凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）野生群體與養(yǎng)殖群體的線粒體遺傳變異分析

摘 要：為研究凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的母系遺傳背景以及遺傳特性，運(yùn)用線粒體基因（ mtDNA） D-loop區(qū)分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)凡納濱對(duì)蝦野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳變異進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示：野生群體與養(yǎng)殖群體的堿基組成一致，A+T的含量（81.52%）明顯高于C+G的含量（18.48%）；野生群體的單倍型多樣性（Hd）為0.960±0.017，核苷酸多樣性（π）為0.104±0.051，明顯高于養(yǎng)殖群體的（Hd=0.680±0.075，π= 0.060±0.029）。經(jīng)分子方差分析（AMOVA）發(fā)現(xiàn)，種群間的遺傳變異率為13.09%，群體內(nèi)的遺傳變異率為86.91%，野生凡納濱對(duì)蝦群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化存在顯著差異（F st=0.131，P＜ 0.05）。本研究結(jié)果可為凡納濱對(duì)蝦的種質(zhì)資源相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；野生群體；養(yǎng)殖群體；mtDNA；遺傳多樣性

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda）、甲殼動(dòng)物亞門(mén)（ Crustacea）、軟甲綱（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、對(duì)蝦總科（Penaeoidea）、對(duì)蝦科（Penaeidae）、濱對(duì)蝦屬（Litopenaeus），原產(chǎn)于南美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥桑諾拉（Sonora）沿海一帶，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中。我國(guó)在1988年從美國(guó)引進(jìn)凡納濱對(duì)蝦，發(fā)展至今已逾30年。該蝦具有生長(zhǎng)快、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，因而獲得大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，現(xiàn)已經(jīng)成為當(dāng)今世界三大養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的品種之一 ^［1］。

相對(duì)于同工酶、RAPD等其他分子標(biāo)記， DNA序列分析在用于群體遺傳多樣性分析時(shí)，其結(jié)果更直接、更準(zhǔn)確和可靠 ^［2］，而且線粒體基因（mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、呈母系遺傳、種群間的遺產(chǎn)差異容易檢出等特點(diǎn) ^［3-6］，其中關(guān)于12S rRNA、16S rRNA、COI，D-loop等基因片段的研究較多。水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2016年運(yùn)用mtDNA D-loop區(qū)分子標(biāo)記對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析 ^［7］，鑒于在全世界范圍內(nèi)凡納濱對(duì)蝦長(zhǎng)期選育和養(yǎng)殖可能引起的種質(zhì)退化問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)室在引進(jìn)厄瓜多爾野生群體后，再次運(yùn)用mtDNA D-loop區(qū)分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)野生凡納濱對(duì)蝦以及人工養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦群體進(jìn)行了比較分析，以期揭示野生凡納濱對(duì)蝦與經(jīng)長(zhǎng)期人工選育和養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦群體之間在遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)方面存在的差異，為凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生凡納濱對(duì)蝦群體于2016年從厄瓜多爾引進(jìn)后，暫養(yǎng)于上海市金山區(qū)，從中隨機(jī)挑選51尾用于試驗(yàn)。養(yǎng)殖群體來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室自2014到2017年保存的9個(gè)選育群體樣品，從中隨機(jī)選取51尾用于試驗(yàn)。全部試驗(yàn)樣本取肌肉放在無(wú)水乙醇中于4 ℃下保存。采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（上海）有限公司］提取基因組DNA。

1.2 引物序列與PCR擴(kuò)增

以凡納濱對(duì)蝦mtDNA D-Loop區(qū)為標(biāo)記，根據(jù)已公布的凡納濱對(duì)蝦mtDNA全序列設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為：總體積50 μL，其中2×Taq MasterMix混合液25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，DNA模板（100 pmol/μL）1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，選擇條帶清晰的送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)比，去除多余序列，并以已發(fā)表的線粒體全基因序列（ GenBank：EF584003）為對(duì)照，通過(guò)NCBI進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用軟件DnaSP v5分析堿基組成、核苷酸保守位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)，以及x單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）和平均核苷酸差異數(shù)（average number of nucleotide differences，k），軟件Arlequin v3.1基于Kimura 2P模型分析群體內(nèi)與群體間分子方差（analysis of molecular variance，AMOVA），用MEGA 4.0軟件建立單倍型進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

