西瓜隱性核雄性不育相關基因篩選及定位

摘要： 為挖掘更多的西瓜花藥、花粉發(fā)育相關基因，解析其調控網絡，本研究以西瓜雄性不育植株和可育植株為材料，構建遺傳分離群體，并利用BSA-seq和RNA-seq進行基因定位和育性相關基因篩選。結果表明，雄性不育性狀由單個隱性細胞核基因控制，該基因被定位在6號染色體的5 766 829 bp至21 366 400 bp之間。結合SNP/InDel變異位點、基因注釋及表達分析，獲得1個關鍵候選差異表達基因Cla97C06G117840以及受該基因表達影響的20個其他差異表達基因。生物信息學分析推測Cla97C06G117840由于部分編碼序列缺失導致編碼蛋白質提前終止，進而引起花粉敗育。此外20個其他差異表達基因被富集在花藥壁絨氈層發(fā)育和花粉壁組件基因集通路中，可能形成基因調控網絡來影響花藥、花粉發(fā)育。本研究為后期基因功能驗證奠定了基礎。

關鍵詞： 西瓜；雄性不育；育性相關基因；基因定位

中圖分類號： S651"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）06-1089-09

Screening and mapping of genes related to recessive nuclear male sterility in watermelon

ZHANG Gaoyuan， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To explore more genes related to watermelon anther and pollen development and analyze its regulatory network， the genetic segregation population was constructed using watermelon male sterile materials and male fertile materials. And the gene mapping and fertility related gene screening were carried out by using BSA-seq and RNA-seq. The results showed that male sterility trait was controlled by a single recessive nuclear gene， which was mapped between 5 766 829 bp and 21 366 400 bp on chromosome 6. In combination with SNP/InDel variation site， gene annotation and expression analysis， one key candidate differentially expressed gene Cla97C06G117840 and 20 other differentially expressed genes affected by the expression of this gene were obtained. Bioinformatics analysis suggested that the deletion of some coding sequences of Cla97C06G117840 led to premature termination of the coding protein， resulting in pollen abortion. In addition， 20 other differentially expressed genes were enriched in the gene pathway of anther wall tapetum development and pollen wall assembly. These genes might form a gene regulatory network to affect anther and pollen development. This study can lay a foundation for later gene function verification.

Key words： watermelon；male sterility；fertility related genes;gene mapping

西瓜（Citrulus lanatas L.）是葫蘆科的園藝作物，因其果肉美味、營養(yǎng)豐富，在世界各地廣泛種植。西瓜雜種一代具有明顯的雜種優(yōu)勢，目前其雜交種多采用人工去雄套袋授粉獲得，不僅成本高而且難以保證種子純度，影響育種單位和生產者的利益。利用西瓜雄性不育系進行制種可有效解決以上問題，但是西瓜雄性不育品種選育比較滯后。挖掘雄性不育相關基因是西瓜雄性不育分子育種的基礎。1962年Watts報道了西瓜雄性不育植株以后，人們開始對西瓜雄性不育進行研究。細胞學研究結果顯示西瓜雄性不育植株的絨氈層細胞多層，體積小，過早降解，無法為小孢子發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質，影響小孢子四分體的形成[1-3]?？寡趸讣凹に匮芯拷Y果顯示在花藥發(fā)育過程中，不育株抗氧化酶活性變化和內源激素含量異?？赡芘c西瓜雄性不育的發(fā)生密切相關[4]。遺傳標記研究結果表明，利用RAPD技術對西瓜雄性不育株和可育株基因組DNA進行比較分析，確定了特異片段A123k與育性基因的遺傳距離為8.1 cM[5]。POD同工酶分析結果顯示雄蕊中不育株較可育株多2條活性強的酶帶[6]。利用AFLP標記技術，結合BSA法，確定了特異片段 E31M50與西瓜雄性不育基因的遺傳距離為5.0 cM[7]。利用mRNA差異顯示技術，在雄性不育花蕾與可育花蕾中獲得了與育性相關的差異cDNA片段[8-9]。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)1 259個基因在西瓜雄性不育花蕾和可育花蕾中差異表達[10]?；蚨ㄎ缓捅磉_譜研究發(fā)現(xiàn)Cla006625和Cla001608是影響西瓜花藥花粉發(fā)育的關鍵基因[11-12]。

