion Source Gas 1）45 psi，輔助氣壓（Ion Source Gas 2）45 psi，氣簾氣壓（Curtain gas）30 psi，噴霧氣壓（IonSapary Voltage Floating）4 500 V；采用 MRM 模式檢測(cè)待測(cè)離子對(duì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理" 利用IBM SPSS Statistics 22.0 和Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖，分析不同階段的差異顯著性；采用Duncan法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為0.05（Plt;0.05）；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期七葉一枝花種子的形態(tài)解剖特征

由圖1可知，S1期種子未萌發(fā)，視野處無(wú)種胚，為種胚未萌動(dòng)時(shí)期（圖1：B，C）；S2期可見(jiàn)幼胚心形，為心形胚時(shí)期（圖1：D，E）；S3期幼胚進(jìn)一步生長(zhǎng)，幼胚細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)濃，隱約可見(jiàn)子葉、胚根分化，為種胚膨大時(shí)期（圖1：F，G）；S4期種胚可見(jiàn)子葉、胚芽、胚根的分化，種子珠孔處膨大，胚根未突破珠孔，為胚根未突破種皮時(shí)期（圖1： H，I）；S5期子葉柄伸長(zhǎng)，胚根突破珠孔，下胚軸進(jìn)一步伸長(zhǎng)，子葉呈卷曲狀，為子葉柄伸長(zhǎng)、胚根突破種皮時(shí)期（圖1：J，K）；S6期種子胚軸突破珠孔，并加粗膨大呈柱形，子葉仍留在種皮內(nèi)，呈圓柱形，胚根進(jìn)一步伸長(zhǎng)且在與胚軸連接處縮窄，為下胚軸突破種皮時(shí)期（圖1： L，M）；S7期種子上胚軸伸長(zhǎng)，胚根長(zhǎng)為0.3～1 cm，為上胚軸伸長(zhǎng)時(shí)期（圖1： A）；S8期胚軸膨大呈紡錘形，胚根長(zhǎng)大于1.0 cm，為胚根伸長(zhǎng)時(shí)期（圖1 ：A）。

根據(jù)種子的解剖特征，參考蘇海蘭等（2017a）的分類方法，將8個(gè)時(shí)期的種子歸類為3個(gè)不同萌發(fā)階段，分別為打破種胚休眠即將萌動(dòng)階段，含S1期；種胚生長(zhǎng)發(fā)育至上胚軸休眠階段，含S2期至S6期；上胚軸休眠結(jié)束至即將破土出苗階段，含S7期、S8期。

不同時(shí)期七葉一枝花種子胚乳橫徑、胚乳縱徑及胚縱徑測(cè)量結(jié)果（表1）表明，在S1期至S4期胚乳縱徑持續(xù)增長(zhǎng)，43 d內(nèi)增長(zhǎng)率為48.67%，而胚乳橫徑則表現(xiàn)為縮窄，縮窄率為9.75%；在S5期至S7期胚乳橫徑、胚乳縱徑無(wú)明顯差異，但胚縱徑均顯著增長(zhǎng)；S8期種子胚根進(jìn)一步伸長(zhǎng)，胚縱徑、胚乳縱徑顯著高于其他時(shí)期。由七葉一枝花萌發(fā)過(guò)程可知，S1期未觀察到種胚；S2期種胚初分化，胚率為1.78%；S3期、S4期種胚持續(xù)增長(zhǎng)、胚率持續(xù)增長(zhǎng)；S5期、S6期下胚軸突破珠孔且持續(xù)增長(zhǎng)膨大，胚率分別為71.57%、87.09%；S7期、S8期，下胚軸增長(zhǎng)減緩，而胚根則迅速增長(zhǎng)，胚率分別為139.43%、318.53%。七葉一枝花種子在育苗58 d和72 d的萌發(fā)率分別為61.20%、80.40%。

