輻射誘變小蘭嶼蝴蝶蘭葉片生長與表型差異品種間ISSR分析

摘" 要： 使用60Co-γ射線對小蘭嶼蝴蝶蘭進行輻射處理，分別對單唇瓣、三唇瓣品種采用15 Gy和20 Gy劑量的處理，采用簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)（ISSR）分子標記技術(shù)對經(jīng)輻射處理的小蘭嶼蝴蝶蘭材料進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析. 篩選出8條引物，共擴增出89條清晰的譜帶，其中72條表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)比例為80.9%. 單唇瓣品種之間遺傳相似范圍在0.54～0.97，三唇瓣品種之間遺傳相似范圍在0.54～0.91，說明輻射突變品種之間有豐富的遺傳多態(tài)性. 單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)過輻射后，在遺傳距離L=0.65處可分為4組，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)過輻射后，在遺傳距離L=0.72處可分為7組. 觀察生長表型發(fā)現(xiàn)：經(jīng)輻射處理的小蘭嶼蝴蝶蘭出現(xiàn)生長快速表型，部分經(jīng)輻射處理的單唇瓣株系生長率比對照組更高，而經(jīng)輻射處理的三唇瓣株系生長率普遍比對照組高. 非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析表明：小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)過輻射誘變后有不同程度的突變，突變程度最大的品種在遺傳距離圖譜上自成一支. 以上結(jié)果為培育優(yōu)質(zhì)蝴蝶蘭品種奠定了材料基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞： 60Co-γ射線； 物理誘變； 簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)（ISSR）； 分子育種； 小蘭嶼蝴蝶蘭

中圖分類號： Q 947.9""" 文獻標志碼： A""" 文章編號： 1000-5137（2024）03-0380-08

ISSR analysis of different varieties of Phalaenopsis equestris leaf growth and phenotypes induced by radiation

LI Wei1，2， SONG Zihan1，2， HE Guoren1，2， CHEN Jiaying1，2*， MING Feng1，2*

（1.School of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China； 2.Collaborative Innovation Center for Plant Germplasm Resources Development， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： The Phalaenopsis equestris was irradiated with 60Co-γ rays， and its provariety and trilabial mutant varieties were treated with 15 Gy and 20 Gy doses respectively. Then the inter-simple sequence repeat （ISSR） molecular marker technology was used to irradiate the P. equestris plants. The materials were analyzed for their genetic diversity and genetic relationship. Eight primers were screened to amplify a total of 89 clear bands， of which 72 showed polymorphism， with a polymorphism ratio of 80.9%. The range of genetic similarity between provariety of P. equestris is 0.54-0.97， and the range of genetic similarity between the trilabial mutant varieties of P. equestris is 0.54-0.91， indicating that there are rich genetic polymorphisms among radiation experimental mutant varieties. P. equestris can be divided into four groups at genetic distance L=0.65 after radiation， and trilabial mutant varieties can be divided into seven groups at genetic distance L=0.72 after radiation. Observing the growth phenotype， it was found that the radiation-treated P. equestris showed a fast-growing phenotype， and the growth rate of some P. equestris lines treated with radiation was higher than that of the control group； while the trilabial mutant varieties lines treated with radiation generally had a higher growth rate than the control group. UPGMA （unweighted pair-group method with arithmetic means） cluster analysis showed that P. equestris had different degrees of mutations after radiation mutagenesis， and the varieties with the largest mutations formed their own branches on the genetic distance map. The results above laid the material foundation for the cultivation of Phalaenopsis.

Key words： 60Co-γ rays； physical mutagenesis； inter-simple sequence repeat （ISSR）； molecular breeding； Phalaenopsis equestris

小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）是蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物，原產(chǎn)于我國臺灣小蘭嶼島，由我國科學(xué)家完成對其的全基因組測序，是世界上首個完成全基因組測序的蘭花［1］，也是國內(nèi)最具經(jīng)濟價值和觀賞價值的蘭花品種之一. 目前，蝴蝶蘭已有很多有效的育種方式，如雜交育種、誘變育種、多倍體育種，以及基因工程育種等［2］.

