來自林下凋落物的麥角菌科真菌的生物活性

關(guān)鍵詞抗菌活性；麥角菌科；溶磷活性；林下凋落物；抗蟲活性

麥角菌科Clavicipitaceae物種多樣性豐富，其中麥角菌屬包含了許多重要的病原菌，其寄主多為禾本科植物，引起麥角病。作為生防菌的麥角菌科真菌以綠僵菌報道最多。綠僵菌屬自建立以來發(fā)現(xiàn)了很多的新種，由于標準不統(tǒng)一，其分類較為混亂，直到2020年，Mon-gkolsamrit等通過形態(tài)學及多基因系統(tǒng)發(fā)生學研究，對綠僵菌及相近菌屬進行了重新分類，將綠僵菌變?yōu)橐粋€單系群，解決了綠僵菌分類混亂的問題。綠僵菌屬真菌可以寄生昆蟲，植物內(nèi)生，腐生等多種營養(yǎng)方式存在，可以適應多種生態(tài)環(huán)境。多種綠僵菌屬真菌被報道具有抗菌活性。金龜子綠僵菌M．a(chǎn)nisopliae可以抑制小麥紋枯病菌Rhizoctoniacereali.s、大麗輪枝菌Verticilliurn dahliae、藤倉鐮孢Fusariurn fujikuroi、青枯雷爾氏菌和水稻白葉枯病菌。黃綠綠僵菌可以抑制油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorurn、立枯絲核菌Rhizoctonza solani、水稻稻瘟病菌Pyric-uLaria oryzae和玉米小斑病菌的菌絲生長。綠僵菌也具有溶磷活性，可以促進豆類和玉米對磷元素的吸收，增強植物免疫力，促進植株生長。綠僵菌作為昆蟲病原真菌能夠侵染小菜蛾、椰心葉甲Brontispa longis-slma、褐飛虱等直翅目、鱗翅目、半翅目、鞘翅目Coleoptera等多個目的昆蟲。目前對以上綠僵菌的生防活性的報道較多，但作為其相近菌屬異普克尼亞霉屬Metapochonia和馬昆德菌屬Mar-qua-ndornyce.s等其他麥角菌科菌屬的生防活性的研究較少。

本研究以從林下凋落物中分離的4株麥角菌科真菌為研究對象，對其進行形態(tài)學和分子鑒定并測試其抗菌、殺蟲與溶磷活性。

1材料與方法

1.1材料

供試生物：供試昆蟲為綠豆象；供試病原菌為青枯雷爾氏菌，水稻黃單胞菌稻致病變種、立枯絲核菌R．solani，互隔交鏈格孢；供試4株麥角菌科真菌分別為SGSF002，SGSF501， SGSF515， SGSF931。

供試培養(yǎng)基：1/4馬鈴薯葡萄糖（1/4 potato dex-trose agar，1/4 PDA）培養(yǎng)基、麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（malt extract agar，MEA）、燕麥培養(yǎng)基（oatmeal agar，OA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、酵母麥芽瓊脂培養(yǎng)基（yeast malt agar，YMA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato

dextrose broth，PDB）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基加10%煙酰胺（PDB+Nic）、超級麥芽培養(yǎng)基（super malt，SM）、大米培養(yǎng)基（rice）、酵母提取物蔗糖十蛭石培養(yǎng)基（yeast extractsucrose and vermiculite，YES+ vermiculite）?；钚院Y選使用的培養(yǎng)有細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（luria-bertani agar，LB）、改良解磷培養(yǎng)基（NBRIP+）（葡萄糖25 9、磷酸鈣2g、七水硫酸鎂0.4g、六水氯化鎂4g、氯化鉀1.3g、硫酸銨1g、瓊脂20g、水1L）。均為實驗室配制。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定

活化菌株SGSF002，SGSF501，SGSF515，SGSF931，分別接菌餅于MEA，OA，PDA，YMA培養(yǎng)基中央，在25℃條件下培養(yǎng)14d，觀察4株真菌的形態(tài)特征，并使用顯微鏡觀察它們的孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等分類學特征。利用CTAB法提取真菌總DNA，對其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、18S核糖體小亞基（18S small subunit ribosomal RNA， SSU）、28S核糖體大亞基（large subunit ribosomal RNA，LSU）、翻譯延伸因子1-a（translation elongation factor l alpha，TEF）和RNA聚合酶Ⅱ亞基1（RNA

polymeraseⅡlargest subunit，RPB1）的部分序列進行擴增測序，引物信息見表1。利用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST工具進行比對。

