北沙參種子內源抑制物質活性研究

摘" 要：研究北沙參種子和果皮各分離相對白菜種子萌發(fā)和幼苗的影響，探討北沙參種子內源抑制物的活性。對北沙參種子不同部位的浸提液通過系統(tǒng)溶劑法進行分離，分離出石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、甲醇相和水相，并以各分離相對白菜種子進行萌發(fā)實驗，測定北沙參種子內源抑制物生物活性。結果顯示，①北沙參種子、果皮各分離相對白菜種子萌發(fā)均有一定的抑制作用，其中抑制作用最強的是甲醇相，其次是乙酸乙酯相；與對照組相比，各處理組的發(fā)芽指數均有一定程度的下降；甲醇相的平均發(fā)芽天數顯著長于其他處理。②北沙參種子、果皮各分離相在抑制白菜幼苗根長和芽長方面表現出明顯的差異，其中，甲醇相的抑制作用最顯著，其次為乙酸乙酯相。與萌發(fā)指標結果一致。北沙參種子不同部位分離相對白菜種子萌發(fā)及幼苗存在不同程度的抑制作用，表明北沙參種子、果皮均含有高活性抑制物質，主要存在于甲醇相和乙酸乙酯相，因此，北沙參種子中的內源抑制物是導致其休眠的主要原因。

關鍵詞：蒙藥；北沙參；種子休眠；內源抑制物；生物活性

中圖分類號：R282.71" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2024）05-0055-04

Abstract： The effects of seed and pericarp isolation of Radix Glehniae（aks. CoasiaI GIehnia Root） on seed germination and seedlings of Chinese cabbage were studied to explore the activity of endogenous inhibitors in seeds of Radix Glehniae. The extracts from different parts of the seeds of Radix Glehniae were separated by systematic solvent method， and the petroleum ether phase， dichloromethane phase， ethyl acetate phase， n-butanol phase， methanol phase and water phase were separated， and the germination experiments were carried out relative to Chinese cabbage seeds. The biological activity of endogenous inhibitors in Radix Glehniae seeds was determined. The results showed that： ①The separation of seeds and pericarps of Radix Glehniae had a certain inhibitory effect on the germination of Chinese cabbage seeds， in which methanol phase was the strongest， followed by ethyl acetate phase. Compared with the control group， the germination index of each treatment group decreased to a certain extent， and the average germination days of methanol phase was significantly longer than that of other treatments. ②The separated phases of seeds and pericarps of Radix Glehniae showed obvious differences in inhibiting root length and bud length of Chinese cabbage seedlings， among which methanol phase was the most significant， followed by ethyl acetate phase. The results were consistent with the germination index. The isolation of different parts of the seeds of Radix Glehniae had different inhibitory effects on the seed germination and seedlings of Chinese cabbage， which indicated that the seeds and pericarps of Radix Pseudostellariae contained highly active inhibitors， which mainly existed in methanol phase and ethyl acetate phase. The endogenous inhibitor in the seeds of Radix Glehniae is the main reason for its dormancy.

Keywords： Mongolian medicine; Radix Glehniae; seed dormancy; endogenous inhibitor; biological activity

種子休眠是一種復雜的生理過程，是種子萌發(fā)和植物生長發(fā)育的重要保障[1-3]。近年來，種子休眠機理的研究一直是植物界中受到關注的一個方面，但仍被認為是了解最少的領域之一。對于植物來說，種子休眠被視為一種有效的生態(tài)調節(jié)機制，將發(fā)芽推遲到適合幼苗生長的季節(jié)和條件才會打破休眠[4-6]。13世紀初，Albertus Magus認為種子發(fā)芽延遲與抑制物質有關[7]。

內源抑制物質是種子休眠的主要元素之一[8]，種子不同部位中可能存在于不同內源抑制物，以不同方式阻礙種子生理活動或代謝環(huán)節(jié)，從而降低種子發(fā)芽率[9-10]。不同植物所含的內源抑制劑不同，南方紅豆杉種子的胚乳、中種皮和內種皮中含有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的物質[11]。準噶爾山楂不同部位的浸提液含有抑制物質，不同部位浸提液對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用不同[12]。因此，通過研究植物種子中內源抑制物質的類型、功效、活性和作用機制來破除種子休眠，促進種子萌發(fā)，不僅是解決植物人工繁殖和資源拓展問題的關鍵技術[13]，而且在農林業(yè)生產中具有重要意義[14]。