輻射育種是物理誘變育種方法之一，其方法簡便，育種周期短、效果好，能夠獲得稀有突變體新種質(zhì)（材料），已被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代育種. 不同物種對于60Co-γ的耐受性各不相同，因此輻射最佳劑量、半致死劑量一直是非常重要的研究內(nèi)容［3-7］. 我國輻射育種常用的輻射源是60Co-γ射線，研究人員早在21世紀初期便使用60Co-γ射線對蝴蝶蘭進行輻射處理［8-10］.

簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)（ISSR）分子標記是一種在簡單重復(fù)序列（SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分子標記技術(shù)，具有方便簡單、通用性高等特點. 謝啟鑫等［11］采用ISSR分子標記分析發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭的分類結(jié)果與材料來源、花器官表型等有密切聯(lián)系. 李敏等［12］通過優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系對16個蝴蝶蘭品種的親緣關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比例高達92.2%. 另外，蝴蝶蘭的花色也是進行ISSR分子標記分析遺傳距離的重要依據(jù)，張淑紅等［13］使用ISSR分子標記技術(shù)對6個蝴蝶蘭樣品的花色遺傳多樣性進行了分析，分析的結(jié)果與花色分類一致.

本研究通過用60Co-γ射線對單唇瓣和三唇瓣的小蘭嶼蝴蝶蘭進行誘變，結(jié)合ISSR分子標記技術(shù)對產(chǎn)生突變的株系進行聚類分析，以研究其突變程度，為蝴蝶蘭新品種培育以及開展相關(guān)基因功能鑒定的研究工作提供參考.

1" 材料與方法

1.1 實驗材料

單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭為野生型小蘭嶼蝴蝶蘭，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭為野生型小蘭嶼蝴蝶蘭的自然突變體品種. 實驗室所有蝴蝶蘭材料均來自臺灣小蘭嶼島，經(jīng)過培養(yǎng)后由分株得到.

1.2 儀器與設(shè)備

Icen-24 高速臺式離心機，杭州奧盛儀器有限公司；FR-250系列電泳儀，上海復(fù)日科技有限公司；GenoSens 1850 凝膠成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Biometra Tone 96G PCR PCR反應(yīng)儀，德國Biometra GmbH/Analytik Jena AG.

1.3 實驗方法

1.3.1 輻射處理

選取經(jīng)過分株培養(yǎng)后生長均勻一致的單唇瓣、三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭共42株，送至上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院束能輻射中心進行輻射處理［23-24］，分別進行15 Gy和20 Gy劑量的處理，輻射率為150 Gy/h （圖1）. 之后繼續(xù)在上海師范大學(xué)植物種質(zhì)資源中心培養(yǎng)室進行培養(yǎng)與觀察，培養(yǎng)條件為晝溫25 ℃，夜溫16 ℃，濕度40%.

1.3.2 基因組DNA提取

使用SDS法提取輻射材料的基因組DNA. 取0.1～0.2 g樣品經(jīng)過液氮冷凍處理后研磨成粉，加入65 ℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液600 μL，于65 ℃保溫30 min，加入200 μL 醋酸甲（KAC）搖勻，靜置20 min，12 000 r?min-1離心6 min后，取500 μL上清液，加入等體積異丙醇靜置20 min，12 000 r?min-1離心10 min，棄上清并加入2倍體積的70 %（體積分數(shù)）的乙醇洗去鹽離子，離心后晾干，加入50 μL無菌水溶解. 并將樣品質(zhì)量濃度稀釋為10 ng?μL-1備用.

