檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

摘""要：本研究通過(guò)建立過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，旨在探究檳榔堿對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，采用分光光度法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）釋放、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位，采用Western"blot技術(shù)檢測(cè)Nrf2、HO-1、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明：檳榔堿干預(yù)均能有效降低細(xì)胞凋亡并顯著上調(diào)線粒體膜電位；在提高SOD、CAT水平的同時(shí)降低MDA水平；140"μmol/L檳榔堿處理能夠顯著上調(diào)Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白的表達(dá)（Plt;0.001，Plt;0.0001），并下調(diào)Keap1、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)（Plt;0.001，Plt;0.0001）。表明檳榔堿能夠有效改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路、提升細(xì)胞抗氧化活力、調(diào)控Bcl-2/Bax/Caspase-3信號(hào)通路和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：檳榔堿；SH-SY5Y；氧化應(yīng)激；神經(jīng)保護(hù)；作用機(jī)制中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Neuroprotective"Effect"and"Mechanism"of"Arecoline"on"H2O2-induced"Damage"in"SH-SY5Y"Cell

SUN"Yuan1，2，4，"WANG"Danyang2，"SUN"Jing2，"BAI"Yajuan1，2，3，"FAN"Bei2，3，"SONG"Hongbo4，"JI"Jianbang1，3，5*，"LU"Cong1，2，3，5*，"WANG"Fengzhong1，2，3*

1."National"Nanfan"Research"Institute"（Sanya），"Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."Institute"of"Food"Science"and"Technology，"Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China;"3."Sanya"Institute，"Hainan"Academy"ofnbsp;Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"4."College"of"Food"Science，"Fujian"Agriculture"and"Forestrynbsp;University，"Fuzhou，"Fujian"350002，"China;"5."Haikou"Key"Laboratory"of"Areca"Processing"Research，"Haikou，"Hainan"570100，"China

Abstract："The"aim"of"this"study"was"to"explore"the"protective"effect"of"arecoline"on"the"cell"model"of"H2O2-induced"oxidative"stress"damaged"model"in"SH-SY5Y"cells"and"elucidate"its"mechanism."Cell"viability"was"detected"by"CCK-8"assay."Spectrophotometry"was"used"to"detect"LDH"release，"MDA，"SOD，"and"CAT"contents."Flow"cytometry"was"used"to"detect"cell"apoptosis"and"mitochondrial"membrane"potential."Western"blot"was"used"to"detect"the"expressions"of"Nrf2，"HO-1，"Keap1，"Bcl-2，"Bax"and"Caspase-3."Arecoline"could"reduce"cell"apoptosis"and"significantly"increase"mitochondrial"membrane"potential."The"level"of"SOD"elucidateand"CAT"increased"while"the"level"of"MDA"decreased."Arecoline"140"μmol/L"group"could"significantly"up-regulate"the"protein"expression"of"Nrf2，"HO-1"and"Bcl-2"（Plt;0.001，"Plt;0.0001），"and"down-regulate"the"protein"expression"of"Keap1，"Bax"and"Caspase-3"（Plt;0.001，"Plt;0.0001）."Conclusions："arecoline"can"effectively"improve"H2O2-induced"oxidative"stress"injury"in"SH-SY5Y"cell"by"activating"the"Nrf2/HO-1"signaling"pathway，"enhancing"the"activities"of"antioxidant"enzymes"and"regulating"the"oxidation"reduction"system"of"cells，"as"well"as"regulating"the"Bcl-2/Bax/Caspase-3"signaling"pathway"and"inhibiting"cell"apoptosis.

Keywords："arecoline;"SH-SY5Y;"oxidative"stress;"neuroprotection;"mechanism"of"action

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.017

檳榔（Areca"catechu"L.）為棕櫚科（Palmaceae）檳榔屬（Areca）常綠喬木，是我國(guó)南部熱帶亞熱帶地區(qū)的經(jīng)濟(jì)作物之一。近年國(guó)家廣播電視總局發(fā)文禁止宣傳檳榔及其產(chǎn)品，同時(shí)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局對(duì)檳榔下達(dá)限制加工生產(chǎn)令，導(dǎo)致我國(guó)檳榔產(chǎn)業(yè)遭遇生存危機(jī)。除食用價(jià)值外，檳榔具有驅(qū)蟲(chóng)[1-2]、消腫鎮(zhèn)痛[3]、消食化積[4-5]、抗炎抗氧化[6]、抗病毒[6]、改善神經(jīng)系統(tǒng)[7-10]等多種藥理活性，藥用檳榔位列我國(guó)“四大南藥”之首，因此深入挖掘檳榔的藥用價(jià)值，解析其作用機(jī)制，將檳榔回歸南藥是目前我國(guó)檳榔產(chǎn)業(yè)尋求發(fā)展的重要路徑之一。