2.2 不同時(shí)期七葉一枝花種子淀粉酶和抗氧化酶活性的變化

2.2.1 淀粉酶活性變化" 由圖2： A可知，七葉一枝花種子的α-淀粉酶活性隨萌發(fā)進(jìn)程在S4期出現(xiàn)小高峰，達(dá)440.7 μg·g-1FW·min-1，較S1期升高2.67倍，并在S6期下降至最小值，之后于S8期達(dá)到最大值502.83 μg·g-1FW·min-1，表明α-淀粉酶可誘導(dǎo)子葉和胚芽的發(fā)育以及胚根細(xì)胞的分化。由圖2： B可知，七葉一枝花種子β-淀粉酶活性隨萌發(fā)進(jìn)程先下降后上升。S1期時(shí)β-淀粉酶活性較高，在S2期時(shí)該酶活性快速下降至10.11 μg·g-1FW·min-1，在S3-S7期呈現(xiàn)出波動(dòng)性上升的趨勢(shì)，并在S8期時(shí)其活性顯著增加。七葉一枝花種子在不同萌發(fā)時(shí)期α-淀粉酶活性均明顯高于β-淀粉酶，說(shuō)明七葉一枝花的種子主要以α-淀粉酶水解淀粉和糖原，并提供碳水化合物和能量，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)。

2.2.2 抗氧化酶活性變化" 在七葉一枝花種子萌發(fā)的不同時(shí)期SOD活性總體趨勢(shì)變化不大，其中S1期和S6期顯著低于其他時(shí)期 （圖3： A）。POD活性在S1期至S7期的變化波動(dòng)較大，但在S8期時(shí)活性顯著增強(qiáng)，達(dá)11 388.23 U·g-1 FW·min-1（圖3： B），表明POD可能參與調(diào)控七葉一枝花的種胚細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)種子萌發(fā)胚根伸長(zhǎng)。CAT活性隨萌發(fā)進(jìn)程總體呈上升趨勢(shì)，并且其活性在S7期、S8期時(shí)顯著高于其他時(shí)期（圖3：C），表明CAT可能參與調(diào)控胚乳分解且促進(jìn)了下胚軸膨大和胚根伸長(zhǎng)。可溶性蛋白含量隨萌發(fā)進(jìn)程先下降后升高，S1期至S5期的結(jié)果表明七葉一枝花種子內(nèi)部的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，為種子的休眠解除提供物質(zhì)和能量（圖3：D）。

2.3 七葉一枝花種子內(nèi)源激素含量和比例的變化

2.3.1 種子內(nèi)源激素含量變化" 不同萌發(fā)時(shí)期七葉一枝花種子各激素含量的變化較大。IAA、GA3、ABA和SA含量呈逐漸下降趨勢(shì)，并在S2期時(shí)含量最高，在S4期至S8期時(shí)含量顯著下降（圖4：A-C，G）。IAA含量在S6期時(shí)下降至5.5 ng·g-1FW（圖4：A）；GA3含量在S4期時(shí)下降至11.06 ng·g-1FW（圖4：B）；ABA含量在S8期時(shí)最低，僅為S2期的15.32%（圖4：C）。水楊酸（salicylic acid，SA）含量在S4期至S8期時(shí)顯著下降（圖4：G）。細(xì)胞分裂

素類（cytokinins， CTKs）含量在不同時(shí)期無(wú)顯著性差異（圖4：D）。1-氨基環(huán)丙烷羧酸（l-aminocyclo-propane-l-carboxylic acid， ACC）是乙烯的合成前體，而乙烯可促進(jìn)種子休眠解除。ACC含量隨七葉一枝花種子萌發(fā)進(jìn)程呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，并在S4期時(shí)最低（60.59 ng·g-1FW），在S8期時(shí)最高，達(dá)162.51 ng·g-1FW（圖4：E）。茉莉酸（jasmonic acid，JA）含量在S2期、S4期、S6期時(shí)無(wú)顯著性差異，而在S8期則顯著上升，為S4期的10.01倍（圖4： F）。油菜素內(nèi)酯（brassinolides，BRs）含量隨種子萌發(fā)進(jìn)程呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，在S8期高達(dá)6 572.19 ng·g-1FW（圖4：H）。

2.3.2 種子內(nèi)源激素比例變化" 由圖5可知，IAA/ABA、GA3/ABA變化趨勢(shì)基本相似，即先降后升，但I(xiàn)AA/ABA在S6期降至最低，而GA3/ABA在S4期時(shí)降至最低，表明IAA、GA3在種子萌發(fā)作用上具有協(xié)同效應(yīng)。CTKs/ABA隨種子萌發(fā)進(jìn)程不斷升高。