1.3.3 引物篩選及擴增反應(yīng)

引物從University of British Columbia所設(shè)計的引物中進行挑選，并由上海擎科公司合成，從中篩選出8條引物進行PCR分析（表1）. 擴增反應(yīng)在Biometra Tone 96G PCR儀上進行. 實驗體系為（20 μL）：Taq DNA聚合酶0.2 μL， 10 × PCR buffer 2.0 μL， 25 mmol?L-1 MgCl2 2 μL（上海Vazyme生物科技有限公司）；dNTPs 0.8 μL ，10 μmol?L-1引物2 μL，ddH2O 7 μL，10 ng?μL-1 DNA模板1 μL，上海擎科生物. 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；進行45個循環(huán)，循環(huán)包括94 ℃變性1 min，49.0～59.6 ℃退火55 s、72 ℃延伸1.5 min； 最后72 ℃延伸8 min.

電泳條件：采用1.5 %（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖凝膠，1× Tris硼酸（TBE）緩沖液，熒光染料溴化乙錠（EB）染色，120 V電壓下電泳40～45 min，用凝膠成像儀觀察并拍照分析.

1.3.4 條帶統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析

每個引物對最終獲得的43份樣品（含未經(jīng)輻射處理的對照組CK）重復(fù)擴增3次，對重復(fù)性好的PCR產(chǎn)物電泳后，將在凝膠的某一多態(tài)位置上的DNA條帶按有（記為“1”）或無（記為“0”）進行人工統(tǒng)計，只記錄易于辨認的條帶，排除模糊不清的條帶. 應(yīng)用NTSYSpc 2.10e軟件進行Nei遺傳距離計算，然后利用非加權(quán)組平均法（UPGMA）法構(gòu)建聚類樹狀圖.

2" 結(jié)果與分析

2.1 輻射處理促進小蘭嶼蝴蝶蘭葉片生長

自輻射處理的當(dāng)天開始進行觀察，每隔10 d進行一次表型生長觀察記錄，如圖2（a）所示. 經(jīng)過3個月的觀察發(fā)現(xiàn)，部分蝴蝶蘭出現(xiàn)葉片快速生長的表型，例如單-15 Gy-11株系，如圖2（b）所示，同時期跟蹤觀察記錄發(fā)現(xiàn)，其幼葉的生長速度明顯高于CK. 從不同劑量輻射處理的單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭中挑選3株共8片葉片與CK葉片進行生長速度觀察并記錄，如圖2（c）所示，從不同劑量輻照處理的小蘭嶼蝴蝶蘭中挑選4株共8片葉片與CK葉片進行生長速度觀察并記錄，如圖2（d）所示. 觀察到蝴蝶蘭經(jīng)過輻射處理后，葉片快速增長，例如單-15 Gy-11株系在輻射處理后的第9天，觀察到葉片長度與CK相比顯著上升，如圖2（b）所示.

對單唇瓣和三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭進行重復(fù)性調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)：單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭的單株葉片增長率僅為1.2%～1.4%，與CK相比無顯著性差異，如圖2（c）所示；而三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭的葉片增長率均顯著高于CK，如圖2（d）所示.

2.2 ISSR引物篩選及多態(tài)性分析

對已有的蝴蝶蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系［18］進行改良，調(diào)整了引物退火溫度、循環(huán)數(shù)等的篩選，如表1所示，其他條件同1.3.3. 經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)循環(huán)數(shù)為45時均能獲得較好的條帶.

分析結(jié)果顯示：通過與Marker進行比較分析，全部處理的小蘭嶼蝴蝶蘭材料的全基因組模板DNA的ISSR-PCR擴增的片段約在250～2 000 bp范圍內(nèi)，8條引物共擴增出89個條帶，其中多態(tài)性條帶有72條，總體多態(tài)性比例為80.9%. 其中有些引物獲得的條帶多態(tài)性較高，例如引物UBC895，條帶多達15條，且多態(tài)率高達93.3%，如圖3所示. 引物UBC873，條帶有9條且具備多態(tài)性的條帶有5條，多態(tài)率為55.5%，如圖4所示.