檳榔堿是檳榔中重要的活性物質(zhì)之一，具有擬膽堿作用、阻止神經(jīng)抑制效應(yīng)[11]、增強(qiáng)內(nèi)源性促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放[12]、改善阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s"disease，"AD）病人認(rèn)知能力[13-14]、抗抑郁[15]等活性，檳榔堿具備良好的神經(jīng)功效挖掘及開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。然而，目前檳榔堿的生物活性功能尚未被完全發(fā)掘，特別是檳榔堿的神經(jīng)保護(hù)功效研究相對(duì)空缺，已知生物活性功能的作用機(jī)制并不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。過(guò)氧化氫（H2O2）避光保存下性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，并且是一種極易穿過(guò)細(xì)胞膜的外源活性氧，在其穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞后，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。因此，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷常作為一種經(jīng)典的體外氧化應(yīng)激模型。檳榔堿改善氧化應(yīng)激所導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的研究未見(jiàn)報(bào)道，其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用檳榔堿作用于H2O2損傷的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型，從抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡兩方面探究檳榔堿的神經(jīng)保護(hù)作用，以期為檳榔堿神經(jīng)功能評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""主要試劑""SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、SH-SY5Y完全培養(yǎng)基（武漢尚恩生物技術(shù)有限公司）；檳榔堿（上海源葉生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%"Trypsin-EDTA"Gibco；磷酸鹽緩沖液（PBS"1×）（Hyclone）；無(wú)血清細(xì)胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司）；BCA試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)公司）；DMSO、CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、Keap1（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin"V-FITC"Apoptosis"Detection"Kit（美國(guó)BD公司）；0.45"μm"PVDF膜、ECL（Millipore公司）；顯影定影試劑（Servicebio公司）；Caspase-3、β-actin（CST公司）；Nrf2、HO-1（Proteintech公司）；Bcl-2、Bax（ABCAM公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔（Jackson）。

1.1.2""主要儀器與設(shè)備""細(xì)胞培養(yǎng)箱（Herocell"180），上海潤(rùn)度生物科技有限公司；低溫冷凍離心機(jī)，德國(guó)sigma公司；流式細(xì)胞儀CytoFLEX；酶標(biāo)儀（spectra"MAX190）Molecular"devices；超微量核酸/蛋白分析儀，英國(guó)BioDrop"μLite；電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)（FluorChen"HD2），美國(guó)Alpha；Olympus"BX53倒置光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀，Tanon公司；掃描儀，EPSON公司。

1.2""方法

1.2.1""細(xì)胞培養(yǎng)""SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基，置于37"℃飽和濕度、5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48"h更換新培養(yǎng)基，次日進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2""檳榔堿對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響""將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按6×105個(gè)/mL密度接種于96孔板中，每孔100"μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。檳榔堿干預(yù)組中加入含有不同檳榔堿濃度（25、50、100、150、200、250、300、350、400"μmol/L，編號(hào)依次為T(mén)1～T9）的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組（CK）加入等量的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加入10"μL"CCK-8工作液，孵育合適時(shí)間，酶標(biāo)儀調(diào)至450"nm處，測(cè)量各孔的吸光度（optical"density，"OD）值。

1.2.3""檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響""（1）SH-SY5Y細(xì)胞H2O2氧化損傷模型的建立。細(xì)胞鋪板按照1.2.2處理。設(shè)置對(duì)照組（CK）和H2O2損傷組（50、100、150、200、250、300"μmol/L，編號(hào)依次為A1～A6），培養(yǎng)24"h后，每孔加入10"μL"CCK-8溶液，孵育合適時(shí)間，酶標(biāo)儀調(diào)至450"nm處，測(cè)量各孔的OD值。

（2）檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響。細(xì)胞鋪板按照1.2.2處理，設(shè)置對(duì)照組（CK）、H2O2模型組（150"μmol/L）、H2O2（150"μmol/L）+檳榔堿（35、70、140"μmol/L）干預(yù)組（編號(hào)依次為B1～B3）。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加入10"μL"CCK-8溶液，孵育合適時(shí)間，酶標(biāo)儀調(diào)至450"nm處，測(cè)量各孔的OD值。