2.4 七葉一枝花的種子酶活性、內(nèi)源激素含量與種子胚率的相關(guān)性

由表2可知，在七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程中，ABA、IAA、GA3含量與胚率呈顯著負(fù)相關(guān)，而ACC、JA、BRs含量與胚率則呈顯著正相關(guān)，并且POD、CAT、β-淀粉酶與胚率呈極顯著正相關(guān)。通過(guò)比較激素含量之間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果為RABAgt;RBRsgt;RACCgt;RJAgt;RIAAgt;RGA3gt;RSAgt;RCTKs。

3" 討論與結(jié)論

3.1 七葉一枝花的種胚生長(zhǎng)階段劃分和種子育苗管理

蘇海蘭等（2017a）將七葉一枝花種子萌發(fā)分

為3個(gè)階段，即未萌發(fā)、未解除休眠階段（第一階段）；萌發(fā)后上胚軸并不伸長(zhǎng)，當(dāng)年不出苗，處于上胚軸休眠階段（第二階段）；上胚軸伸長(zhǎng)，子葉發(fā)育完全，即將破土出苗階段（第三階段）。本研究與蘇海蘭等（2017a）的劃分方法略有不同，在第二階段的上胚軸休眠階段中，可細(xì)分為5個(gè)時(shí)期，即心形胚時(shí)期（S2期）、種胚膨大時(shí)期（S3期）、胚根未突破種皮時(shí)期（S4期）、子葉柄伸長(zhǎng)和胚根突破種皮時(shí)期（S5期）、下胚軸突破種皮時(shí)期（S6期）。本研究在七葉一枝花種子萌發(fā)進(jìn)程中，露白、胚根伸長(zhǎng)和上胚軸萌發(fā)是種子萌發(fā)進(jìn)程的重要標(biāo)志：種子在進(jìn)入S5期時(shí)，種子開(kāi)始露白，此時(shí)取出種子播種，可提高種子田間存活率；而在種子進(jìn)入S6期后，種子的胚軸突破種皮，種胚僅靠子葉柄與種殼相連，若此時(shí)取出種子播種，就容易造成子葉柄斷裂，從而導(dǎo)致種胚死亡。

3.2 種子酶活性變化對(duì)七葉一枝花種子萌發(fā)的影響

種子通過(guò)各種酶的作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)、淀粉、脂質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)種胚發(fā)育、胚根分化和出苗等活動(dòng)。本研究結(jié)果表明，七葉一枝花種子的α-淀粉酶活性在種子休眠未解除時(shí)較低，珠孔膨大時(shí)上升，與蘇海蘭等（2017b）的研究結(jié)果一致，但隨后酶活性下降，至S8期時(shí)再度上升，與蘇海蘭等（2017b）的研究結(jié)果不同，這可能與本研究中七葉一枝花種子的胚根伸長(zhǎng)發(fā)生時(shí)期較后有關(guān)，α-淀粉酶分解淀粉所釋放的能量作用于胚根的伸長(zhǎng)，從而導(dǎo)致α-淀粉酶活性升高（王鳳鳳等，2017）。

本研究中，七葉一枝花從種子休眠期向萌動(dòng)期過(guò)渡，并伴隨著體內(nèi)抗氧化酶活性的變化，SOD活性在S2-S5、S7-S8期均呈高值，此類時(shí)期均伴有種胚細(xì)胞增多的特征，而在S1、S6期SOD活性較低。這與浙貝母（許美玲，2019）、滇重樓（李戈等，2015; 蘇海蘭等，2018）、華重樓（李昭玲等，2015）萌發(fā)時(shí)SOD的變化無(wú)規(guī)律略有不同。但一般認(rèn)為，種子維持較高的SOD活性則有利于對(duì)活性氧以及過(guò)氧化氫的清除，為種子萌發(fā)創(chuàng)造了良好條件（Buetler， et al.，2004; Liszkay et al.，2004）。本研究中，POD活性在胚根伸長(zhǎng)時(shí)期較其他時(shí)期顯著提高，這與七葉一枝花（蘇海蘭等，2017a）、天山郁金香（張偉，2020）的研究結(jié)果一致，POD活性參與植物細(xì)胞壁的形成和脂肪酸的氧化，在S8期時(shí)該酶活性增加可為胚根伸長(zhǎng)提供能量。