2.3 誘變小蘭嶼種間遺傳相似聚類分析

根據(jù)ISSR擴增的結(jié)果，使用NTSYSpc 2.10e軟件進Nei遺傳距離計算，并用UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖對單唇瓣、三唇瓣的小蘭嶼蝴蝶蘭品種進行處理后，作聚類分析.

單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭（圖6）的遺傳距離L為0.54～0.97，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭的遺傳距離L為0.54～0.91. 單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭在L=0.70處可以分為4支. A支與CK聚在同一個主支上，雖然有突變，但是相對于B，C，D來說，突變程度不高. 而A支根據(jù)遺傳距離以及表現(xiàn)觀察結(jié)果，又可分為A1，A2和A3，其中，A1的特異性不明顯；A2僅包含單-15 Gy-11株系，表現(xiàn)出幼葉快速增長的表型；A3由單-20 Gy-9和單-20 Gy-10兩個株系組成. B，C，D是在聚類分析圖上與CK遺傳距離在0.70以上的株系，其中，D支上的單-15 Gy-12株系與CK遺傳距離最遠，突變程度最高.

三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭（圖7）在L=0.70處分為5支. A支中的株系與CK遺傳距離相近，但仍觀察到特異性表型，如觀察到的三-15 Gy-8、三-20 Gy-10株系的開花表型，這兩株雖然在遺傳距離上與CK相近，突變表型僅表現(xiàn)在花瓣與唇瓣上，但突變表型較為明顯，出現(xiàn)突變的花朵概率較高. B支是在遺傳距離圖上除A支之外最大的一組分支. C，D，E分別由三-20 Gy-3、三-20 Gy-6、三-20 Gy-7獨立成支，其中E支與CK遺傳距離最遠，說明三-20 Gy-7株系突變程度最高.

3" 討 論

由于蘭科植物育種周期長、難度高，本研究采用輻射誘變的育種方式旨在開發(fā)新的蝴蝶蘭品種，輻射劑量的選擇主要參考徐曉薇等［9］. 觀察發(fā)現(xiàn)，輻照后的三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭普遍出現(xiàn)快速生長的表型，而單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭則是隨機出現(xiàn)該表型. 此外還發(fā)現(xiàn)，在同射線劑量情況下，單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭極易出現(xiàn)不良表型（不良率75%），例如葉片萎蔫、壞死，甚至是株系死亡，而三唇瓣出現(xiàn)不良表型的概率（25%）大大低于單唇瓣的，這與單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)過輻射處理后容易出現(xiàn)變異表型，且三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)輻射處理后普遍表型優(yōu)良的結(jié)論相符合.

由于實驗發(fā)現(xiàn)輻射處理可以刺激小蘭嶼蝴蝶蘭的生長發(fā)育，為了進一步了解該機制，利用本實驗室篩選的兩個生長調(diào)控Marker基因GRF1，GRF6［14］，進行輻射材料中PeGRF1，PeGRF6的相對表達量分析，但并沒有發(fā)現(xiàn)這兩個基因有顯著性高表達的結(jié)果（未展示），說明輻射處理的突變小蘭嶼蝴蝶蘭快速增長不是由這兩個基因突變引起的，也許與其他基因突變有關(guān). 目前正在進行轉(zhuǎn)錄組分析，以探究促進葉片生長的分子機理.

60Co-γ射線對于植株葉片的形態(tài)也會產(chǎn)生影響. 采用15 Gy劑量的60Co-γ射線輻射處理辣木種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組葉片與對照組葉片之間存在顯著的形態(tài)差異［15］. 張興芬等［16］對經(jīng)過輻照處理后的三七葉片細胞層次進行觀察，發(fā)現(xiàn)葉片細胞的柵欄組織、細胞形態(tài)、細胞壁等出現(xiàn)突變，且隨著輻射劑量增加，其突變程度加深. 在本研究中發(fā)現(xiàn)，輻射處理約7個月后，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭的葉片出現(xiàn)類似于蟹鉗的突變表型，該突變發(fā)生概率約為40%，具體機制還需進一步探索.