本研究前期鑒定出1個西瓜雄性不育材料，細胞學研究發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞發(fā)育不正常是導致花粉敗育的主要原因，并且在可育花蕾和不育花蕾中共發(fā)現(xiàn)4 011個差異表達基因[13]。為了明確導致雄性不育的原因，本研究以雄性不育材料為母本，雄性可育材料為父本構建遺傳分離群體并進行遺傳規(guī)律分析，然后結合集團分離分析法（BSA-seq）以及轉錄組分析法（RNA-seq）進行育性相關基因篩選和關鍵候選基因定位，為后期基因功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以雄性不育材料M0012為母本（P1），雄性可育材料WF-2018為父本（P2）構建遺傳群體（F1和F2）。2021年4月23日，將35粒P1、35粒P2 、35粒F1 和400粒F2種子直播在甘肅省蘭州市甘肅農業(yè)大學試驗田中，田間常規(guī)管理，待植株雄花顯現(xiàn)時進行育性調查。利用SPSS17.0中的卡方檢驗對西瓜雄性不育性狀的遺傳分析進行適合度檢驗。從F2分離群體中分別采集40株雄性不育單株葉片和40株雄性可育單株葉片構建子代雄性不育混合池（MS-pool）和雄性可育混合池（MF-pool），親本P1和P2分別挑選1株并采集葉片構建親本池，用于雄性不育相關基因定位。

1.2 試驗方法

1.2.1 文庫構建和測序 由上海歐易生物科技服務有限公司完成樣本DNA的提取、建庫和測序。采用CTAB法對P1、P2、MS-pool和MF-pool的葉片進行DNA提取。利用NanoDrop核酸定量分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA質量檢測。檢測合格的DNA樣品先經過Covaris超聲波DNA破碎儀隨機打斷成350～500 bp的片段，然后利用TruSeq DNA LT Sample Prep kit試劑盒進行文庫構建，文庫構建合格后利用測序儀進行雙端測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用Fastp軟件[14]對測序獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw data）進行質量控制，然后利用BWA軟件[15]將過濾后數(shù)據(jù)（Clean reads）比對到西瓜參考基因組（http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/watermelon/97103/v2/）上，比對結果經過SAMtools軟件[16]轉換格式后再利用Picard軟件（http：//broadinstitute.github.io/picard）去除冗余，并用Qualimap軟件對比對結果進行分析。使用GATK4軟件[17]的Haplotypecaller模塊進行SNP和InDel檢測。為降低SNP和InDel檢測的錯誤率，選用QD（經過深度校正的質量值）≥2.0的標準進行過濾，只保留滿足該條件的突變位點。利用 Annovar軟件[18]對SNP和InDel檢測結果進行注釋。

1.2.3 SNP-index計算及候選基因篩選 篩選親本間純合差異的SNP位點。根據(jù)親本的基因型，對子代池進行SNP檢測確定突變親本來源的 Read，計算子代池的SNP-index。同時將2個子代池的SNP-index相減獲得△SNP-index。利用二項分布檢驗2個子代池的覆蓋深度，考慮其混池數(shù)量以及群體類型，算出其統(tǒng)計學上95%的和99%的置信線，當擬合線超出置信線的染色體區(qū)域為可能的表型連鎖區(qū)域。然后在超出置信線的染色體區(qū)域內篩選候選基因。

1.2.4 候選基因表達及功能注釋 利用前期研究發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)，分析候選基因在不育和可育花蕾中的表達情況，篩選定位區(qū)間內的差異表達基因，并利用基迪奧云平臺在線分析軟件（https：//www.omicshare.com/tools）進行基因本體（Gene Ontology;GO）功能注釋。利用Orthofinder軟件進行同源基因分析[19]。利用Exon-Intron Graphic Maker在線軟件（http：//wormweb.org/exonintron）進行基因結構繪制?；虮磉_由R語言中Pheatmap和Ggpolt2包進行繪制。Cla97C06G117840基因上游引物為5′-ATGTTTATTTGTTTCTTTGCTCTTTTC-3′，下游引物為5′-TTAATAGGTATTGGATGTGGTGGTG-3′，基因測序由擎科生物技術有限公司完成。

