檳榔黃化植原體TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

摘""要：檳榔是海南省重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，由植原體侵染引起的檳榔黃化?。╝reca"palm"yellow"leaf"disease，"YLD）是當(dāng)前我國(guó)檳榔生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。為了建立精準(zhǔn)高效的檳榔黃化植原體檢測(cè)方法，本研究基于檳榔黃化植原體16S"rDNA基因，設(shè)計(jì)并合成特異性引物AMf/AMr和探針AM-Prode，使用該方法進(jìn)行準(zhǔn)確性、敏感性、特異性及重復(fù)性測(cè)試，并在其他植物的植原體病害進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：本檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)出陽性樣品，健康樣品無擴(kuò)增曲線；在敏感性測(cè)試中，該檢測(cè)方法能檢測(cè)到1.16×101"copies/μL樣本濃度水平，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=–3.4185x"+"43.624，擴(kuò)增效率為96.12%，相關(guān)系數(shù)R2=0.9833；在特異性測(cè)試中，該檢測(cè)方法對(duì)YLD的檢測(cè)具有較好的特異性，檳榔、檳榔其他病害病原及其內(nèi)生菌的基因組對(duì)本方法未造成干擾；在重復(fù)性測(cè)試中，該檢測(cè)方法對(duì)檳榔黃化病的檢測(cè)具有較好的重復(fù)性；并且該檢測(cè)方法可對(duì)苦楝黃化病、細(xì)圓藤叢枝病及辣椒黃化病等8種植原體病害進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)植原體的檢測(cè)具有一定的通用性。本檢測(cè)方法的建立，有利于為檳榔黃化病的精準(zhǔn)診斷、病原監(jiān)測(cè)及媒介昆蟲的檢測(cè)等研究提供可靠的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：檳榔；檳榔黃化?。恢苍w；TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR；病害檢測(cè)中圖分類號(hào)：S763.7""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment"of"TaqMan"Probe"Real-time"Fluorescent"Quantitative"PCR"Detection"Method"for"Areca"Palm"Yellow"Leaf"Phytoplasma

LIN"Zhaowei，"MENG"Xiuli，"TANG"Qinghua，"NIU"Xiaoqing，"SONG"Weiwei*

Coconut"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Innovation"Center"of"Academician"Team，"Wenchang，"Hainan"571339，"China

Abstract："Areca"palm"is"an"important"tropical"economic"crop"in"Hainan"Province."Areca"palm"yellow"leaf"disease"（YLD）"caused"by"phytoplasma"infection"is"a"devastating"disease"in"the"production"of"arecanbsp;in"China."In"order"to"establish"an"accurate"and"efficient"detection"method"for"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma，"this"study"designed"and"synthesized"specific"primers"AMf/AMr"and"AM-Prode"based"on"the"16S"rDNA"gene"of"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma."The"method"was"used"to"test"the"accuracy，"sensitivity，"specificity"and"repeatability，"and"to"detect"phytoplasma"diseases"in"other"plants."The"method"could"accurately"detect"the"positive"samples，"and"the"healthy"samples"had"no"amplification"curve."In"the"sensitivity"test，"the"method"could"detect"the"sample"concentration"level"of"1.16×101"copies/μL，"and"the"standard"curve"equation"was"y=–3.4185x+43.624，"the"amplification"efficiency"was"96.12%，"and"the"correlation"coefficient"R2=0.9833."In"the"specificity"test，"the"method"had"good"specificity"for"the"detection"of"YLD，"and"the"genomes"of"areca，"other"disease"pathogens"and"the"endophytes"did"not"interfere"with"the"method."In"the"repeatability"test，"the"method"had"good"repeatability"for"the"detection"of"YLD."The"detection"method"could"be"used"to"detect"8"phytoplasma"diseases"such"as"chinaberry"yellow"leaf"disease，"‘Pericampylus"glaucus’"witches'"broom"disease"and"pepper"yellow"leaf"disease"and"the"detection"of"phytoplasma"has"certain"universality."The"establishment"of"detection"method"is"conducive"to"providing"reliable"technical"means"for"the"accurate"diagnosis"of"YLD，"pathogen"monitoring"and"vector"insect"detection.

