益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫、代謝能力和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

摘 要：為研究益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)工廠化養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫、代謝能力和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，將初始體質(zhì)量（2.0±0.2）g的2 250尾凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行250尾，其中對(duì)照組無添加，試驗(yàn)組1添加多肽+氨基酸+枯草芽孢桿菌代謝物，試驗(yàn)組2添加大蒜提取物+肉桂提取物+菊苣提取物+枯草芽孢桿菌，添加量為3 g/kg基礎(chǔ)飼料。30 d養(yǎng)殖周期結(jié)束后，通過分析對(duì)蝦的生長(zhǎng)指標(biāo)、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分、血清非特異性免疫酶和代謝酶活性以及腸道組織結(jié)構(gòu)的變化以分析復(fù)方制劑的應(yīng)用效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示：兩組復(fù)方制劑均可提高對(duì)蝦的體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率和體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率（P＜0.05），且試驗(yàn)組2效果更好；試驗(yàn)組1對(duì)蝦肌肉粗脂肪和呈味氨基酸含量較對(duì)照組顯著提高（P＜ 0.05）；試驗(yàn)組對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LSZ）、一氧化氮合成酶（NOS）的活性較對(duì)照組均有所增強(qiáng)，其中試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），但谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）活性較對(duì)照組有所降低；試驗(yàn)組對(duì)蝦血清中谷氨酰胺合成酶（GS）活性較對(duì)照組有所升高，其中試驗(yàn)組1與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；試驗(yàn)組對(duì)蝦的蘋果酸脫氫酶（MDH）、己糖激酶（HK）活性與對(duì)照組差異不顯著（Pgt;0.05）；腸道組織H.E染色結(jié)果顯示，兩組復(fù)方制劑均可改善對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)，降低絨毛層脫落現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，在工廠化養(yǎng)殖基礎(chǔ)飼料中添加3 g/kg復(fù)方制劑2（大蒜提取物+肉桂提取物+菊苣提取物+枯草芽孢桿菌）可顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)，提高其非特異性免疫和代謝能力，優(yōu)化腸道組織結(jié)構(gòu)，綜合提高對(duì)蝦免疫水平。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；中草藥；益生菌；非特異性免疫；營(yíng)養(yǎng)代謝；腸道組織

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對(duì)蝦、白腳蝦，隸屬于對(duì)蝦科、濱對(duì)蝦屬，因具有生長(zhǎng)快、耐受性強(qiáng)、適應(yīng)高密度集約化養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，已在全世界規(guī)?；B(yǎng)殖 ^［1］。中國是世界上最重要的對(duì)蝦生產(chǎn)國，對(duì)蝦養(yǎng)殖不僅在沿海地區(qū)，還擴(kuò)展到內(nèi)陸地區(qū) ^［2］。然而，隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的瓶頸 ^［3］。為了解決病害問題，降低產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，提高對(duì)蝦的健康狀況，生產(chǎn)中會(huì)采用抗生素或化學(xué)藥品來進(jìn)行病害防治，但大量使用這些藥物會(huì)增加病原菌的抗藥性，對(duì)人類健康與環(huán)境安全造成潛在的影響。因此，積極尋求抗生素替代品，研發(fā)綠色環(huán)保、高效無殘留、安全無毒的新型飼料添加劑，已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。

目前，已開發(fā)應(yīng)用的抗生素替代品主要有益生菌（素）、益生元（寡糖類）、合生元（代謝物類）、酶制劑、有機(jī)酸、有機(jī)微量元素和中草藥及其提取物等 ^［4］。其中，中草藥或其提取物作為一種新型的飼料添加劑，因具有天然植物性、高效多樣化、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛認(rèn)可 ^［5］。它們不僅能有效防治養(yǎng)殖過程中水產(chǎn)動(dòng)物的各種病害，減少抗生素或化學(xué)藥物的使用，又可以提高水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體自身的消化酶活性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，從而提高其生長(zhǎng)性能 ^［6-9］。目前，中草藥應(yīng)用于對(duì)蝦類的研究多集中在某一種中草藥或多種中草藥并用的效果評(píng)價(jià)上，對(duì)中草藥提取物和益生菌的復(fù)合應(yīng)用報(bào)道較少。