1.2.5 GSEA富集分析及蛋白質互作預測 利用前期轉錄組數(shù)據(jù)，以定位基因表達模式為篩選標準線，計算其他基因與該基因的表達相關性，以西瓜基因GO功能注釋為背景文件，然后利用R語言進行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），篩選重要富集通路中的調控基因。蛋白質互作預測由STRING在線軟件（https：//cn.string-db.org/）完成。利用Cytoscape軟件[20]進行蛋白質互作網絡圖繪制。

2 結果與分析

2.1 雄性不育表型和遺傳規(guī)律分析

前期表型研究發(fā)現(xiàn)雄性可育花蕾花藥飽滿，開花散粉正常，而不育花蕾花藥瘦小，呈空癟狀，并且細胞學研究結果顯示花藥絨氈層細胞發(fā)育異常是導致花粉敗育的主要原因[13]。遺傳群體育性調查發(fā)現(xiàn)F1全為可育株，說明不育性狀是由隱性基因控制。F2分離群體中可育單株290個，不育單株101個，經卡方檢驗，該比例符合3∶1的遺傳規(guī)律，說明雄性不育性狀是由單個隱性細胞核基因控制（表1）。

2.2 測序質量評估

本試驗利用高通量測序技術對2個親本池和2個子代混合池進行重測序。結果如表2所示，一共產生71.79 G的原始數(shù)據(jù)量，通過質量控制過濾后獲得71.15 G的高質量Clean read數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)比率達99.80%以上，G+C含量為34.79%～34.89%，Q20含量＞95.70%，Q30含量＞87.44%，說明測序數(shù)據(jù)可靠合格，可用于下一步分析。

與參考基因組比對結果如表3所示，4個樣本比對率為99.35%～99.48%，平均覆蓋深度為39.515 0～49.183 2，平均比對質量＞47，1X覆蓋度＞98.09%，10X覆蓋度＞96.36%，說明過濾后的數(shù)據(jù)與參考基因組的比對率和覆蓋度高，可以用于下一步SNP和InDel變異檢測。

2.3 SNP和InDel變異位點檢測和注釋

SNP注釋結果顯示4個樣本池中平均檢測注釋到26 521個SNP變異位點，其中子代池MS-pool最多，為30 900個，親本池P1最少，為16 063個；共注釋了10種SNP類型，其中編碼基因區(qū)域內非同義SNP突變位點最多，4個樣本平均檢測注釋到2 428個，且子代池MF-pool中最多，為2 835，親本池P1中最少，為1 471（表4）。InDel注釋結果顯示4個樣本池中平均檢測注釋到26 052個InDel變異位點，其中子代池MS-pool中最多，為28 384個，親本池P1中最少，為20 715個。共注釋了14種InDel類型，其中編碼基因區(qū)域內移碼缺失突變最多，4個樣本平均檢測注釋到155個，且親本池P2中最多，為172個，親本池P1中最少，為109個（表5）。

2.4 連鎖區(qū)域分析

利用△SNP-index進行基因定位，結果顯示與雄性不育表型緊密連鎖區(qū)域位于6號染色體的5 766 829～21 366 400 bp（圖1A）。該區(qū)域在4個樣本池中共發(fā)現(xiàn)559個SNP變異位點和108個InDel變異位點，其中436個SNP和80個InDel變異位點位于基因間，50個SNP和9個InDel變異位點位于基因上游，27個SNP和10個InDel變異位點位于基因下游，35個SNP和8個InDel變異位點位于內含子處，只有11個SNP和1個InDel變異位點位于外顯子（圖1B）。另外，位于SNP和InDel變異位點附近的候選基因共有136個。