1.2.2.2抗細菌活性測試

抗細菌活性測試采用雙層平板藥劑擴散法。提前12h活化青枯雷爾氏菌和水稻黃單胞菌，待250ml滅菌LB培養(yǎng)基溫度降至50℃左右時，加入10mL已活化的供試細菌，搖勻后倒人WA培養(yǎng)基平板上（直徑為9cm），待凝固后在培養(yǎng)基上層均勻地打6個直徑為6mm的孔，分別加入6種培養(yǎng)基發(fā)酵物的提取物待測溶液，在25℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察有無抑菌圈產(chǎn)生并測量記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.3抗真菌活性測試

抗真菌活性測試使用平板藥劑擴散法。準備直徑為9cm的PDA平板，利用打孔器均勻地打6個6mm的孔，分別加入6種培養(yǎng)基發(fā)酵物提取物待測溶液，最后在PDA培養(yǎng)基中央接種1個待測病原菌的菌餅，封口后于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察病原菌長勢。

1.2.3抗蟲活性測試

抗蟲活性測試采用孢子懸浮液浸蟲法。接種6mm的菌餅至PDA平板（直徑為9cm）中間，培養(yǎng)15d后，在平板中加入5mL的0.05%吐溫-80溶液，靜置1min后，用棉簽使孢子懸浮在0.05%吐溫-80溶液中，將其倒入50mL離心管，充分振蕩后，用無菌紗布過濾多余菌絲，利用細胞計數(shù)板將其濃度調(diào)整為1×107個/ml。。將綠豆象成蟲分別在4株菌的孢子懸浮液中浸泡5s，然后轉(zhuǎn)入裝有足量綠豆的錐形瓶中，3組重復，每組處理20頭綠豆象。每天記錄綠豆象的死亡數(shù)量，綠豆象死亡后將其轉(zhuǎn)移至裝有濕潤滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每天觀察有無僵蟲產(chǎn)生。

1.2.4溶磷活性測試

采用溶磷圈法進行溶磷活性初篩。分別將麥角菌科4株真菌的6mm菌餅接種于改良解磷培養(yǎng)基中央。在25℃培養(yǎng)14d。觀察是否有溶磷圈出現(xiàn)，并采用十字交叉法測量溶磷圈（透明圈）的直徑。

采用鉬銻抗比色法繪制磷標準曲線和測定4株麥角菌科菌株發(fā)酵液的有效磷含量。使用磷酸二氫鉀配置磷標準溶液，在50mL的容量瓶中分別加入0、2、4、6、8、10mL的5mg/L的磷標準溶液后加水至30mL，依次加入2滴2，4-二硝基酚指示劑，4mol/L NaOH至溶液呈黃色后，緩慢加入1mol/LH2S04至溶液中黃色剛好褪去，加入5mL鉬銻抗顯色劑后定容至50mL，在室溫下顯色2h，利用分光光度計在700nm下測其吸光度。以磷含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制磷標準曲線。

采用兩種液體培養(yǎng)基測試4株菌的有效磷含量，其中一種磷源為含磷酸鈣的NBRIP+液體培養(yǎng)基，另一種為以磷酸鋅替代磷酸鈣的NBRIP+液體培養(yǎng)基，分別接種菌株后于25℃，180r/min條件下振蕩7d，1000r/min離心5min，取上清液稀釋20倍后取5mL于50mL的容量瓶中并加水至30mL，加入2滴2，4-二硝基酚指示劑，加入1mol/lH2SOi至溶液中黃色剛好褪去，加入5mL鉬銻抗顯色劑后定容至刻度，在室溫下顯色2h，利用分光光度計在700nm下測其吸光度，根據(jù)磷標準曲線計算4株菌的有效磷含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理利用Excel 2016和SPSS 25.0進行分析，計算平均值，采用單因素方差分析法進行差異顯著性分析，利用幾率值法計算致死中時。

2結(jié)果與分析

2.1真菌鑒定

2.1.1形態(tài)學鑒定

SGSF002菌株菌落正面呈白色，褶皺不明顯，無色素產(chǎn)生，菌絲絨毛狀，菌落背面為淺黃色，有褶皺，邊緣整齊，分生孢子梗有分支，瓶梗3～4個呈輪狀分布，分生孢子為卵圓形至圓柱形，大小為（4.0～5. 6）um×（1. 6～2. 4）um（圖1a）。根據(jù)形態(tài)特征將其初步鑒定為球芽異普克尼亞霉MetapochoniabuLbillosa。