本研究所采用的ISSR引物主要參考李敏等［12］的ISSR-PCR反應(yīng)體系中呈現(xiàn)的8條引物，但完全按照該反應(yīng)體系進行實驗后，只有部分引物的條帶結(jié)果清晰可用，這可能由于適用于大辣椒等蝴蝶蘭品種的引物反應(yīng)體系不完全適用于小蘭嶼蝴蝶蘭. 因此本研究還借鑒了楊帆等［17］用于薔薇屬植物ISSR分析所篩選的引物，以及董金磊［18］等用于月季遺傳多樣性分析所篩選的引物，共擴增出89個條帶，其中多態(tài)性條帶有72條，總體多態(tài)性比例為80.9%.

對輻射處理植株的生長情況進行觀察分析發(fā)現(xiàn)，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭開花表型的突變程度高于單唇瓣. 三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭出現(xiàn)花型結(jié)構(gòu)上的突變，在單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭中只觀察到花色變淺的改變.

4" 結(jié) 論

本研究通過60Co-γ射線對單唇瓣和三唇瓣的小蘭嶼蝴蝶蘭進行誘變，發(fā)現(xiàn)輻射誘變材料具有促進葉片生長的表型，此外三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭經(jīng)輻射后萎蔫與死亡的比例顯著低于單唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭，表明三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭可能具有較強的抗輻射能力. 采用ISSR分子標記技術(shù)對產(chǎn)生突變的株系進行聚類分析，以及對突變體材料的生長進行觀察分析發(fā)現(xiàn)，三唇瓣小蘭嶼蝴蝶蘭突變程度更高. 本研究為蝴蝶蘭新品種培育以及開展相關(guān)基因功能鑒定工作提供了一定參考.

參考文獻：

［1］""" 佚名. 我國領(lǐng)銜完成世界首個蘭花全基因組測序 ［J］. 生物學(xué)教學(xué)， 2015，40（5）：1.

［2］""" 張果， 趙玉安， 劉曉鵬， 等. 國內(nèi)蝴蝶蘭育種技術(shù)的研究進展 ［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2020，48（9）：86-92.

ZHANG G， ZHANG Y A， LIU X P. Research progress of Phalaenopsis breeding technology in China ［J］. Guizhou Agricultural Sciences， 2020，48（9）：86-92.

［3］""" 周亞倩， 姚娜， 魏莉， 等. 60Co-γ射線對樹蘭蒴果輻照生物學(xué)效應(yīng)研究 ［J］. 核農(nóng)學(xué)報， 2017，31（9）：1693-1699.

ZHOU Y Q， YAO N， WEI L. Effect of 60Co-γ Irradiation on capsule of Epidendium secundum ［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2017，31（9）：1693-1699.

［4］""" CIMEN B， YESILOGLU T， INCESU M， et al. Studies on mutation breeding in citrus： improving seedless types of ‘Kozan’ common orange by gamma irradiation ［J］. Scientia Horticulturae， 2021，278：109857.

［5］""" ABDUL H， ABDULLAH， BAKHTIAR， et al. Gamma ray radiation mutant rice on local aged dwarf ［J］. Middle-East Journal of Scientific Research， 2013，15（8）：1160-1164.

［6］""" PASANGKA B， REFLY. Development and cultivation of local kidney bean （Phaseolus vulgaris L.） through breeding to use multi gamma irradiation technique （Nuclear） ［J］. American Journal of Agricultural and Biological Sciences， 2016， 11（3）：117-127.

［7］""" MAGDY A M， FAHMY E M， AL-ANSARY ABD EL-R M F， et al. Improvement of 6-gingerol production in ginger rhizomes （Zingiber officinale Roscoe） plants by mutation breeding using gamma irradiation ［J］. Applied Radiation and Isotopes， 2020，162：109193.