2.5 候選基因篩選

利用前期已發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)，對136個基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)只有18個基因在可育花蕾（MFB_A和MFB_B）和不育花蕾（MSB_a和MSB_b）之間存在差異表達。在對比組（MFB_A/MSB_a）中，2個基因在不育花蕾中明顯上調表達，而12個基因顯著下調表達。在對比組（MFB_B/MSB_b）中，4個基因在不育花蕾中明顯上調表達，而9個基因顯著下調表達 （圖2A）。SNP、InDel變異位點分析發(fā)現(xiàn)，17個差異表達基因的SNP或InDel變異位點分別位于基因間、基因上游、基因下游和內含子處，只有1個差異表達基因（Cla97C06G117840，編碼bHLH轉錄因子）的InDel變異位點位于外顯子處，而且該基因被注釋到花藥壁絨氈層發(fā)育（Anther wall tapetum development）、程序性細胞死亡的正調控（Positive regulation of programmed cell death）、細胞壁胼胝質沉積（Callose deposition in cell wall）等代謝調控通路上（表6）。與可育花蕾對比，Cla97C06G117840基因在不育花蕾中下調表達，其編碼序列在1 554～1 563 bp處缺失10個堿基（GAACTGAAAC），其中GAA位于bHLH結構域區(qū)域；由于堿基缺失導致編碼基因發(fā)生移碼，提早出現(xiàn)終止子（TAG），造成無法編碼BIF結構域序列（圖3B）。另外，該基因是擬南芥bHLH91（AT2G31210）同源基因，研究結果表明該基因參與調控擬南芥花藥及花粉發(fā)育[21]。因此，Cla97C06G117840基因被推測為導致西瓜雄性不育的關鍵基因。

2.6 關聯(lián)基因表達及富集通路分析

GSEA分析結果如圖3A所示，與Cla97C06G117840基因表達正相關的基因集的前5個富集通路主要為花粉壁組件（GO：0010208，富集分數(shù)為0.75）、細胞外基質組件（GO：0085029，富集分數(shù)為0.75）、乙酰輔酶A代謝過程（GO：0006084，富集分數(shù)為0.73）、花藥壁絨氈層發(fā)育（GO：0048658，富集分數(shù)為0.72）和花粉外壁形成（GO：0010584，富集分數(shù)為0.71）。

花藥壁絨氈層發(fā)育基因集通路中包含14個基因，其中11個基因包含在領頭亞基中（圖3A）。蛋白質互作預測結果顯示10個基因可能存在蛋白質互作，其中8個基因在MFB-A/MSB-a對比組均差異表達。例如Cla97C02G030840與擬南芥AMS（AT2G16910）同源，下調88.7%，與bHLH91、MYB33、EMS1、MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白質互作；Cla97C06G117840與擬南芥bHLH91同源，下調67.7%，與MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白質互作；Cla97C11G207430、Cla97C11G207440和Cla97C11G207480與擬南芥MS1（AT5G22260）同源，分別下調61.5%、88.6%和92.1%，與TDF1和MYB80可能存在蛋白質互作（圖3B）。因此，推測這8個基因在花藥絨氈層細胞發(fā)育中起著重要的調控作用。

花粉壁組件基因集通路中包含38個基因，其中22個基因包含在領頭亞基中（圖3A）。蛋白質互作預測顯示20個基因可能存在蛋白質互作，其中16個基因在MFB-A/MSB-a對比組均差異表達。例如Cla97C10G188910與擬南芥ABCG26（AT3G13220）同源，下調85.3%，與CYP703A2、LAP6、ACOS5、TKPR2、CYP704B1、CALS5、FAR2、QRT3、LAP5、AT3G23770和MS1可能存在蛋白質互作；Cla97C02G031180與擬南芥LAP5（AT4G34850）同源，下調86.2%，與TKPR2、QRT3和MS1可能存在蛋白質互作；Cla97C04G069450與擬南芥FAR2（AT3G11980）同源，下調83.6%，與LAP6、TKPR2、LAP3、QRT3、LAP5和MS1可能存在蛋白質互作；Cla97C05G088990與擬南芥LAP3（AT3G59530）同源，下調92.2%倍，與LAP5、LAP6和SWEET4可能存在蛋白質互作（圖3C）。因此，推測這16個基因在花粉壁發(fā)育方面起著重要的調控作用。

3 討論

雖然Cla006625和Cla001608基因已被報道影響西瓜花藥、花粉發(fā)育 [11-12]，但其他的相關基因仍需挖掘。本研究利用BSA-seq方法在西瓜6號染色體的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1個雄性不育性狀相關的關鍵候選基因（Cla97C06G117840），并結合RNA-seq篩選出受該基因表達影響的20個其他差異表達基因。通過生物信息學分析推測這些基因在西瓜花藥、花粉發(fā)育過程中可能具有重要的調控作用。