3.3 IAA、GA及ABA與七葉一枝花種子萌發(fā)的關(guān)系

植物激素對(duì)種子萌發(fā)有至關(guān)重要的調(diào)控作用，七葉一枝花隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程，種子內(nèi)源激素含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，從而參與調(diào)控種子。本研究中，七葉一枝花種子IAA含量高峰出現(xiàn)在S2期，該高峰的出現(xiàn)可能與種子的種胚形成有關(guān)，本研究結(jié)果與多花黃精（張武君等，2022）、紫花苜蓿（李浩天等，2023）的研究結(jié)果相似，但與蘇海蘭等（2017a）與李曉冬（2018）的研究結(jié)果卻

不同。Liu等（2013）的研究發(fā)現(xiàn)，IAA在擬南芥種子的休眠過(guò)程中起正向調(diào)控作用，是第二類促進(jìn)種子休眠的激素；而本研究發(fā)現(xiàn)，IAA含量在心形胚時(shí)期最高，可能與種子剛結(jié)束休眠有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IAA含量與胚縱莖、胚率呈顯著負(fù)相關(guān)，與七葉一枝花（蘇海蘭等，2017a）、滇重樓（浦梅等，2016）的研究結(jié)果不同，這可能與不同的萌發(fā)階段需要不同濃度的IAA刺激有關(guān)。成京晉等（2018）的研究發(fā)現(xiàn)，多花黃精種子在層積過(guò)程中IAA含量無(wú)明顯變化規(guī)律；李浩天等（2023）的研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿種子IAA含量隨萌發(fā)進(jìn)程遞減，這與本研究的結(jié)果相似。

本研究中，七葉一枝花的種子ABA含量隨萌發(fā)進(jìn)程降低，這與滇重樓（浦梅等，2016）、棉花（夏

軍等，2019）的種子萌發(fā)現(xiàn)象相似，而與蘇海蘭等（2017a）對(duì)七葉一枝花的種子萌發(fā)現(xiàn)象不同。ABA正向調(diào)控種子的休眠誘導(dǎo)和維持（宋松泉等，2020b），并且在吸脹的休眠種子中其萌發(fā)的抑制是在吸脹過(guò)程中維持較高水平的ABA積累（Iwasakiet al.，2022）。但是，Schmitz等（2002）的研究認(rèn)為，種子之所以萌發(fā)是因?yàn)榕邔?duì)ABA敏感性下降，與ABA含量降低關(guān)系不大。

GA3含量在S2期大量積累，此時(shí)形成心形胚，表明GA3參與調(diào)控七葉一枝花種子的種胚形成和發(fā)育，可能作為上游信號(hào)調(diào)控七葉一枝花種子整個(gè)萌發(fā)進(jìn)程的開(kāi)始，這與蘇海蘭等（2017a）的研究結(jié)果不同。種子萌發(fā)與否取決于胚生長(zhǎng)的機(jī)械力和胚乳的限制力，前期較高的GA3含量既可以弱化種胚覆蓋層的機(jī)械阻力（宋松泉等，2020c），也可以誘導(dǎo)α-淀粉酶進(jìn)而動(dòng)員貯藏物的降解（Hauvermale， et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)GA3對(duì)七葉一枝花種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，而GA3含量在S4期和S8期較低，推測(cè)GA3可能與胚根伸長(zhǎng)關(guān)系不大。在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中，GA生物合成的時(shí)空表達(dá)模式顯示，GA4僅在胚根伸出前積累（Urbanova amp; Leubner-Metzger，2016），隨后含量下降，本研究結(jié)果與之相似。