Keywords："areca;"areca"palm"yellow"leaf"disease;"phytoplasma;"TaqMan"qPCR;"disease"detection

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.004

檳榔（Areca"catechu"L.）是棕櫚科檳榔屬多年生熱帶經(jīng)濟(jì)作物，中國(guó)的“四大南藥”之首。在我國(guó)，檳榔栽培于海南、臺(tái)灣及云南等地，其中海南省檳榔種植面積占全國(guó)總面積的95%以上，產(chǎn)量位居世界第二位[1]。目前，檳榔作為海南省重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是海南省政府重點(diǎn)發(fā)展的“六棵樹”之一，也是海南省中東部地區(qū)230萬農(nóng)民收入的主要經(jīng)濟(jì)來源[2]。

由植原體侵染引起的檳榔黃化?。╝reca"palm"yellow"leaf"disease，"YLD）是當(dāng)前我國(guó)檳榔生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。該病于1981年在我國(guó)的海南省屯昌縣發(fā)生為害[3]，目前已蔓延至海南省各市縣的檳榔種植區(qū)[4]。檳榔黃化病在檳榔生產(chǎn)上的為害逐年加重，輕者減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)50%～60%，局部地區(qū)甚至毀種絕收。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年因黃化病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億元以上，嚴(yán)重影響海南省農(nóng)民脫貧致富和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)[5]。

精準(zhǔn)的病原檢測(cè)有利于對(duì)病害的診斷。TaqMan熒光定量PCR技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷和動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫上。為了建立精準(zhǔn)高效的檳榔黃化植原體檢測(cè)方法，本研究基于檳榔黃化植原體的16S"rDNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并對(duì)該方法的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性及重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證，以期為YLD精準(zhǔn)診斷、病原監(jiān)測(cè)及媒介昆蟲檢測(cè)的研究提供可靠的技術(shù)手段。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試樣品""檳榔黃化植原體DNA通過通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]巢氏PCR檢測(cè)為陽性，檳榔長(zhǎng)線形病毒1（Areca"palm"velarivirus"1，"APV1）cDNA、檳榔壞死環(huán)斑病毒（Areca"palm"necrotic"ringspot"virus，"ANRSV）cDNA分別通過RT-qPCR、RT-PCR檢測(cè)為陽性[8-9]，上述樣品由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供；檳榔炭疽菌（c."gloeosporioides）、檳榔葉片分離的內(nèi)生或致病細(xì)菌：Burkholderia"andropogonis、Pantoea"ananatis、Sphingomonas"yantingensis、Curtobacterium"albidum、Bacillus"cereus、Frondihabitans"australicus基因組DNA由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供；健康檳榔葉片樣品采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所檳榔苗圃；銀膠菊叢枝植原體（16SrⅡ-A亞組）、長(zhǎng)春花小葉植原體（16SrⅠ-B亞組）DNA由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)；竹叢枝植原體（16SrI-B亞組）、苦楝黃化植原體（16SrI-B亞組）、細(xì)圓藤叢枝植原體（16SrⅠ-B亞組）、辣椒黃化植原體（16SrⅠ-B亞組）、山黃麻叢枝植原體（16SrXXXⅡ-D亞組）、花生叢枝植原體（16SrⅡ-A亞組）DNA及上述對(duì)應(yīng)的健康樣品DNA由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供。

1.1.2""主要試劑與儀器""主要試劑：植物總DNA提取試劑盒、2×Taq"PCR"mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（探針法）試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；pMDTM18-T"Vector購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Bio-Rad"T100"PCR儀器，QuantStudio"3"Real-time定量PCR儀，超微量分光光度計(jì)Thermo"ND2000。