1.2.4""檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用""將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按6×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中，每孔2"mL，每組6個(gè)復(fù)孔，孵育24"h后，按對(duì)照組（CK）、模型組（H2O2）、檳榔堿組、檳榔堿+H2O2組處理細(xì)胞。除去原培養(yǎng)基，加入檳榔堿（35、70、140"μmol/L）預(yù)保護(hù)24"h后，各檳榔堿組加入H2O2處理24"h，其中CK組僅加入DMEM完全培養(yǎng)基，模型組加入H2O2（150"μmol/L），檳榔堿+H2O2組加入檳榔堿（35、70、140"μmol/L）及H2O2（150"μmol/L）。分組處理細(xì)胞后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

（1）LDH釋放率檢測(cè)。分組處理細(xì)胞24"h后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞LDH釋放率進(jìn)行檢測(cè)。

（2）細(xì)胞凋亡檢測(cè)。分組處理細(xì)胞24"h后，參照Annexin"V-FITC"Apoptosis"Detection"Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，避光、室溫孵育15"min，孵育結(jié)束后在30"min內(nèi)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡率。

（3）線粒體膜電位檢測(cè)。分組處理細(xì)胞24"h后，參照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）說(shuō)明書(shū)染色，避光、室溫孵育15"min，孵育結(jié)束后在30"min內(nèi)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。

（4）細(xì)胞內(nèi)SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和MDA含量測(cè)定""分組處理細(xì)胞24"h后，1000"r/min離心5"min，收集細(xì)胞沉淀，使用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，置于–4"℃充分裂解30"min，并每隔5"min振蕩30"s。裂解結(jié)束后于4"℃"12"000"r/min離心5"min，取上清液，參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算細(xì)胞總蛋白，根據(jù)SOD、MDA、CAT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

（5）相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。細(xì)胞蛋白提取：分組處理細(xì)胞24"h后，1000"r/min離心5"min，收集細(xì)胞沉淀，使用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，置于–4"℃充分裂解30"min，并每隔5"min振蕩30"s。裂解結(jié)束后于4"℃"12"000"r/min離心5"min，取上清液，對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

蛋白濃度測(cè)定及樣品制備。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算蛋白濃度。①根據(jù)所測(cè)目的蛋白的分子量，配制8%～10%分離膠。②將待測(cè)蛋白樣品以每孔30"μg上樣。③電泳：濃縮膠恒壓90"V，約nbsp;20"min；分離膠恒壓120"V，通過(guò)預(yù)染蛋白marker確定電泳停止時(shí)間。④轉(zhuǎn)膜：去除濃縮膠、保留分離膠，裁剪合適大小的0.45"μm孔徑的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜300"mA恒流，60"min。⑤封閉：取出PVDF膜完全浸沒(méi)于5%"BSA-TBST中，水平搖床孵育1"h逆轉(zhuǎn)錄（RT）。⑥一抗孵育：利用5%"BSA-TBST稀釋一抗，4"℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10"min。⑦二抗孵育：利用5%"BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG室溫孵育1"h后TBST洗膜3次，每次10"min。⑧膠片曝光：滴加ECL到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5"min后曝光2"min，顯影2"min，定影。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用SPSS"26.0和GraphPad"Prism"8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，利用Image-PRO軟件進(jìn)行灰度分析，多組間比較采用單因素方差分析（one-way"ANOVA），利用LSD法驗(yàn)證兩兩比較的顯著性（Plt;0.05）。

2""結(jié)果與分析

2.1""檳榔堿對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，在檳榔堿處理細(xì)胞48"h后，檢測(cè)細(xì)胞存活率。與CK相比，T2～T4處理中，即檳榔堿濃度在50～150"μmol/L濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出隨檳榔堿濃度升高而上升的趨勢(shì)，在檳榔堿濃度為150"μmol/L時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞存活率最大，當(dāng)繼續(xù)增大檳榔堿濃度時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯下降，且成劑量依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001）。

2.2""檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響

2.2.1""H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型的建立""H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)便于發(fā)生，并且H2O2容易獲得，避光保存時(shí)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定可控，是研究細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷最常用的體外評(píng)價(jià)模型[17-18]。如圖2所示，將H2O2系列濃度作用于SH-SY5Y細(xì)胞24"h時(shí)，H2O2能劑量依賴性地抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，在H2O2濃度為50"μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞損傷甚微，細(xì)胞存活率約為100%，而在H2O2濃度為100"μmol/L時(shí)細(xì)胞損傷較小，細(xì)胞存活率在75%左右，未達(dá)到造模要求。當(dāng)H2O2濃度大于150"μmol/L時(shí)抑制作用過(guò)強(qiáng)，H2O2濃度為150"μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率約50%，較為適中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001）。因此，最終造模條件為150"μmol/L"H2O2作用24"h。