種子萌發(fā)不僅受內(nèi)源激素各自含量的影響，還與各類激素之間的平衡有關(guān)，特別是促進(jìn)生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)激素之間的比例和平衡，而ABA與GA之間的動(dòng)態(tài)平衡是種子打破休眠與萌發(fā)的關(guān)鍵（佐月和許永華，2021）。本研究結(jié)果顯示，七葉一枝花種子在S2期GA3/ABA比值較高，可能與該時(shí)期接近S1期有關(guān)，ABA和GA的比值是植物種子休眠狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)器（佐月和許永華，2021），S1期是七葉一枝花種子打破休眠開(kāi)始萌發(fā)的始點(diǎn)，往往含有較高GA3/ABA比值，而往后GA3/ABA比值降低。IAA與ABA對(duì)種子萌發(fā)具有協(xié)同作用，

Shuai等（2017）研究表明IAA可促進(jìn)ABA的生物合成且降低ABA分解，并可增強(qiáng)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Shu et al.，2016）。本研究中，七葉一枝花的IAA/ABA值從S2-S6期逐漸降低，而在S8期因IAA促進(jìn)胚根生長(zhǎng)（Casanova-Sáez amp; Vo，2019）而進(jìn)一步升高。

綜上所述，根據(jù)種胚形態(tài)可將七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程細(xì)分為8個(gè)時(shí)期，在不同時(shí)期種子內(nèi)源激素含量及相關(guān)酶活性各不相同，其中α-淀粉酶活性、POD活性可能與種胚胚根伸長(zhǎng)有關(guān)，GA3可能影響七葉一枝花種胚形成，而ABA則可能抑制種胚的生長(zhǎng)發(fā)育。

參考文獻(xiàn)：

BAILLY C， EL-MAAROUF-BOUTEAU H， CORBINEAU F， 2008. From intracellular signaling networks to cell death： the dual role of reactive oxygen species in seed physiology ［J］. C R Biol， 331（10）： 806-814.

BUETLER TM， KRAUSKOPF A， RUEGG UT， 2004. Role of superoxide as a signaling molecule ［J］. Physiology， 19（3）： 120-123.

CASANOVA-SEZ R， VO U， 2019. Auxin metabolism controls developmental decisions in land plants ［J］. Trends Plant Sci， 24（8）： 741-754.

CHENG JJ， DABUXILATU， LIU J， et al.， Physiological research on the after-ripening process of the Polygonatum cyrtonema Hua seed ［J］. Seed， 37（10）： 31-35. ［成京晉， 達(dá)布希拉圖， 劉佳， 等， 2018. 多花黃精種子后熟過(guò)程生理研究 ［J］. 種子， 37（10）： 31-35.］

Chinese Pharmacopoeia Commission， 2020. Chinese Pharmacopoeia： 2020 ed. Part 2 ［M］. Beijing： China Medical Science and Technology Press. ［國(guó)家藥典委員會(huì)， 2020. 中華人民共和國(guó)藥典： 2020年版. 二部 ［M］. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.］

HAUVERMALEE AL， ARIIZUMI T， STEBER CM， 2012. Gibberellin signaling： a theme and variations on DELLA repression ［J］. Plant Physiol， 160（1）： 83-92.

IWASAKE M， PENFIELD S， LOPEZ-MOLINA L， 2022. Parental and environmental control of seed dormancy in Arabidopsis thaliana ［J］. Ann Rev Plant Biol， 73（1）： 355-378.

LI G， TANG L， WANG YF， et al.， 2015. Effect of different stratification treatment on physiological characteristics of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis seed ［J］. Chin Agric Sci Bull， 31（7）： 149-153. ［李戈， 唐玲， 王艷芳， 等， 2015. 不同層積條件下滇重樓種子的生理變化） ［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 31（7）： 149-153.］

LI HT， SUI XQ， YANG J， et al. 2023. Dynamics of endogenous hormones during seed germination in Medicago sativa ［J］. Grassl Turf， 43（4）： 72-80. ［李浩天， 隋曉青， 楊靜， 等， 2023. 紫花苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化 ［J］. 草原與草坪， 43（4）： 72-80.］

LI XD， 2018. Study on rapid germination of Paris polyphylla var. chinensis seeds ［D］. Yangling： Northwest A amp; F University. ［李曉冬， 2018. 華重樓種子快速萌發(fā)研究 ［D］. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué).］