益生菌作為另一種被廣泛認(rèn)可的飼料添加劑，不僅可以在動(dòng)物消化道內(nèi)通過競(jìng)爭(zhēng)排斥病原微生物，減少其致病幾率，而且可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高宿主的免疫能力和抗病力 ^［10-13］。探索以益生菌和中草藥提取物為代表的功能性飼料添加劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、免疫和代謝能力、腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，可為養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素替代品的研發(fā)提供參考。本試驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，跟蹤中草藥和益生菌復(fù)方制劑在其養(yǎng)殖過程中的效果，從生長(zhǎng)性能、免疫和代謝能力、腸道組織結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，為中草藥和益生菌在對(duì)蝦健康養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及管理

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦來自山東濱州某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)（3.0±0.2）cm，體質(zhì)量（2.0±0.2）g，健康、規(guī)格整齊。將蝦隨機(jī)放入養(yǎng)殖桶（直徑1.5 m，養(yǎng)殖水體約300 L）內(nèi)暫養(yǎng)，250尾/桶。

養(yǎng)殖水源為地下水，曝氣消毒后，經(jīng)調(diào)溫直接注入養(yǎng)殖桶（直徑1.5 m）內(nèi)。試驗(yàn)期間水溫為（26±1）℃，pH在7.2～7.8，24 h持續(xù)充氣，溶解氧為5.5～6.5 mg/L，氨氮＜0.2 mg/L。每天上午固定時(shí)間9：00換水，日換水量為全部水體積的20%。基礎(chǔ)飼料為青島賽格林生物工程有限公司的凡納濱對(duì)蝦常規(guī)飼料，營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

試驗(yàn)用復(fù)方制劑1的主成分包括多肽+氨基酸+枯草芽孢桿菌代謝物，復(fù)方制劑2的主成分包括大蒜提取物+肉桂提取物+菊苣提取物+枯草芽孢桿菌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3組，分別為對(duì)照組（基礎(chǔ)飼料）、試驗(yàn)組1（基礎(chǔ)飼料添加復(fù)方制劑1）和試驗(yàn)組2（基礎(chǔ)飼料添加復(fù)方制劑2），每組3個(gè)平行，每個(gè)平行250尾，共計(jì)2 250尾凡納濱對(duì)蝦。復(fù)方制劑添加量為3 g/kg基礎(chǔ)飼料。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，每天投喂3次（6：00、12：00、18：00），日投飼量為對(duì)蝦體質(zhì)量的6%，以投喂后2 h內(nèi)吃完為佳（根據(jù)蝦的情況隨時(shí)調(diào)整）。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為 30 d。

1.3 樣品采集

30 d的投喂試驗(yàn)結(jié)束后，停食1 d，每個(gè)平行組中隨機(jī)抽取20尾對(duì)蝦，在冰上無菌條件下獲取其腸道、肌肉。腸道用無菌生理鹽水沖洗3次，棄內(nèi)容物后置于波恩氏液中固定，用于H.E組織切片分析。去殼肌肉置于無菌離心管中，于-20 ℃下保存，用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析。用1.0 mL一次性無菌注射器從對(duì)蝦心臟處吸取0.2 mL血液，每個(gè)平行組取6尾蝦血混合成一個(gè)樣品，混合均勻后立即于4 ℃下5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，于-80 ℃下保存上清液，用于酶活性分析。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

30 d的投喂試驗(yàn)結(jié)束后，停食1 d，對(duì)每個(gè)平行組對(duì)蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱量其終末體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率和體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率（specific growth rate，SGR），公式如下。