擬南芥AtbHLH91與AtbHLH10 （AT2G31220）和AtbHLH89 （AT1G06170）存在功能冗余，可以通過BIF基序與DYT1互作，是DYT1激活花藥相關基因正常表達所必需的[21]。Cla97C06G117840是AtbHLH91同源基因，但該基因在西瓜中無旁系同源基因，無功能冗余現(xiàn)象，在雄性不育植株中發(fā)現(xiàn)該基因的編碼序列缺失10 bp，發(fā)生移碼突變，提早出現(xiàn)終止子，導致BIF基序缺失。因此，推測該基因由于BIF基序缺失，無法激活下游花藥相關基因的正常表達，最終導致花藥發(fā)育異常和花粉敗育。

在其他差異表達基因中，7個差異表達基因被富集在花藥壁絨氈層發(fā)育基因集通路中，分別與擬南芥TDF1、AMS、MYB80和MS1同源。研究結果顯示這些基因可構成調控網絡（TDF1-AMS-MYB80-MS1），影響絨氈層細胞發(fā)育。其中TDF1編碼R2R3-MYB轉錄因子，tdf1突變株中絨氈層細胞異常增大并液泡化，導致花粉敗育[22]。AMS編碼bHLH轉錄因子，其突變體中絨氈層發(fā)育不正常而導致小孢子母細胞減數(shù)分裂失敗，隨后在四分體時期小孢子降解[23]。MYB80編碼R2R3-MYB轉錄因子，其突變株出現(xiàn)絨氈層細胞過早降解，導致小孢子敗育[24]。MS1編碼PHD-finger核蛋白，突變后導致絨氈層細胞分泌物合成及分泌異常，花粉外壁結構改變，引起植物雄性不育[25]。因此，推測這7個差異表達基因可能構成調控網絡，在西瓜花藥絨氈層細胞發(fā)育過程中起著重要調控作用。

此外，13個差異表達基因被富集在花粉壁組件基因集通路中，分別與擬南芥CALS5、ARF17、LAP3、ACOS5、LAP5、FAR2、LAP6、CYP703A2、CYP704B1、TKPR2、ABCG26、QRT3和AT3G23770同源。研究結果顯示這些基因在胼胝質合成、孢粉素前體形成等方面發(fā)揮著重要作用，基因突變后造成花粉壁發(fā)育異常，導致花粉敗育[26]。其中CALS5編碼胼胝質合成酶，其突變后導致花粉外壁外層缺失[27]。ARF17為生長素反應因子，可以調控CALS5基因表達，影響胼胝質合成[28]。LAP3屬于鈣依賴性磷酸三酯酶家族成員，其突變后導致花粉外壁形成異常[29]。8個基因可構成調控網絡（FAR2-ACOS5-CYP703A2/CYP704B1-LAP5/LAP6-TKPR2-ABCG26），在孢粉素前體形成過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用，基因突變后會導致孢粉素沉積受阻，進而引起花粉敗育[30]。QRT3編碼聚半乳糖醛酸酶，基因突變后導致花粉母細胞壁降解缺陷，造成花粉發(fā)育后期小孢子分離失敗[31]。因此推測這13個基因在西瓜花粉壁發(fā)育過程中可能起著重要調控作用。

4 結論

通過BSA-seq方法在西瓜6號染色體的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1個雄性不育性狀相關的關鍵候選基因（Cla97C06G117840），推測該基因由于編碼序列部分缺失，提前出現(xiàn)終止子，造成BIF基序缺失，導致下游花藥相關基因表達異常，最終引起花粉敗育。此外結合RNA-seq方法篩選出受該基因表達影響的20個其他差異表達基因，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這些基因可能存在互作關系，形成基因調控網絡，在西瓜花藥、花粉發(fā)育中可能起著重要調控作用。本研究結果將為后期西瓜雄性不育相關基因的功能研究奠定了基礎。

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（責任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-05-06

基金項目：甘肅省教育廳創(chuàng)新基金項目（2022B-102）；甘肅農業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室開放基金項目（GSCS-2020-09）；甘肅農業(yè)大學公開招聘博士科研啟動基金項目（2017RCZX-30）

作者簡介：張高原 （1987-），男，河南漯河人，博士，講師，研究方向為西瓜育種及分子生物學。（E-mail）zhanggy@gsau.edu.cn