［8］""" 章寧， 蘇明華， 劉福平， 等. 蝴蝶蘭60Co-γ射線誘變育種研究（簡報） ［J］. 亞熱帶植物科學(xué)， 2005（2）：63-62.

ZHANG N， SU M H， LIU F P. Study on 60Co-γ radiate mutation in breeding of Phalaenopsis ［J］. Fujian Institute of Subtropical Botany， 2005（2）：63-62.

［9］""" 徐曉薇， 林紹生， 姚麗娟， 等. 蝴蝶蘭60Co-γ輻射誘變育種初報 ［J］. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)， 2008（2）：1-2.

［10］" 張永柏， 廖福琴， 鐘淮欽， 等. 蝴蝶蘭花粉輻射誘變育種初報 ［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2009， 24（3）：237-240.

ZHANG Y B， LIAO F Q， ZHONG H Q. A preliminary study on pollen irradiation for Phalaenopsis breeding ［J］. Fujian Journal of Agricultural Sciences 2009，24（3）：237-240.

［11］" 謝啟鑫， 繆南生， 宋小民， 等. 蝴蝶蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析 ［J］. 西北植物學(xué)報， 2010， 30（7）： 1331-1336.

XIE Q X，MIAO N S，SONG X M. Genetic diversity analysis of Phalaenopsis by ISSR markers ［J］. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2010，30（7）：1331-1336.

［12］" 李敏， 王堯峰， 明鳳. 用ISSR分子標記技術(shù)分析16個蝴蝶蘭品種的親緣關(guān)系研究 ［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報， 2010，12（1）：60-65.

LI M， WANG Y F， MING F. Studies on genetic relationship analysis of 16 Phalaenopsis hybrid cultivars by ISSR molecular marker technology ［J］. Journal of Agricultural Science and Technology， 2010，12（1）：60-65.

［13］" 張淑紅， 范永山， 翟鳳順. 蝴蝶蘭不同花色遺傳多樣性的ISSR分析 ［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（2）：77-78，106.

［14］" RODRIGUEZ R E， MECCHIA M A ， DEBERNARDI J M ， et al. Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396 ［J］. Development， 2010，137（1）：103.

［15］" 王小安， 姜翠翠， 葉新福. 60Co-γ輻照對多油辣木葉片形態(tài)特征和營養(yǎng)品質(zhì)的影響 ［J］. 東南園藝，2021，9（1）： 13-18.

"""" WANG X A， JIANG C C， YE X F. Effects of 60Co-γ rays irradiation on the leaf morphological characteristics and nutritive content of Moringa oleifera Lam. ［J］. Southeast Horticulture， 2021，9（1）：13-19.

［16］" 張興芬， 何忠俊， 梁社往， 等. 60Co-γ輻照對三七葉片組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 ［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)）， 2016，31（2）：239-244.

ZHANG X F，HE Z J，LIANG S W. Effect of 60Co-γ irradiation on tissue structure and cellular morphological structure of Panax notoginseng leaves ［J］. Journal of Yunnan Agricultural University （Natural Science） 2016，31（2）：239-244.

［17］" 楊帆， 曾麗， 葉康， 等. 17份薔薇屬植物的親緣關(guān)系的形態(tài)學(xué)和ISSR分析 ［J］. 植物研究， 2011，31（2）：193-198.

YANG F， ZENG L， YE K. Relationship of 17 rosa plants detected by morphology and ISSR analysis ［J］. Bulletin of Botanical Research， 2011，31（2）：193-198.

［18］" 董金磊， 郭國業(yè)， 崔艷. 基于ISSR分子標記的現(xiàn)代月季遺傳多樣性分析 ［J］. 南陽師范學(xué)院學(xué)報， 2018，17（3）： 21-25.

DONG J L，GUO G Y，CUI Y. Analysis of genetic diversity of modern rose based on ISSR molecular marker ［J］. Journal of Nanyang Normal University， 2018，17（3）：21-25.

（責(zé)任編輯：顧浩然）