北沙參為傘形科植物珊瑚菜（Glehnia Littoralis Fr.Schmidt ex Miq.）的干燥根，是常用蒙藥之一，北沙參味甘、微苦，性輕、涼、膩、柔。功能有清肺熱、止咳、潤肺，主治肺熱咳嗽、咯痰帶血、胸痛、胸悶、氣喘、慢性氣管炎和體虛無力[15]。北沙參是廣泛應用的重要中蒙藥材品種[16]。市場上北沙參藥材主要以人工栽培品種[17]，國內已有較大面積栽培，北沙參主要以種子繁殖，但因北沙參種子休眠較深[18]、發(fā)芽率較低[19]等特點，其規(guī)模化栽培種植受到了限制。目前有關北沙參的研究大多集中于種植管理[20]、化學成分[21]、藥理作用和臨床應用[22]方面，而種子還有內源抑制物方面的研究很少見。本研究以北沙參種子為實驗材料，采用系統(tǒng)溶劑法對北沙參種子不同部位的浸提液進行萃取，并以各分離相對白菜種子進行生物活性測定，探究其內源抑制物的活性及分布，旨在為進一步研究北沙參種子的破除休眠技術及休眠機制提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

2021年7月，北沙參種子從內蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家營子鎮(zhèn)王家營子村購買后保存在-20 ℃冰箱中。白菜種子購自南京金盛達種子公司，純度達到95.0%以上，發(fā)芽率達到85%以上。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 北沙參種子不同部位甲醇浸提液的制備

取北沙參種子將其分為種子、果皮。每一部分磨碎成粉末，稱取50 g，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加入500 mL80%甲醇溶液，在室溫下密閉浸提，以獲得甲醇浸提液，4次重復，最后將提取液混合，減壓濃縮，定容至50 mL。

1.2.2" 北沙參種子不同部位內源抑制物質的初步分離

對甲醇提取物采用系統(tǒng)溶劑法進行石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、甲醇相及水相的分離。分離相用于旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)和濃縮。最后將各分離相定容至50 mL，并在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3" 北沙參種子不同分離相的活性測定

隨機取25粒白菜種子，9 cm培養(yǎng)皿中分別加入各分離相溶液3 mL，揮發(fā)完全（水相除外）后，加入3 mL蒸餾水，并以水為對照（CK），在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)實驗，4次重復。48 h后，計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數、平均發(fā)芽天數。72 h后，測量幼苗根長及芽長。

1.2.4" 數據分析

通過MicrosoftExcel 2017和SPSS26.0軟件整理種子的萌發(fā)情況相關數據以及對各指標進行單因素方差分析，使用Origin 2021作圖。實驗結果以平均值±標準誤差表示。

2" 結果與分析

白菜種子發(fā)芽快、整齊，經常被用來驗證各分離相的生物活性。初步實驗表明，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水對白菜種子萌發(fā)無顯著影響。因此，各分離相處理后白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數、平均發(fā)芽天數的變化均由分離相中的內源抑制物引起的。其中，正丁醇本身有抑制作用，因此發(fā)芽率為0。

2.1" 北沙參種子各分離相對白菜種子萌發(fā)的影響

北沙參種子的石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相都會抑制白菜種子萌發(fā)，其中甲醇相的抑制作用最為顯著，發(fā)芽率從對照的88%下降到10%，降低了78%；其次是乙酸乙酯相，發(fā)芽率降低至26%，較對照降了62%?？梢钥闯?，北沙參種子各分離相對白菜種子發(fā)芽率的抑制作用由強到弱為正丁醇相、甲醇相、乙酸乙酯相、水相、二氯甲烷相、石油醚相（表1）。

與對照組相比，北沙參種子各分離相處理白菜種子后，其發(fā)芽指數也有所降低。種子甲醇相和乙酸乙酯相的發(fā)芽指數較對照組分別下降了15.79、11.41。北沙參種子各分離相對白菜種子平均發(fā)芽天數的差異顯著，其甲醇相的平均發(fā)芽天數，顯著長于其他處理。白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數和平均發(fā)芽天數結果均表明：北沙參種子的各分離相中可能存在一些發(fā)芽抑制物質。

2.2" 北沙參果皮各分離相對白菜種子萌發(fā)的影響

北沙參果皮的石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相對白菜種子的萌發(fā)均有顯著抑制作用，其中甲醇相的抑制作用最為顯著，發(fā)芽率由對照的88%下降到10%，下降了78%；其次是乙酸乙酯相，其發(fā)芽率下降到19%，比對照降了69%（表2）。可以看出，北沙參果皮的各分離相對白菜種子發(fā)芽率的抑制作用由強到弱為：正丁醇相、甲醇相、乙酸乙酯相、水相、二氯甲烷相、石油醚相，這與種子的抑制作用的強弱順序是一致的。