R WG=100×（Wt-W0）/W0（1）

R SG=100×（lnWt-lnW0）/t（2）

式（1）～（2）中，R WG為體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率（%），W0、Wt分別為試驗(yàn)對(duì)蝦的初始體質(zhì)量（g）和終末體質(zhì)量（g），R SG為體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率（ %·d ^-1），t為試驗(yàn)天數(shù)（d）。

1.4.2 營(yíng)養(yǎng)成分

采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016）測(cè)定對(duì)蝦肌肉中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用氯仿-甲醇抽提法（GB 5009.6—2016）測(cè)定粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)。用氨基酸自動(dòng)分析儀（GB 5009.124—2016）測(cè)定呈味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.3 營(yíng)養(yǎng)代謝酶活性

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、己糖激酶（hexokinase，HK）活性檢測(cè)按照南京建成生物工程研究所的試劑盒操作說明完成。

1.4.4 非特異性免疫酶活性

總抗氧化能力（total antioxidant capacity， T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、溶菌酶（lysozyme，LSZ）活性檢測(cè)均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒操作說明完成。

1.4.5 腸道組織結(jié)構(gòu)

腸道組織經(jīng)波恩氏液固定，石蠟包埋、切片，切片厚度為4～5 μm，之后用蘇木精-伊紅染色，于Olympus顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way "ANOVA）和Duncan’s法比較，設(shè)P＜0.05為差異 顯著。

2 結(jié)果

2.1 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響

益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響情況見表2。投喂試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)組對(duì)蝦的終末體質(zhì)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組1、2的體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率分別達(dá) 120.88%、122.40%，均顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。試驗(yàn)組對(duì)蝦的體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)成分的影響見表3。對(duì)照組和試驗(yàn)組之間的粗蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）。在粗脂肪含量方面，試驗(yàn)組1顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。呈味氨基酸含量也同樣，試驗(yàn)組1顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05），試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。水分含量方面，兩個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞ 0.05），而均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 "益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響

益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響見表4。試驗(yàn)組血清中抗氧化相關(guān)酶SOD、T-AOC、CAT、NOS的活性較對(duì)照組均有所增強(qiáng)，其中試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組的GSH-Px活性較對(duì)照組有所降低，其中試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異顯著（P＜ 0.05）。試驗(yàn)組的AKP、ACP活性均比對(duì)照組有所降低，試驗(yàn)組1的ACP與對(duì)照組間差異顯著（ P＜0.05），試驗(yàn)組2的AKP與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組的LSZ活性較對(duì)照組有所增強(qiáng)，試驗(yàn)組2與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦代謝酶活性的影響

益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦代謝酶活性的影響見表5。試驗(yàn)組對(duì)蝦血清中GS的活性與對(duì)照組相比有所升高，其中試驗(yàn)組1與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組MDH、HK的活性與對(duì)照組均無顯著性差異（Pgt;0.05）。

2.4 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的影響見圖1。對(duì)照組對(duì)蝦的腸道組織絨毛層有脫落現(xiàn)象，環(huán)肌層較厚，結(jié)締組織中細(xì)胞散列不緊密，見圖1-（a）中箭頭所示位置。試驗(yàn)組1可見整齊的絨毛層，絨毛層、環(huán)肌層、結(jié)締層清晰有分隔，見圖1-（b）中箭頭所示位置。試驗(yàn)組2的絨毛層也有脫落現(xiàn)象，但與對(duì)照組相比程度較輕，其結(jié)締組織中細(xì)胞排列緊密，見圖1-（c）中箭頭所示位置。