凡納濱對(duì)蝦的mtDNA D-Loop區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1所示，目的條帶清晰。試驗(yàn)中共獲得102條野生對(duì)蝦與養(yǎng)殖對(duì)蝦的線粒體控制區(qū)序列，養(yǎng)殖群體的線粒體控制區(qū)序列大小在716～744 bp，野生群體的線粒體控制區(qū)序列大小在691～728 bp。

2.2 核苷酸變異與單倍型分布

將凡納濱對(duì)蝦野生群體與養(yǎng)殖群體的擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。在堿基組成上，mtDNA D-Loop區(qū)的堿基序列都富含A、T，堿基A、C、G、T的平均含量分別為34.80%、10.61%、7.87%、46.72%。其中A+T含量占總堿基的 81.52%，C+G含量占總堿基的18.48%。野生群體中，有效序列752 bp，其中含330個(gè)保守位點(diǎn)和422個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。野生群體中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)197個(gè)，其中插入/缺失位點(diǎn)98個(gè)，發(fā)生轉(zhuǎn)換241個(gè)，顛換175個(gè)，轉(zhuǎn)換與顛換的比值（R=Si/Sv）為 1.38。在養(yǎng)殖群體中，有效序列754 bp，其中含485個(gè)保守位點(diǎn)和269個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。養(yǎng)殖群體中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)104個(gè)，其中插入/缺失位點(diǎn)65個(gè)，發(fā)生轉(zhuǎn)換119個(gè)，顛換116個(gè)，轉(zhuǎn)換與顛換比值（R=Si/Sv）為1.03。

采用DnaSP v5軟件對(duì)養(yǎng)殖群體和野生群體的線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行分析，在389個(gè)變異位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了49個(gè)單倍型（見(jiàn)圖2和表3）。野生群體有32個(gè)單倍型，其中30個(gè)為野生群體特有的單倍型；養(yǎng)殖群體有19個(gè)單倍型，其中17個(gè)為養(yǎng)殖群體特有的單倍型，2個(gè)為野生群體和養(yǎng)殖群體共享單倍型，兩個(gè)群體合計(jì)共有49個(gè)單倍型。由圖2可以看出，養(yǎng)殖群體的單倍型主要聚為3簇，而野生群體的單倍型基本呈均勻分布。

2.3 遺傳多樣性

遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3。野生群體的單倍型指數(shù)（Hd）為0.960±0.017，核苷酸多樣性指數(shù)（π）為0.104±0.051；養(yǎng)殖群體的單倍型指數(shù)為0.680±0.075，核苷酸多樣性指數(shù)為0.060± 0.029，說(shuō)明野生群體的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于養(yǎng)殖 群體。

2.4 遺傳分化與遺傳距離

由表4的結(jié)果可知，群體間的遺傳變異率為13.09%，群體內(nèi)的變異為86.91%，可見(jiàn)凡納濱對(duì)蝦遺傳變異的主要來(lái)源為種群內(nèi)變異。遺傳分化系數(shù)F st=0.131（P＜0.05），說(shuō)明野生群體與養(yǎng)殖群體已發(fā)生遺傳分化?；蛄鳎∟m=1.590）越小，表明遺傳分化程度越高，兩者共同闡明了兩個(gè)群體之間較高的遺傳分化水平。遺傳距離結(jié)果顯示，野生群體與養(yǎng)殖群體間的遺傳距離為0.107，野生群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.120，養(yǎng)殖群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.068。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將野生群體和養(yǎng)殖群體的49種單倍型進(jìn)行貝葉斯聚類分析，并用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。單倍型進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示： Hap_5、6、7、16、20、22、23、31、41、42、45是單獨(dú)成群，其中Hap_5、6、7、16、20、22、23、31為野生群體所特有的單倍型，Hap_41、42、45為養(yǎng)殖群體所特有的單倍型。其他38個(gè)單倍型存在分支，養(yǎng)殖群體中的Hap_19、34、35、38、39、43、44、46、47、49親緣關(guān)系較近，且與野生群體中的Hap_1、8、27聚為一支，Hap_33、36、37、40與野生群體中的Hap_3親緣關(guān)系較近，養(yǎng)殖群體的Hap_48與野生群體的Hap_32聚為一支，親緣關(guān)系較近。