2.2.2""檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響""如圖3所示，將檳榔堿作用于H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞24"h時(shí)，與CK相比，H2O2模型組的細(xì)胞活力顯著降低（Plt;0.0001）；與H2O2模型組相比，檳榔堿組在35、70、140"μmol/L三個(gè)濃度干預(yù)下均能顯著提升氧化損傷細(xì)胞模型的存活率（Plt;0.0001）。

2.3""檳榔堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)的保護(hù)作用

2.3.1""細(xì)胞LDH釋放率""如圖4所示，與CK相比，H2O2模型組的細(xì)胞LDH活性顯著升高（Plt;"0.001），H2O2誘導(dǎo)使LDH大量釋放，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，表明細(xì)胞發(fā)生死亡。在檳榔堿干預(yù)后，與H2O2模型組相比，檳榔堿各干預(yù)組的LDH活性顯著下降（Plt;0.001），表明檳榔堿能顯著降低H2O2造成的細(xì)胞毒性作用。

2.3.2""細(xì)胞凋亡情況""Annexin-V/PI雙染色法可用于區(qū)分壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞。如圖5A所示，Q4為正常細(xì)胞，Q3為早凋細(xì)胞，Q2為晚凋細(xì)胞，Q1為死亡細(xì)胞，試驗(yàn)操作中也會(huì)造成細(xì)胞的機(jī)械性死亡（Q1象限）。依據(jù)圖5B流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與CK相比，H2O2模型組由于含有H2O2，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞顯著增加（Plt;0.0001）；而在檳榔堿干預(yù)后，凋亡細(xì)胞較模型組顯著下降（Plt;0.01，Plt;0.0001）。

2.3.3""線粒體膜電位""線粒體膜電位（mitochondrial"membrane"potential，"MMP）的下降是線粒體膜損傷和細(xì)胞凋亡的早期指標(biāo)，線粒體膜電位的失衡預(yù)示著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。如圖6所示，150"μmol/L"H2O2可以使線粒體膜電位明顯下降，說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)使得線粒體膜內(nèi)外電勢(shì)差下降，并且破壞了線粒體膜的完整性，與CK相比，極顯著下降（Plt;0.0001）；與H2O2模型組相比，檳榔堿各濃度處理組均顯著升高線粒體膜電位（Plt;0.001，"Plt;0.0001），減輕SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷。

3.3.4""胞內(nèi)MDA含量和SOD、CAT活性""MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，一定程度上反映了細(xì)胞內(nèi)的氧化程度[20]，而抗氧化酶SOD、CAT等是抗氧化的重要因素[21-22]，通過(guò)制約氧化損傷來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。如圖7所示，H2O2誘導(dǎo)后，H2O2模型組細(xì)胞中的MDA含量顯著高于CK（Plt;0.01），而SOD和CAT活性則顯著下降（Plt;0.0001）；在檳榔堿干預(yù)后，與H2O2模型組相比，檳榔堿高劑量組（140"μmol/L）均能顯著下調(diào)MDA水平（Plt;0.001），并提高抗氧化物SOD、CAT活性（Plt;0.01，"Plt;0.0001）。表明在檳榔堿干預(yù)后提高了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物水平。

2.3.5""相關(guān)蛋白表達(dá)分析""（1）Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白。核因子促紅細(xì)胞生成素相關(guān)因子-2（nuclear"factor"E2-related"factor-2，"Nrf2）是作用于機(jī)體氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中樞中重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子[23]。激活后的Nrf2與抗氧化反應(yīng)的元件（antioxidant"response"element，"ARE）結(jié)合[24]，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，上調(diào)血紅素加氧酶1（heme"oxygenase-1，"HO-1）的表達(dá)以達(dá)到減輕氧化應(yīng)激的目的。通常情況下，Keap1與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)結(jié)合為二聚體，并作為Nrf2的內(nèi)源性抑制劑，以維持細(xì)胞內(nèi)Nrf2穩(wěn)態(tài)[25]。如圖8所示，與CK相比，

H2O2模型組中的Nrf2、HO-1蛋白水平顯著下降（Plt;0.0001），對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路有負(fù)調(diào)控功能的Keap1蛋白水平顯著升高（Plt;0.0001）。與H2O2模型組相比，檳榔堿干預(yù)組能顯著提高Nrf2、HO-1蛋白水平（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001，Plt;0.0001）；顯著下調(diào)Keap1蛋白水平（Plt;0.01，Plt;0.0001）。結(jié)果表明，檳榔堿可通過(guò)提高Nrf2/HO-1信號(hào)通路中的Nrf2、HO-1蛋白水平，抑制Keap1蛋白水平來(lái)減輕H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷。