LI XF， ZHANG ZL， 2016. Experimental supervision of plant physiology ［M］. 5th ed. Beijing： Higher Education Press. ［李小方， 張志良， 2016. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) ［M］. 5版. 北京： 高等教育出版社.］

LI ZL， TONG K， YAN S， et al.， 2015. Physiological and biochemical change of Paris seed in after-ripening during variable temperature stratification ［J］. Chin J Chin Mat Med， 40（4）： 629-633." ［李昭玲， 童凱， 閆燊， 等， 2015. 變溫層積過(guò)程中華重樓種胚后熟生理生化的變化 ［J］. 中國(guó)中藥雜志， 40（4）： 629-633.］

LISZKAY A， VAN DER ZALM E， SCHOPFER P， 2004. Production of reactive oxygen intermediates （O2-， H2O2， and˙OH） by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth ［J］. Plant Physiol， 136（2）： 3114-3123.

LIU XD， ZHANG H， ZHAO Y， et al. 2013. Auxin controls seed dormancy through stimulation of abscisic acid signaling by inducing ARF-mediated ABI3 activation in Arabidopsis ［J］. Proc Natl Acad Sci， 110（38）： 15485-15490.

MA CJ， LU S， CAO GS， et al. 2016. Breeding Technology of Paris polyphylla var. chinensis ［J］. Chin J Exp Tradit Med Form， 22（18）： 192-196. ［馬傳江， 逯雙， 曹廣尚， 等， 2016. 七葉一枝花繁育技術(shù)研究進(jìn)展 ［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 22（18）： 192-196.］

PU M，SUN YY， GAO CJ， et al.， 2016. Relationship between endogenous hormone content and embryo growth and the seed germination of Paris polyphylla var. yunnanensis ［J］. For Res， 29（2）： 268-273. ［浦梅， 孫永玉， 高成杰， 等，2016. 滇重樓種子內(nèi)源激素含量與種胚長(zhǎng)度和萌發(fā)的關(guān)系 ［J］. 林業(yè)科學(xué)研究， 29（2）： 268-273.］

PU T， LI HL， WANG J， et al.， 2023.Seed germination characteristics and seedling types of Malania oleifera， a rare and endangered plant ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 43（2）： 242-254. ［普甜， 栗宏林， 王娟， 等， 2023. 珍稀瀕危植物蒜頭果種子萌發(fā)特征與幼苗類型的研究 ［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 43（2）： 242-254.］

SCHMITZ N， ABRAMS SR， KERMODE AR， 2002. Changes in ABA turnover and sensitivity that accompany dormancy termination of yellow-cedar （Chamaecyparis nootkatensis） seeds ［J］. J Exp Bot， 53（366）： 89-101.

SHU K， LIU XD， XIE Q， et al.， 2016. Two faces of one seed： hormonal regulation of dormancy and germination ［J］. Mol Plant， 9（1）： 34-45.

SHUAI HW， MENG YJ， LUO XF， et al.， 2017. Exogenous auxin represses soybean seed germination through decreasing the gibberellin/abscisic acid （GA/ABA） ratio ［J］. Sci Rep， 7（1）： 1-11.

SONG SQ， LIU J， TANG CF， et al.， 2020a. Metabolism and signaling of auxins and their roles in regulating seed dormancy and germination ［J］. Chin Sci Bull， 65： 3924-3943. ［宋松泉， 劉軍， 唐翠芳， 等， 2020a. 生長(zhǎng)素代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機(jī)制 ［J］. 科學(xué)通報(bào)， 65： 3924-3943］.

SONG SQ， LIU J， XU HH， et al.， 2020b. ABA metabolism and signaling and their molecular mechanism regulating seed dormancy and germination ［J］. Sci Agric Sin， 53（5）： 857-873. ［宋松泉， 劉軍， 徐恒恒， 等， 2020b. 脫落酸代謝與信號(hào)傳遞及其調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機(jī)制 ［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 53（5）： 857-873.］

SONG SQ， LIU J， HUANG H， et al.， 2020c. Gibberellin metabolism and signaling and its molecular mechanism in regulating seed germination and dormancy ［J］. Sci Sin Vit，50（6）： 599-615. ［宋松泉， 劉軍， 黃薈， 等，2020c. 赤霉素代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控種子萌發(fā)與休眠的分子機(jī)制 ［J］. 中國(guó)科學(xué)： 生命科學(xué)， 50（6）： 599-615.］