3 討論

3.1 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)成分的影響

益生菌或中草藥均可單獨(dú)作為飼料添加劑使用，發(fā)揮積極的促生長(zhǎng)作用。符云等 ^［14］報(bào)道，復(fù)方中草藥制劑（杜仲15％、黃芪20％、甘草15％、陳皮5％、金銀花15％、黃連5％、魚腥草10％和白術(shù)10％等）可顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)，提高其機(jī)體免疫能力，以1.0 g/kg添加量為宜。黃忠等 ^［15］進(jìn)一步分析了中草藥制劑（以黃芪、板藍(lán)根、藿香、大青葉等為主要成分）投喂策略產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，連續(xù)3周投喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的中草藥飼料，或者第1周投喂0.4%的中草藥飼料，第2周和第3周投喂對(duì)照飼料，這兩種策略均可使凡納濱對(duì)蝦獲得較好的生長(zhǎng)性能和免疫機(jī)能。陳輝輝等 ^［16］研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%和1.2%的復(fù)方中草藥可顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和消化能力，并可顯著提高對(duì)蝦抗白斑綜合征（white spot syndrome virus，WSSV）的能力。Chien等 ^［17］通過核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic "resonance，1H NMR）代謝分析發(fā)現(xiàn)，益生菌組對(duì)蝦的肝胰腺代謝物中，肌酸酐和谷氨酰胺含量明顯增加；轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌E20顯著增強(qiáng)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)。Duan等 ^［18］研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）可明顯改善凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，增加腸道短鏈脂肪酸SCFA和肌肉粗蛋白含量，調(diào)節(jié)腸道消化能力，增強(qiáng)腸道對(duì)氨脅迫的免疫功能。

一般認(rèn)為，益生菌和中草藥之間具有一定的協(xié)同作用，中草藥具有多糖、酚類、甾醇、皂苷等多種有效成分，益生菌發(fā)酵可促進(jìn)中草藥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被吸收、利用，中草藥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)亦可促進(jìn)益生菌的繁殖、代謝 ^［19］。另外，益生菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的復(fù)合酶能夠彌補(bǔ)動(dòng)物機(jī)體胃腸道內(nèi)源酶的不足，通過促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，提高中草藥有效成分的利用率，進(jìn)而提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能 ^［20］。Fan等 ^［21］研究表明，黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）、茯苓多糖（tuckahoe polysaccharide，TPS）和枯草芽孢桿菌可顯著提高刺參（Stichopus japonicus）的特定生長(zhǎng)率，且其溶菌酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶活性和補(bǔ)體3含量顯著增加。Alagawany等 ^［22］研究發(fā)現(xiàn)，在尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）幼魚的膳食中添加大蒜和蘆薈（Aloe vera）的混合物，試驗(yàn)組魚的生長(zhǎng)得到改善，且飼料利用率也明顯提升，推測(cè)這些有益作用歸因于大蒜素。本研究復(fù)方制劑中的菊苣包括菊粉（synanthrin）、糊精和淀粉等多糖，還含有菊苣酸（chicoric acid）、綠原酸等酚酸類化合物，未發(fā)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生任何負(fù)面影響 ^［23］。肉桂在人或畜牧上則常被用來刺激進(jìn)食、健胃強(qiáng)脾。 El-hamid等 ^［24］用肉桂醛納米微乳飼喂尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus），發(fā)現(xiàn)飼料轉(zhuǎn)化率升高，魚的生長(zhǎng)速率和蛋白質(zhì)效率顯著提升。本試驗(yàn)在基礎(chǔ)飼料中直接添加多肽、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有提供能量速度快、消化吸收利用率高、促進(jìn)新陳代謝等優(yōu)點(diǎn) ^［25-26］，益生菌代謝產(chǎn)物中含有高濃度的短鏈脂肪酸等物質(zhì)，更利于動(dòng)物生長(zhǎng)過程中對(duì)飼料的有效利用。大蒜含有多種氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分及多酚類和多糖類等功效型化合物，菊苣和肉桂則發(fā)揮了營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)作用。中草藥和益生菌的協(xié)同機(jī)制呈現(xiàn)出較強(qiáng)的促生長(zhǎng)效果，推測(cè)原因是復(fù)方中草藥含有維生素、氨基酸、多糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些潛在的誘食因子，在增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物食欲的同時(shí)促進(jìn)機(jī)體代謝，而且益生菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶類，增強(qiáng)了對(duì)蝦體內(nèi)消化酶的活性，從而促進(jìn)飼料的降解、吸收、利用，最終提升促生長(zhǎng)效果 ^［27-28］。此外，芽孢桿菌還可通過分泌活性抑菌物質(zhì)影響腸道組織發(fā)育和調(diào)節(jié)腸道菌群組成，在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的同時(shí)促進(jìn)生長(zhǎng)性能，這與已發(fā)表的研究結(jié)果相 一致 ^［29-30］。