北沙參果皮各分離相處理白菜種子后，其發(fā)芽指數明顯低于對照組，表現出顯著的差異。果皮甲醇相和乙酸乙酯相的發(fā)芽指數較對照組分別下降了15.55、12.96。北沙參果皮各分離相對白菜種子平均發(fā)芽天數的差異顯著，其甲醇相的平均發(fā)芽天數顯著長于其他處理。研究表明，北沙參果皮中可能存在萌發(fā)抑制物，這些物質對白菜種子的萌發(fā)產生了顯著影響，導致其發(fā)芽率降低。

2.3" 北沙參種子與果皮各分離相對白菜幼苗的影響

如圖1所示，北沙參種子的各分離相一定程度上抑制白菜幼苗根長和芽長，其中，甲醇相的抑制作用最強，抑制率從對照的0上升到99.29%，99.27%；其次為乙酸乙酯相，抑制率上升到98.53%，95.22%?？梢钥闯觯鄙硡⒎N子的各分離相對白菜幼苗根長和芽長抑制作用由強到弱為正丁醇相、甲醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相、水相、石油醚相；北沙參果皮的各分離相也對白菜幼苗根長和芽長都有不同程度的抑制作用，其中，甲醇相的抑制作用最強，抑制率從對照的0上升到99.39%，99.46%；其次為乙酸乙酯相，抑制率上升到98.69%，96.46%?？梢钥闯?，北沙參果皮的各分離相對白菜幼苗根長和芽長抑制作用由強到弱為正丁醇相＞甲醇相＞乙酸乙酯相＞二氯甲烷相＞石油醚相＞水相。

3" 討論與結論

種子休眠是一種復雜的生理生態(tài)機制，可以使植物在復雜的環(huán)境條件下停止生長和發(fā)育[23]。種子休眠因素非常多，其中包括種子內源抑制物，是種子休眠的非常重要的原因之一[18]。內源抑制物大多存在于休眠種子的不同部位[24]，種類較多，影響種子的正常發(fā)芽和幼苗生長[25]。觀光木種子的不同部位含有抑制白菜種子發(fā)芽和幼苗生長的物質[26]。紫斑牡丹種皮、胚乳也含有抑制白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的物質[27]。刺五加的果實、外果皮、中果皮和種子都含有一定活性內源抑制物質[28]。本研究中北沙參種子和果皮各分離相對白菜種子萌發(fā)及幼苗根長和芽長均有不同程度的抑制作用，表明北沙參種子和果皮均含有活性極強的抑制物質。肉果秤錘核果乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相中含有抑制種子萌發(fā)的物質，且甲醇相的抑制作用最強[29]。南京椴果皮、種皮和胚乳中都含有抑制白菜種子萌發(fā)的物質，其中果皮抑制物主要存在于乙醚相和甲醇相，種子抑制物主要存在于甲醇相，對白菜種子萌發(fā)有明顯的抑制作用[30]。南京紫椴種皮的抑制活性大于種皮和胚乳，種皮中含有的抑制物質主要存在于乙醚相和甲醇相，而種子中的抑制物質主要存在于甲醇相[30]。本研究中北沙參種子和果皮的石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、甲醇相和水相對白菜種子萌發(fā)及幼苗根長和芽長均有顯著影響，活性較強的內源抑制物主要分布在甲醇相和乙酸乙酯相，這可能是與其生理休眠機制有關。

4" 展望

北沙參是我國著名的“八大祁藥”之一。由于北沙參藥用價值和食用價值較高，被過度開發(fā)，野生資源瀕臨滅絕，已被載入《中國植物紅皮書》[31]。因北沙參需求量不斷增加，成功培育北沙參對確保北沙參資源的穩(wěn)定性和可再生性具有十分重要的意義。在自然條件下，北沙參種子萌發(fā)率較低，這主要是由于它們所含內源抑制物，其中含有較多的是香豆素類成分。目前，多數的研究都集中在內源抑制物對種子萌發(fā)的抑制作用[32-34]。本研究表明，北沙參種子不同部位分離相中可能有不同的抑制性化學成分，能抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，但不同部位抑制物的抑制程度不盡相同。因此，有必要深入研究，以確定種子中內源抑制物質的結構、種類及其含量。

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基金項目：內蒙古自治區(qū)直屬高?；究蒲袠I(yè)務費項目（GXKY22140）；內蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目（S20231202Z）；內蒙古民族大學中藥學（蒙藥學）重點學科建設項目（ZYX004）

第一作者簡介：楊靈珍（1997-），女，碩士研究生。研究方向為蒙藥資源鑒定與可持續(xù)利用。

*通信作者：紅艷（1979-），女，博士研究生，副教授。研究方向為蒙藥資源鑒定與可持續(xù)利用。