1.2""方法

1.2.1""引物與探針設(shè)計(jì)及合成"""根據(jù)檳榔黃化植原體16S"rDNA基因序列（GenBank登錄號(hào)：KF728948.1），利用Primer"Express"3.0軟件在該基因保守的區(qū)域設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物AMf/AMr和AM-Prode探針（表1）。合成植原體16S"rDNA基因巢氏PCR通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]用于構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。引物與探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物采用PAGE純化，探針采用HPLC純化。

1.2.2""DNA提取""取樣品葉片0.1"g，參照植物總DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，并于–20"℃保存。

1.2.3""實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證引物和探針的準(zhǔn)確性""使用引物AMf/AMr和探針AM-Prode對(duì)5份經(jīng)巢氏PCR擴(kuò)增測(cè)序的陽性樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，健康檳榔樣品作為陰性對(duì)照，無菌無酶ddH2O作為空白對(duì)照。反應(yīng)體系：2×SuperReal"PreMix（Probe）10"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.6"μL，熒光探針（10"μmol/L）0.4"μL，DNA模板2"μL，50×ROX"Reference"Dye*3"0.2"μL，加ddH2O至20"μL。反應(yīng)程序：95"℃預(yù)變性15"min；95"℃變性3"s，60"℃退火/延伸30"s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.4""陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備""使用第一步引物P1/P7與第二步引物R16F2n/R16R2，以陽性檳榔黃化病樣品的DNA為模板，健康檳榔樣品DNA陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照進(jìn)行巢式PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶純化，純化后產(chǎn)物連接到"pMDTM18-T"Vector，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并提取陽性克隆子的質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，置于–20"℃保存?zhèn)溆谩＿\(yùn)用SHIRIMA等[10]的方法計(jì)算重組質(zhì)粒中的拷貝數(shù)，重組質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies/μL）=（NA×C）/（109×重組質(zhì)粒堿基對(duì)數(shù)×660"dalton/bp）。其中NA為阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023；C為重組質(zhì)粒的濃度（ng/μL）。最終計(jì)算得到重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.16×1010"copies/μL。熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序參照1.2.3，巢式PCR反應(yīng)體系及程序參照林兆威等[11]的方法。

1.2.5""敏感性測(cè)試與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立""以陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為初始模板，梯度稀釋出濃度依次為1.16×107、1.16×106、1.16×105、1.16×104、1.16×103、1.16×102、1.16×101、1.16×100"copies/μL。以此8個(gè)梯度濃度陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，健康檳榔樣品為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系及程序參照1.2.3。得到動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線和PCR擴(kuò)增循環(huán)閾值（Ct）。運(yùn)用Excelnbsp;2020軟件，以Ct值為縱坐標(biāo)，10為底質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸直線方程，并計(jì)算該組體系的擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率（%）=10（–1/斜率）–1。

1.2.6""特異性測(cè)試""以檳榔黃化植原體的DNA為陽性對(duì)照（CK+），健康檳榔DNA為陰性對(duì)照（CK–），ANRSV、APV1的cDNA，檳榔炭疽菌、Burkholderia"andropogonis、Pantoea"ananatis、Sphingomonas"yantingensis、Curtobacterium"albidum、Bacillus"cereus、Frondihabitans"australicus的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)其特異性，反應(yīng)體系和程序參照1.2.3。

1.2.7""重復(fù)性測(cè)試""選取1.16×105、1.16×104、1.16×103"copies/μL三個(gè)濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，共檢測(cè)3次，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)。同時(shí)，將上述濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品于–20"℃保存3、6、9"d，以相同反應(yīng)條件重復(fù)進(jìn)行組間試驗(yàn)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。反應(yīng)體系和程序參照1.2.3。