本研究中，試驗(yàn)組1凡納濱對(duì)蝦的粗脂肪和呈味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照組相比差異顯著，而試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異不顯著，可能是因?yàn)槎嚯摹被岬葼I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可在短時(shí)間內(nèi)直接影響對(duì)蝦的機(jī)體成分，而中草藥中的營(yíng)養(yǎng)成分則需要更長(zhǎng)時(shí)間才能發(fā)揮作用。Yu等 ^［31］的研究同樣發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌和中草藥未對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分產(chǎn)生顯著影響，這可能與試驗(yàn)周期及養(yǎng)殖環(huán)境不同存在一定聯(lián)系，需進(jìn)一步探討。

3.2 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫能力的影響

益生菌和中草藥均被認(rèn)為是潛在的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用。文國樑等 ^［32］研究表明，0.2%中草藥和0.3%芽孢桿菌能夠?qū)Ψ布{濱對(duì)蝦的免疫指標(biāo)產(chǎn)生積極影響，而且表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。彭張明等 ^［20］發(fā)現(xiàn)，在育苗過程中添加一定比例的中草藥（芪參散）和草分枝桿菌，試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦蝦苗的標(biāo)粗成活率、生長(zhǎng)速度、養(yǎng)成效果均高于無任何添加的對(duì)照組。王苓等 ^［33］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1×109 CFU/kg蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，可提高凡納濱對(duì)蝦血清非特異性指標(biāo)SOD、AKP、ACP、LSZ、T-NOS、 iNOS活性和血清蛋白質(zhì)量濃度。

對(duì)于沒有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的甲殼動(dòng)物對(duì)蝦來說，非特異性免疫功能尤為重要 ^［34］。T-AOC可以防止活性氧（ROS）的有害影響，反映了生物體細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御狀態(tài) ^［35］。SOD可以催化高活性O(shè)2-分解為O2和低活性H2O2 ^［36］。CAT可促使H2O2分解為H2O和O2，清除過度的自由基，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持動(dòng)物機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡 ^［37］。GSH-Px可以將有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，從而保護(hù)動(dòng)物機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的損害 ^［10］。AKP和ACP是重要的磷酸酶，參與機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)化和磷酸酶代謝 ^［38］。對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)正常運(yùn)行過程中，機(jī)體內(nèi)的一氧化氮合成酶激活后，免疫物質(zhì)誘導(dǎo)釋放出大量的NO，其后參與免疫反應(yīng)，提高機(jī)體抗病力 ^［39］。溶菌酶作為重要的非特異性免疫因子之一，主要存在于血清中，具有殺滅革蘭氏陽性菌的作用 ^［40］。血清非特異性免疫指標(biāo)代表對(duì)蝦機(jī)體在某一時(shí)期特定條件下所處的免疫狀態(tài)，對(duì)蝦機(jī)體較快適應(yīng)外源添加，其免疫狀態(tài)表現(xiàn)為正常水平，而顯著的波動(dòng)性變化可能會(huì)出現(xiàn)在機(jī)體不適應(yīng)的應(yīng)激情況下。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1凡納濱對(duì)蝦血清非特異性免疫指標(biāo)除ACP和NOS外，均與對(duì)照組無顯著性差異，這可能與養(yǎng)殖環(huán)境和對(duì)蝦機(jī)體生理狀態(tài)有關(guān)，需要更長(zhǎng)的攝入時(shí)間才會(huì)出現(xiàn)增強(qiáng)或降低的效果，同時(shí)也說明試驗(yàn)對(duì)蝦的養(yǎng)殖環(huán)境中應(yīng)激因子極少，整個(gè)試驗(yàn)環(huán)境處于一個(gè)穩(wěn)定的水平。試驗(yàn)組2對(duì)蝦的非特異性免疫指標(biāo)除ACP外，均與對(duì)照組差異顯著，推測(cè)原因是中草藥中的復(fù)雜功效成分協(xié)同益生菌發(fā)酵產(chǎn)生了更強(qiáng)的效果。另外，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)食高脂肪含量的飼料時(shí)，AKP活性會(huì)升高，試驗(yàn)組2對(duì)蝦血清AKP和ACP活性有所降低，說明該組飼料脂肪含量 正常。