（2）Bcl-2/Bax/Caspase-3信號(hào)通路相關(guān)蛋白。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多種因素和多種蛋白共同調(diào)控的復(fù)雜生理過(guò)程，其中，Bcl-2、Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，線粒體是其調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的靶點(diǎn)[26]。線粒體形態(tài)的改變、外膜電位變化與細(xì)胞損傷、凋亡密切相關(guān)[27]。如圖9所示，與CK相比，H2O2模型組中的Bcl-2蛋白水平顯著下降（Plt;0.001），而B(niǎo)ax、Caspase-3蛋白水平顯著提高（Plt;0.001，Plt;0.0001）。與H2O2模型組相比，檳榔堿干預(yù)組能顯著提高Bcl-2蛋白水平（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.0001），而顯著下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白水平（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001，Plt;0.0001）。結(jié)果表明，檳榔堿可通過(guò)提高Bcl-2/Bax/Caspase-3信號(hào)通路中的Bcl-2蛋白水平，抑制Bax和Caspase-3蛋白水平來(lái)減輕H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷。

3""討論

近年來(lái)，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是多種神經(jīng)退行性疾病中一個(gè)重要的致病因素[28]。細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化失衡會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[29]，進(jìn)而損傷線粒體功能、DNA、RNA蛋白質(zhì)和脂質(zhì)或誘發(fā)細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體造成不可逆?zhèn)30]。研究表明，低濃度檳榔堿能上調(diào)血紅素加氧酶-1[31]、鐵蛋白

輕鏈、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基和谷胱甘肽還原酶[32]。檳榔水提醇沉物可作為一種潛在的鎮(zhèn)痛、抗炎抗氧化劑[6]。石翠格等[33]發(fā)現(xiàn)100"μmol/L檳榔堿能夠逆轉(zhuǎn)ox-LDL所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并下調(diào)炎癥因子表達(dá)，其作用機(jī)制可能與激活內(nèi)皮細(xì)胞乙酰膽堿靶點(diǎn)有關(guān)，這一點(diǎn)在張偉等[34]的研究中得到證實(shí)，并且張偉等[34]發(fā)現(xiàn)1×10–5"mol/L檳榔堿能下調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)從而減輕炎癥水平，其作用機(jī)制可能與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）有關(guān)。裴海月等[15]研究發(fā)現(xiàn)在連續(xù)給予檳榔14"d后，小鼠體內(nèi)SOD、CAT活性明顯升高，且MDA含量顯著下降，表明檳榔具有較好的抗氧化活性。此外，檳榔堿能通過(guò)提高細(xì)胞的總抗氧化能力，降低MDA的產(chǎn)生來(lái)減輕鏈尿佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞氧化損傷[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿在50～200"μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)毒性作用；在150"μmol/L"H2O2誘導(dǎo)24"h條件下，以檳榔堿35、70、140"μmol/L三個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)處理，可以有效降低H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞活力以及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位升高，減少細(xì)胞凋亡，降低MDA的產(chǎn)生，提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活性，檳榔堿各濃度組均能上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白水平并下調(diào)Keap1蛋白表達(dá)水平。該結(jié)果表明，檳榔堿的抗氧化作用與Nrf2/HO-1/Keap1通路有關(guān)，能負(fù)調(diào)控Keap1蛋白水平，降低Nrf2泛素化降解，提高下游抗氧化蛋白HO-1水平，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，減少氧化物的產(chǎn)生，以維持細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。

H2O2誘導(dǎo)使活性氧大量增加，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜電位損耗、滲透壓改變，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜破裂，細(xì)胞凋亡的發(fā)生變得不可逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果表明，檳榔堿可有效調(diào)控Bcl-2/Caspase-3/Bax凋亡通路，下調(diào)凋亡因子Caspase-3、Bax的表達(dá)水平，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，阻止Caspase-3的活化進(jìn)而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此前研究表明，檳榔堿干預(yù)能上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，保護(hù)胰腺與β細(xì)胞[36]。表明抗凋亡是檳榔堿發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的另一作用機(jī)制。

綜上所述，在無(wú)毒濃度范圍內(nèi)，檳榔堿可有效清除LDH、MDA，并能夠提高抗氧化酶SOD、CAT活性，在改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激方面表現(xiàn)出良好的效果，其作用機(jī)制可能與激活抗氧化信號(hào)通路Nrf2/HO-1/Keap1，并抑制凋亡信號(hào)通路Bcl-2/Caspase-3/Bax的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果可為檳榔堿神經(jīng)活性的深入挖掘提供數(shù)據(jù)支持，并為檳榔用于神經(jīng)調(diào)節(jié)類(lèi)健康產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

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