1.2.8""不同植物植原體上的檢測(cè)""對(duì)銀膠菊叢枝植原體、竹叢枝植原體、長(zhǎng)春花小葉植原體、苦楝黃化植原體、細(xì)圓藤叢枝植原體、辣椒黃化植原體、山黃麻叢枝植原體及花生叢枝植原體等8種不同植物的植原體DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，對(duì)應(yīng)的8種植物健康樣品DNA為陰性對(duì)照，無酶無菌ddH2O為空白對(duì)照，反應(yīng)體系和程序參照1.2.3。

2""結(jié)果與分析

2.1""實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證引物和探針的準(zhǔn)確性

使用引物AMf/AMr和探針AM-Prode對(duì)陽性樣品、健康檳榔樣品進(jìn)行TaqMan"qPCR。如圖1所示，陽性樣品均出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，且曲線平滑，而陰性樣品和空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明該熒光定量PCR的引物/探針組合能檢測(cè)到檳榔黃化植原體，可進(jìn)一步驗(yàn)證該引物/探針組合其他特性。

2.2""敏感性測(cè)試與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度按10的倍數(shù)逐級(jí)稀釋，以8個(gè)梯度濃度陽性質(zhì)粒為模板，健康檳榔樣品為陰性對(duì)照，進(jìn)行TaqMan"qPCR，并利用Ct值與質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該引物/探針組合能檢測(cè)到1.16×101"copies/μL樣本濃度水平（圖2），標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.4185x+43.624，擴(kuò)增效率為96.12%，相關(guān)系數(shù)R2=0.9833（圖3）。

2.3""特異性測(cè)試

使用檳榔黃化植原體和檳榔中主要的病害病原及內(nèi)生菌進(jìn)行TaqMan"qPCR特異性驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，僅YLD出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，健康檳榔、APV1、ANRSV、檳榔炭疽菌、B."andropogonis、P."ananatis、S."yantingensis、C."albidum、B."cereus、F."australicus均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明該檢測(cè)方法對(duì)YLD的檢測(cè)具有較好的特異性，檳榔、檳榔其他病害病原及其內(nèi)生菌的基因組對(duì)本方法未造成干擾。

2.4""重復(fù)性測(cè)試

選取濃度為1.16×105、1.16×104、1.16×103"copies/μL的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行TaqMan"qPCR檢測(cè)，分別驗(yàn)證該方法的組內(nèi)和組間的重復(fù)性，結(jié)果如表2所示，組內(nèi)變異系數(shù)小于1%，組間變異系數(shù)小于2%，該方法對(duì)YLD的檢測(cè)具有較好的重復(fù)性。

2.5""不同植物植原體上的檢測(cè)

如圖5所示，供試的銀膠菊叢枝植原體、竹叢枝植原體、長(zhǎng)春花小葉植原體、苦楝黃化植原體、細(xì)圓藤叢枝植原體、辣椒黃化植原體、山黃麻叢枝植原體及花生叢枝植原體通過該TaqMan"qPCR方法檢測(cè)均為植原體陽性，而對(duì)應(yīng)的健康樣品無擴(kuò)增曲線，說明本方法對(duì)植原體的檢測(cè)具有一定的通用性，可用于檢測(cè)上述植原體病害。