3.3 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦代謝能力的影響

益生菌或中草藥的促生長(zhǎng)、調(diào)免疫機(jī)理包含多個(gè)方面，其中分泌多種酶類促進(jìn)代謝是一個(gè)非常重要的方面 ^［41-42］。谷氨酰胺合成酶（GS）主要參與蛋白質(zhì)合成和氮的代謝，在動(dòng)物肌肉、肝臟、腸道等組織中作用活躍，產(chǎn)生的谷氨酰胺為后續(xù)含氮化合物的生物合成提供基礎(chǔ) ^［43］。己糖激酶（HK）是參與葡萄糖代謝的第一個(gè)酶，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為己糖，作為生物體的能量來源，其活性受二磷酸腺苷（ADP）和葡萄糖-6-磷酸的限制 ^［44］。蘋果酸脫氫酶（MDH）屬于糖酵解酶，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，可以促進(jìn)糖分代謝，在一定程度上能起到促消化、抗氧化作用，而且MDH可刺激體內(nèi)免疫類蛋白的合成，間接提高機(jī)體免疫力。當(dāng)機(jī)體狀態(tài)不佳或有炎癥等情況存在時(shí)，MDH活性升高 ^［45］。廖栩崢等 ^［25］發(fā)現(xiàn)，普遍存在于動(dòng)植物、細(xì)菌體內(nèi)的小分子多肽具有合成成本低、提供能量速度快、消化吸收利用率高、能促進(jìn)新陳代謝等一系列優(yōu)點(diǎn)，可直接參與蛋白質(zhì)合成，比氨基酸更快速地影響蛋白質(zhì)的代謝。Fan等 ^［43］研究表明，日糧中補(bǔ)充地衣芽孢桿菌可顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，提高消化酶、抗氧化酶和代謝酶活性，增強(qiáng)其抗亞硝酸鹽脅迫的非特異性免疫能力。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組1凡納濱對(duì)蝦的GS活性較高，可能是因?yàn)閺?fù)方制劑1中含有易消化吸收的多肽、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，再加上枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中的肽類、糖類、氨基酸等物質(zhì)，在底物供給方面促進(jìn)了蛋白質(zhì)代謝。兩個(gè)試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的MDH活性與對(duì)照組比較無顯著差異，HK活性與對(duì)照組基本持平，說明復(fù)方制劑未對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦及養(yǎng)殖環(huán)境帶來供氧不足等負(fù)向影響，隨著養(yǎng)殖周期延長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)代謝功能的顯著提高。