SGSF501菌株菌落正面呈白色，有褶皺但不多，無色素產(chǎn)生，菌絲絨毛狀，菌落背面中心至邊緣為灰色至棕色，有褶皺，邊緣整齊，分生孢子梗有分支，瓶梗較長，3～4個輪狀分布，分生孢子卵圓形，大小為（3.9～4.9）um×（1.5～2.5）um（圖1b）。根據(jù)形態(tài)特征將其初步鑒定為球芽異普克尼亞霉。

SGSF515菌株菌落呈灰白色，邊緣不整齊，具有明顯褶皺，菌絲呈絨毛狀，菌落背面中心至邊緣為橙黃色至紫色，有褶皺，邊緣放射狀（圖1c），產(chǎn)孢細胞為瓶梗狀，2～4個呈輪狀分布，分生孢子不規(guī)則近球形至卵圓形，大小為（2. 9～4.0）um×（1.9～2.5）um。根據(jù)形態(tài)特征將其初步鑒定為薩克拉異普克尼亞霉。

SGSF931菌株菌落呈紫色，有較多褶皺，菌絲絨毛狀，產(chǎn)生的黃色色素幾乎布滿整個培養(yǎng)基，菌落背面為黃色，褶皺多，邊緣整齊（圖1d），分生孢子梗有多級分支，次級分支呈瓶梗狀，3～5個瓶梗，瓶?；颗虼箜敹擞衅款i，分生孢子卵圓形，大小為（2.8～3.8）um×（2.0～3.1）um。根據(jù)形態(tài)特征將其初步鑒定為馬氏馬昆德霉。

2.1.2分子生物學鑒定

對4株真菌的ITS序列測序比對，與SGSF002，SGSF501，SGSF515，SGSF931最相似的菌種分別為球芽異普克尼亞霉、球芽異普克尼亞霉、薩克拉異普克尼亞霉與馬氏馬昆德霉，ITS序列的相似性均為100.00%（表2）。雖然SGSF002和SGSF501的最接近菌種都是球芽異普克尼亞霉，但其最相近菌種的登錄號不同，兩者的ITS序列比對，在496 bp的序列中有2個堿基不同，SGSF002和SGSF501是球芽異普克尼亞霉的不同菌株。與模式菌株比較，SGSF002、SGSF501與模式菌株M．bulbiZLosa CBS145.70（登錄號為NR_154142）的ITS相似性為99.82%; SGSF515與模式菌株（登錄號為NR_154139）的ITS序列相似性也為99. 82%。SGSF931與模式菌株的ITS序列相似性低于90%，但與SGSF931的ITS序列最相近的6個菌株均為且相似性高達99.80%至100.00%。為了進一步確認SGSF931與模式菌株關(guān)系，將其/SU序列和SSU序列與模式菌株（登錄號為NG_057770與NG_062659）分別進行比對，相似性為99.06%與99.90%，再結(jié)合SGSF931形態(tài)學特點將其確定為Ma.marquandii。

進一步測序4株菌的LSU、TEF、RPB1序列，比對結(jié)果仍然顯示SGSF002，SGSF501，SGSF515．SGSF931最相似的菌種分別為球芽異普克尼亞霉、球芽異普克尼亞霉、薩克拉異普克尼亞霉與馬氏馬昆德霉（表3），其相似性為98.56%～100.00%。進一步確定了4株菌的分類地位。

2.2抗菌活性分析

2.2.1抗細菌活性分析

4株真菌中只有球芽異普克尼亞霉SGSF002對病原菌水稻黃單胞菌稻致病變種和青枯雷爾氏菌均無抑制活性；馬氏馬昆德霉SGSF931的大米和YES+蛭石2種培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對2種病原菌的抑制活性較好，抑菌圈直徑達到6mm以上（表4）。

2.2.2抗真菌活性分析

4株真菌對立枯絲核菌和互隔交鏈格孢都有抗菌活性，其中球芽異普克尼亞霉SGSF002的大米和YES+蛭石2種培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對2種病原菌的抑制活性較好；薩克拉異普克尼亞霉SGSF515對立枯絲核菌的抑菌效果較好，有4種培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對立枯絲核菌有抑制效果（表5）。