3""討論

在大多數(shù)植原體病害的檢測(cè)中，常用巢氏PCR通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]，并將R16F2n/R16R2擴(kuò)增的全長(zhǎng)序列進(jìn)行虛擬限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction"fragment"lengthpolymorphism，"RFLP）分析作為植原體鑒定的重要依據(jù)之一。由于上述巢氏PCR通用引物的敏感性較低，不利于低濃度病原的檢測(cè)，因此，在植原體檢測(cè)中常建立適用于該作物、該病害的檢測(cè)技術(shù)。鹿鵬鵬等[12]基于16S"rDNA基因建立了劍麻紫色卷葉病相關(guān)植原體單管巢式PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)技術(shù)最低檢測(cè)限濃度為≥1"fg/μL；韓劍等[13]基于16S"rDNA基因建立了棗瘋病植原體TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法敏感性達(dá)60"copies/μL；張榮躍等[14]基于Sec"A基因建立了甘蔗白葉病植原體PCR檢測(cè)方法，該方法敏感性達(dá)50"fg/μL。不同的病原檢測(cè)方法均具有優(yōu)缺點(diǎn)，考慮方法的敏感性、特異性及重復(fù)性等問題的同時(shí)，也應(yīng)考慮檢測(cè)成本。如巢氏PCR檢測(cè)成本低，但敏感性相對(duì)較低，熒光定量PCR檢測(cè)所需設(shè)備昂貴，但敏感性較高。因此，針對(duì)不同作物、不同種類病原及其病害發(fā)病特點(diǎn)采取適宜的檢測(cè)技術(shù)。如病原濃度高的植原體病害，可采取低成本的巢氏PCR檢測(cè)技術(shù)即可完成絕大多數(shù)的檢測(cè)需求。檳榔黃化病植原體具有分布不均勻[15]、濃度含量低的特點(diǎn)，因此所需敏感性較高的檢測(cè)方法。目前，國(guó)內(nèi)檳榔黃化植原體檢測(cè)主要有巢氏PCR[16]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop"mediated"isothermal"amplification，"LAMP）[17]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[15]及微滴式數(shù)字PCR（droplet"digital"PCR，"ddPCR）[18]等方法。巢氏PCR檢測(cè)方法受限于敏感性的原因，因此未能在YLD檢測(cè)中大量使用。國(guó)內(nèi)檳榔黃化病LAMP檢測(cè)技術(shù)的敏感性為200"ag/μL[17]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性為1.16×104"copies/μL[15]，而本研究建立的TaqMannbsp;qPCR敏感性達(dá)1.16×101"copies/μL（換算為50"ag/μL），敏感性高于上述2個(gè)檢測(cè)方法。微滴式數(shù)字PCR敏感性達(dá)0.07"copies/μL[18]，且樣本含量可絕對(duì)定量，但成本高、儀器設(shè)備昂貴，由于條件受限，目前尚未大量使用。

本檢測(cè)方法所需的引物和探針對(duì)檳榔黃化植原體具有高度特異性，才能避免非特異性擴(kuò)增，而檳榔黃化植原體16S"rDNA基因與部分檳榔葉綠體基因組序列同源性較高。因此，本試驗(yàn)在檳榔黃化植原體16S"rDNA基因保守區(qū)域，且與檳榔葉綠體基因組特異的位置設(shè)計(jì)引物和探針，經(jīng)大量篩選，獲得特異性引物AMf/AMr和探針AM-Prode。經(jīng)測(cè)試，該檢測(cè)方法具有較好的敏感性、特異性及重復(fù)性，滿足于日常的檳榔黃化植原體檢測(cè)。并且將該方法應(yīng)用于苦楝黃化病、細(xì)圓藤叢枝病及辣椒黃化病等其他8種植原體病害中，能夠區(qū)別健康和感病材料，說明本方法適用于其他植物植原體的檢測(cè)，具有一定的通用性，可用于對(duì)其他植物植原體病害或疑似檳榔黃化病中間寄主進(jìn)行初步診斷。

在應(yīng)用方面，該方法實(shí)現(xiàn)了海南省17個(gè)市縣的926分樣品的黃化病檢測(cè)，研究結(jié)果明確了植原體為海南省檳榔病理性黃化的主要病原之一[4]；并對(duì)檳榔種苗和檳榔采摘工具進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了一直以來由于種苗植原體含量較低造成檢測(cè)難的問題[19]；在其他植物植原體病害的應(yīng)用方面，對(duì)葉下珠黃化和叢枝癥狀樣本進(jìn)行初步的診斷，并發(fā)現(xiàn)葉下珠為植原體侵染的新寄主[11]。目前，該技術(shù)在本課題組已應(yīng)用于植原體含量較低的疑似檳榔黃化病媒介昆蟲的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

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