3 討論

目前凡納濱對(duì)蝦遺傳育種的親蝦大多來(lái)自于引進(jìn)群體，因此在凡納濱對(duì)蝦的育種計(jì)劃中已有很多關(guān)于養(yǎng)殖群體的遺傳背景分析。由于凡納濱對(duì)蝦原產(chǎn)地對(duì)種質(zhì)資源的嚴(yán)格控制，mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)化較快 ^［8］，是進(jìn)行甲殼類種群內(nèi)遺傳多樣性分析的理想分子標(biāo)記。本研究是國(guó)內(nèi)首次采用線粒體標(biāo)記對(duì)凡納濱對(duì)蝦野生群體與養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳比較分析，結(jié)果表明，野生凡納濱對(duì)蝦群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化存在顯著差異。

4種核苷酸（A、T、C、G）在線粒體基因組中的分布呈不均一性，是動(dòng)物線粒體基因組的一個(gè)共性 ^［9］。本研究顯示，凡納濱對(duì)蝦的野生群體與養(yǎng)殖群體在堿基組成上呈現(xiàn)一致現(xiàn)象，即組成中 A+T含量明顯高于G+C含量，這與線粒體普遍存在的高AT堿基的規(guī)律相符 ^［10］。

從遺傳學(xué)角度來(lái)說(shuō)，物種遺傳多樣性水平的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān) ^［11-14］，群體遺傳多樣性每損失10%，會(huì)對(duì)其繁殖能力、存活率、生長(zhǎng)等重要生理性狀產(chǎn)生極大的負(fù)面影響 ^［15］。有研究表明，群體中線粒體DNA的核酸多樣性（π）和單倍體多樣性（Hd）是衡量群體多態(tài)程度和群體遺傳分化的重要指標(biāo)，π、Hd值越大，表示群體多態(tài)程度越高 ^［16］，當(dāng)核苷酸多樣性指數(shù)在0.001 0～0.004 7時(shí)，其群體的遺傳多樣性較低 ^［17］。由表2可見(jiàn)，凡納濱對(duì)蝦野生群體的核酸多樣性指數(shù)明顯高于其他物種，如銀鯧 ^［18］（Pampus argenteus）、貽貝 ^［19］（Mytilus coruscus）、許氏平鲉（Sebastes schlegeli） ^［20］、條石鯛 ^［21］（Oplegnathus fasciatus）等，是上述物種野生群體核酸多樣性的5～16倍，而團(tuán)頭魴 ^［22］（Megalobrama" amblycephala）野生群體的核酸多樣性是本研究的3倍。以上結(jié)果說(shuō)明，不同物種間核酸多樣性豐富度不同也可能是采集樣品地點(diǎn)不同導(dǎo)致的。本試驗(yàn)的野生群體捕撈自凡納濱對(duì)蝦的原產(chǎn)地厄瓜多爾，該群體可能保留著更豐富的核酸多樣性；Sunden等 ^［23］研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦野生群體的核酸多樣性指數(shù)是其養(yǎng)殖群體的1.36～20.00倍，而本研究中，野生群體的核酸多樣性（0.10）是養(yǎng)殖群體（0.06）的1.7倍；日本囊對(duì)蝦 ^［24］（Marsupenaeus japonicus）野生群體的核酸多樣性是4個(gè)養(yǎng)殖群體的4～10倍，可能原因有物種本身核酸多樣性豐富度的不同、親本選擇的數(shù)量以及對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)能力不同等；與劉紅等 ^［7］研究的6個(gè)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性相比，本研究結(jié)果與之相似。研究證實(shí)，養(yǎng)殖群體的核酸多樣性低于野生群體，mtDNA遺傳多樣性在養(yǎng)殖群體中顯著降低，這已成為養(yǎng)殖群體的遺傳特征 ^［23］。人工養(yǎng)殖的親本數(shù)量的選擇、繁殖能力、存活率以及繁育過(guò)程中性狀的選擇等都會(huì)在很大程度上影響種群的遺傳多樣性。Verspoor ^［25］和Winans ^［26］認(rèn)為，當(dāng)群體有效親本數(shù)量小于100時(shí)，會(huì)降低該群體的遺傳多樣性。