2.3抗蟲活性分析

4株麥角菌科真菌都表現(xiàn)了一定的殺蟲活性（表6），可以形成僵蟲（圖2），其中SGSF002的殺蟲活性最強，致死中時為3.48d，在處理綠豆象的第7天累計校正死亡率就已達到100%。馬氏馬昆德霉SGSF931相較另外3株菌侵染綠豆象的活性不高，致死中時間為9.84d。

2.4溶磷活性分析

2.4.1溶磷效果初篩

利用溶磷圈法進行溶磷效果初篩，在改良解磷培養(yǎng)基（NBRIP+）中4株真菌的溶磷圈清晰可見，溶磷圈大小如圖3和表7所示，其中SGSF501的溶磷圈直徑（D）、菌落直徑（d）皆最大，SGSF002的溶磷圈直徑與菌落直徑的比值D/d）最大。

2.4.2有效含磷量

利用鉬銻抗比色法得到磷標準曲線為Y=0.5363x+0.0269（R2=0.99）。對4株菌的發(fā)酵液測定吸光度后，利用溶磷標準曲線計算出有效磷含量如表8所示，4株菌對磷酸鈣的溶磷活性明顯比磷酸鋅好；球芽異普克尼亞霉SGSF501對磷酸鈣溶磷活性最好，發(fā)酵液中有效磷含量達到170.71mg/l；馬氏馬昆德霉SGSF931對磷酸鋅溶磷活性最好，發(fā)酵液中有效磷含量達到79.97mg/L。

3結(jié)論與討論

抗菌活性方面：已有報道表明，球芽異普克尼亞霉具有抑制病原菌的活性，例如其具有抗松根異擔孔菌Heterobasidion annosum，以及兩種分枝桿菌Mycobaterium abscessus與M．marznum的活性。本研究進一步擴大了球芽異普克尼亞霉的抗菌譜，其中球芽異普克尼亞霉SGSF501展示了較好的抗細菌青枯雷爾氏菌和水稻黃單胞菌的活性，而球芽異普克尼亞霉SGSF002展示了較好的抗立枯絲核菌與互隔交鏈格孢的活性，同時也說明即使同一物種的不同菌株其活性也存在差異。薩克拉異普克尼亞霉SGSF515也展示了對4株測試植物病原菌的活性。馬氏馬昆德霉對白色念珠菌Candidaalbicans具有抗菌活性，本研究發(fā)現(xiàn)馬氏馬昆德霉對4株供試植物病原菌均具有抗菌活性。

殺蟲活性方面：球芽異普克尼亞霉和薩克拉異普克尼亞霉具有殺線蟲活性，球芽異普克尼亞霉對鱗翅目害蟲及云杉八齒小蠹Ips typographus具有殺蟲活性，球芽異普克尼亞霉分離出的化合物對斜紋夜蛾Spodoptera litura有活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)球芽異普克尼亞霉對綠豆象的殺蟲活性較強，特別是SGSF002處理后，第7天的致死率就高達100%。薩克拉異普克尼亞霉可以殺死大蠟螟。本研究首次發(fā)現(xiàn)薩克拉異普克尼亞霉SGSF515處理綠豆象后致死率達到75.01%。高思禹等發(fā)現(xiàn)馬氏馬昆德霉SGSF043具有殺綠豆象的活性，該研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，SGSF931比之殺蟲活性略強。

溶磷活性方面：球芽異普克尼亞霉可以作為植物內(nèi)生菌存在，還可以促進植物生長，但機制尚不明確。本研究通過溶磷圈法和鉬銻抗比色法測定其發(fā)酵液中有效磷含量，發(fā)現(xiàn)球芽異普克尼亞霉SGSF002與SGSF501和薩克拉異普克尼亞霉SGSF515具有溶磷活性。馬氏馬昆德霉也具有溶磷活性，本研究中SGSF931的結(jié)果與其相符。

本研究對林下凋落物中分離的麥角菌科真菌進行了鑒定與活性測試，發(fā)現(xiàn)了4株具有抗菌、殺蟲及溶磷活性的麥角菌科真菌。本研究首次報道了球芽異普克尼亞霉和薩克拉異普克尼亞霉對綠豆象具有較好的殺蟲活性。上述研究結(jié)果為進一步開發(fā)利用麥角菌科真菌及破解其相關(guān)機制提供了備選菌株。