3.4 益生菌和中草藥復(fù)方制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)于對(duì)蝦而言，腸道是抵御外源侵害和環(huán)境脅迫、保護(hù)健康的第一道防線，其結(jié)構(gòu)完整性在腸道屏障作用中至關(guān)重要 ^［46］。飼料成分是影響腸道組織形態(tài)的重要因素之一，且隨著營(yíng)養(yǎng)水平或環(huán)境改變，腸道結(jié)構(gòu)特別是腸道絨毛高度和肌層厚度會(huì)發(fā)生不同程度的變化 ^［47］。張三珊等 ^［48］研究顯示，在飼料中單獨(dú)或配合添加大蒜、茯苓，草魚幼魚腸道的絨毛長(zhǎng)度和寬度顯著增加，杯狀細(xì)胞數(shù)目增多。與之相似，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，含有大蒜的復(fù)方制劑2有利于凡納濱對(duì)蝦腸道形態(tài)的改善。張冬梅等 ^［49］在飼料中加入枯草芽孢桿菌，逆轉(zhuǎn)了以絨毛、黏膜和肌層為特征的腸道組織損傷，緩解了2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的炎癥。本試驗(yàn)復(fù)方制劑中的芽孢桿菌也呈現(xiàn)了改善凡納濱對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的效果。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方制劑1（多肽+氨基酸+枯草芽孢桿菌代謝物）和復(fù)方制劑2（大蒜提取物+肉桂提取物+菊苣提取物+枯草芽孢桿菌）均可提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，在一定程度上提高呈味氨基酸含量，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫能力和營(yíng)養(yǎng)代謝能力，改善腸道組織絨毛層脫落現(xiàn)象，其中復(fù)方制劑2效果更好。

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Effects of probiotics and traditional Chinese

herbal compound preparation on

growth，non-specific immunity， metabolic capability and intestinal

tissue structure of Litopenaeus vannamei

MA Danping， WANG Xiaolu， WANG Youhong， YU Xiaoqing，

FAN Ying， GAI Chunlei， XU La， HOU Fusheng

［Marine Science Research Institute of Shandong Province（National

Oceanographic Center，Qingdao），" Key Laboratory for Disease Control in Mariculture Shandong

Province of Municipal

Engineering Research Center of Aquatic Biological Quality

Evaluation and Application， Qingdao 266104， China］

Abstract： To investigate the effects of probiotics and traditional Chinese herbal compound preparation on growth performance， non-specific immunity， metabolic capability and intestinal tissue structure of Litopenaeus vannamei under the industrial farming model， 2 250 L. vannamei with an initial body weight of （2.0±0.2）g were randomly divided into 3 groups with 3 replicates， each replicate with 250 inds.The control diet was basic feed without any additives.The test diet 1 was basic feed supplemented with peptides+amino acids+Bacillus subtilis.The test diet 2 was basic feed supplemented with garlic（Allium sativum L.） extract+cinnamon（Cinnamomum cassia L.） extract+chicory（Cichorium intybus L.） extract+Bacillus subtilis.The supplemented dosage of two test diets was 3 g/kg basic feed.After a 30-day culture cycle， the weight gain rate and the specific growth rate of shrimp fed two test "diets were significantly increased（P＜0.05）， and the performance of test diet 2 was the best.The crude fat and "flavor amino acid content of shrimp fed two test diets were significantly higher than the control（P＜0.05）.The "activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase（SOD）， total antioxidant capacity（T-AOC）， catalase（CAT）， lysozyme（LSZ） and nitric oxide synthase（NOS） of two test groups were increased compared to the "control group， and significant difference was observed between group 2 and control（P＜0.05）.However， the "activities of glutathione peroxidase（GSH-Px）， alkaline phosphatase（AKP） and acid phosphatase（ACP） in the test groups were significantly decreased compared with the control（P＜0.05）.The activities of glutamine "synthetase（GS） in test groups were increased， and the significant differences were observed between test group 1 and the control（P＜0.05）.There were no significant differences in activities of malate dehydrogenase（MDH） and hexokinase（HK） among 3 treatments（Pgt;0.05）.Hamp;E staining showed that both compound formulations could "improve the intestinal tissue structure and reduce the villi shedding.The results indicated that supplemented "3 g/kg compound preparation（Garlic extract+Cinnamon extract+Chicory extract+Bacillus subtilis） could "significantly promote the growth， enhance the non-specific immunity and metabolic capability， optimize intestinal tissue structure， improve the whole immune levels in shrimp cultured in the factory ponds.

Key words：" Litopenaeus vannamei; Chinese herb; probiotics; non-specific immunity; metabolize; intestinal "tissue