Li等 ^［27］認(rèn)為，養(yǎng)殖群體繁殖親本數(shù)太少易導(dǎo)致遺傳漂變加劇，遺傳漂變往往伴隨著瓶頸效應(yīng)，從遺傳學(xué)的角度來(lái)講，瓶頸效應(yīng)的發(fā)生首先表現(xiàn)為稀有單倍型的消失，隨著瓶頸效應(yīng)的加劇就會(huì)表現(xiàn)出單倍型多樣性的降低，繼而會(huì)造成物種生長(zhǎng)速度和抗病力的下降 ^［28］。本研究結(jié)果顯示，野生群體的單倍型多樣性（Hd=0.960）與貽貝 ^［19］（Hd=0.718～0.923）以及團(tuán)頭魴 ^［22］（Hd=0.857～0.943）等野生物種相近，說(shuō)明野生群體具有穩(wěn)定的大群體；養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性（Hd= 0.680）低于劉紅等 ^［7］研究的6個(gè)養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性（Hd=0.880～0.994），原因可能是該養(yǎng)殖群體的樣品來(lái)源于這6個(gè)養(yǎng)殖群體的后代，與陳薇等 ^［29］研究的養(yǎng)殖群體親本的單倍型多樣性（Hd=0.690）結(jié)果相似。

D-loop基因是線粒體DNA的非編碼區(qū)，其堿基替換速率快，一般認(rèn)為是線粒體基因組上進(jìn)化最快的部分，它的變異速率為mtDNA完整分子或是其他區(qū)域的5～10倍，作為分子鐘的進(jìn)化速率每百萬(wàn)年高達(dá)19% ^［9］。Freeland ^［30］根據(jù)遺傳分化系數(shù)大小劃定了群體的分化程度：低度分化F st=0～0.05，中度分化F st=0.05～0.25，高度分化F st＞0.25，這已成為一般接受的群體遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)。表3中野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳分化系數(shù)（F st=0.131）說(shuō)明，野生群體與養(yǎng)殖群體間已經(jīng)產(chǎn)生了中等程度的遺傳分化，且兩者間遺傳變異存在顯著差異（P＜0.05）。這與已報(bào)道的物種團(tuán)頭魴 ^［22］、銀鯧 ^［18］、條石鯛 ^［21］等的結(jié)果相似。發(fā)生遺傳分化的可能原因主要是養(yǎng)殖群體在育苗中的人為干預(yù)以及生存環(huán)境的變化。

綜上所述，建議在凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖和繁育工作中，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充不同來(lái)源的親蝦并增加親蝦數(shù)量，以維持較高水平的遺傳多樣性，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，以防止養(yǎng)殖群體因遺傳多樣性降低而出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、抗病力下降等 現(xiàn)象。

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Analysis of mitochondrial genetic variation in wild and

cultured populations of Litopenaeus vannamei

FAN Chun1， GAO Xuezhong1， YU Xiaodan2， LIU Hong2， WANG Jiangang1， LI Yun2

（1. Shanghai Fengxian ecological aquaculture service center， Shanghai 201499， China;

2. Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract： To study the maternal genetic background and characteristics of Litopenaeus vannamei， mtDNA D-loop molecular marker technology was used to compare the genetic variation between wild and farmed populations of L. vannamei. The base composition of the two populations was consistent. The content of A+T was 81.52%， which was significantly higher than that of C+G （18.48%）. Haplotype diversity （Hd=0.960±0.017） and nucleotide diversity （π=0.104±0.051） in the wild population were significantly higher than those in the cultured population （Hd=0.680±0.075; π= 0.060±0.029）. Analysis of molecular variance （AMOVA） revealed that the genetic variation rate between populations was 13.09%， while the genetic variation rate within populations was 86.91%. Significant genetic differentiation was observed between the wild and cultured populations of L. vannamei （F st= 0.131 ，Plt;0.05）. The results of this study could provide a theoretical basis for future research on the germplasm resources of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; wild population; cultured population; mtDNA; genetic diversity