SU HL， ZHOU XZ， LI X， et al.， 2017a. Physicochemical changes of Paris polyphylla var. chinensis seed during different stages of germination ［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 48（22）： 4755-4763." ［蘇海蘭， 周先治， 李希， 等， 2017a. 七葉一枝花種子萌發(fā)不同階段生理生化變化研究 ［J］. 中草藥， 48（22）： 4755-4763.］

SU HL， ZHOU XZ， LI X， et al.， 2017b. Carbohydrate content and amylase activity in germinating seeds of Paris polyphylla Smith var. chinensis ［J］." Fujian J Agric Sci， 32（10）： 1145-1149. ［蘇海蘭， 周先治， 李希， 等， 2017b. 七葉一枝花種子萌發(fā)不同階段貯藏物質(zhì)及淀粉酶活性變化 ［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，32（10）： 1145-1149.］

SU HL， ZHOU XZ， LI X， et al.， 2018.Dynamic changes of enzyme and endogenous of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis seed during different stages of germination ［J］. J Nucl Agric Sci， 32（1）： 141-149nbsp; ［蘇海蘭， 周先治， 李希， 等， 2018. 云南重樓種子萌發(fā)過(guò)程內(nèi)源激素含量及酶活性變化研究 ［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)， 32（1）： 141-149.］

URBANOVA T， LEUBNER-METZGER G， 2016.Gibberellins and seed germination ［M］. Manhattan： Johnwiley amp; Sons. Ltd.

WANG FF， LIU WG， LU HY， et al.， 2017. Spatiotemporal variation of α-amylase in germinating corn grains ［J］. Barley Cereal Sci， 34（4）： 16-19. ［王鳳鳳， 劉衛(wèi)國(guó)， 陸海燕， 等， 2017. 萌動(dòng)玉米籽粒中α-淀粉酶的時(shí)空變化 ［J］. 大麥與谷類科學(xué)， 34（4）： 16-19.］

XIA J， SHI XJ， HAO XZ， et al.， 2019. Effects of low temperature on enzyme activity and hormone content in germination of different genotypes of cotton seeds ［J］. Plant Physiol J， 55（9）： 1291-1305. ［夏軍， 時(shí)曉娟， 郝先哲， 等， 2019. 低溫對(duì)不同基因型棉種萌發(fā)過(guò)程中酶活性及激素含量的影響 ［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 55（9）： 1291-1305.］

XU ML， 2019. Studies on seed dormancy and germination characteristics of Fritillaria przewalskii Maxim ［D］. Lanzhou： Gansu Agricultural University." ［許美玲， 2019. 甘肅貝母種子休眠及萌發(fā)特性研究 ［D］. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).］

ZHANG W， 2020. Study on dormancy releasing mechanism of Tulipa thianschanica regel seeds ［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University." ［張偉， 2020. 天山郁金香種子休眠解除機(jī)制研究 ［D］. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué).］

ZHANG WJ， ZHAO YQ， LIU BC， et al.， 2022. Physiological changes of Polygonatum cyrtonema Hua seeds during stratification ［J］. Fujian J Agric Sci， 37（8）： 995-1007. ［張武君， 趙云青， 劉保財(cái)， 等， 2022. 多花黃精種子層積過(guò)程生理變化研究 ［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 37（8）： 995-1007.］

ZHANG ZL， QU WJ， LI XF， et al. 2009. Experimental supervision of plant physiology ［M］. Beijing： Higher Education Press. ［張志良， 瞿偉菁， 李小方， 等， 2009. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) ［M］. 北京： 高等教育出版社.］

ZUO Y， XU YH， 2021. Research progress on the mechanism of GA and ABA during seed germination ［J］. Mol Plant Breed， 19（18）： 6221-6226. ［佐月， 許永華， 2021. 種子萌發(fā)過(guò)程中GA與ABA的作用機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］. 分子植物育種， 19（18）： 6221-6226.］

（責(zé)任編輯" 蔣巧媛" 王登惠）