甜櫻桃綠變植原體的分子檢測(cè)及鑒定

摘" 要：為明確甜櫻桃綠變植原體的分類地位，通過對(duì)表現(xiàn)綠變癥狀的甜櫻桃感病植株總DNA進(jìn)行16S rRNA基因、rp基因和tuf基因的PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析。結(jié)果表明，甜櫻桃綠變植原體16SrRNA基因片段大小為1 248 bp，與棗瘋植原體（AB052876）聚為一簇，且相似系數(shù)為1.00，應(yīng)同屬于16SrⅤ-B亞組?；趓p基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，甜櫻桃綠變植原體與棗瘋植原體JWB（AY197681）聚為一簇，屬于rpV-C亞組。基于tuf基因系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，甜櫻桃綠變植原體與棗瘋植原體JWB-XFDO（GU968759）等聚為一簇，屬于16SrⅤ組。明確了甜櫻桃綠變植原體的分類，為泰安地區(qū)病害檢測(cè)、診斷以及科學(xué)防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；植原體；16SrRNA基因；rp基因；tuf基因

中圖分類號(hào)：" S662.5" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1002-2910（2024）05-0012-04

收稿日期：2024-02-23

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)特色果樹生產(chǎn)工程實(shí)驗(yàn)室開放課題（FE202001）；兵團(tuán)財(cái)政科技計(jì)劃資助（2019DA001， 2020DA003）。

*通信作者：朱天生（1974-），男，甘肅莊浪人，教授，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：ztszky@163.com

作者簡(jiǎn)介：陳金霄（1999-），女，山東東營(yíng)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。E-mail：1953421366@qq.com

Molecular detection and identification of sweet cherry virescence phytoplasma

CHEN Jinxiao1，2，DONG Xiaoxu2，ZHU Tiansheng1*，GAO Rui2，WANG Jie2

（1. College of Plant Science， Tarim University/Joint Laboratory of Integrated Control of Agricultural Pests in Southern Xinjiang Production and Construction Corps/National-Local Joint EngineeringLaboratory for High- yield and" High-quality Cultivation and Deep Processing of South Xinjiang Regional SpecialFruits， Alar， "Xinjiang 843300，China; 2. Shandong Institute of Pomology， Tai’an， Shandong 271000，China）

Abstract：To confirm phytoplasma infection，samples of sweet cherry（Prunus aviumL.）plants showing virescencesymptom were collected from an orchard in Tai’an. Total DNAs were extracted from symptomatic and asymptomatic plants for PCR amplification. A 16SrDNA fragment of 1 248 bp in length were amplified from diseased cherry tissue，but not from healthy plant，using universal primers for phytoplasmal 16SrRNA gene. The similarity coefficient between the SCHV and the 16SrV-B subgroup ofjujube witches’-broomphytoplasma （AB052876） is 1.00. Phylogenetic analysis based on rpgenes revealed that SCHVbelonged to rpV-Csubgroup. Sequence analysis indicated the tufgene ofSCHVwas clustered with jujube witches’-broomphytoplasma JWB-XFDO （GU968759）， belonging to the 16SrⅤ group. In conclusion， this study clarified the classification of sweet cherry virescence phytoplasma isolated from Tai’an， providing a foundation for local disease detection， diagnosis， and scientific control.

Key words：sweet cherry； virescence phytoplasma； 16SrRNA gene； rpgene； tufgene

植原體是一類無細(xì)胞壁、不能人工培養(yǎng)的原核生物，一般表現(xiàn)為球形、橢圓形、長(zhǎng)桿形等多態(tài)不規(guī)則形狀［1］。植原體主要依靠葉蟬和飛虱等從韌皮部取食的刺吸式昆蟲傳播，也可通過菟絲子寄生或人工嫁接的方式傳播。植原體侵染櫻桃能夠引起植株花變?nèi)~、花變綠、叢枝、生長(zhǎng)衰退、黃化等癥狀，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)2～5年內(nèi)死亡［2，3］。國(guó)外對(duì)植原體侵染櫻桃引起的病害報(bào)道較多，主要有16SrI組植原體引起的櫻桃花變?nèi)~病、16SrII、16SrIII、16SrXII-A和16SrX組植原體引起X-?。?］、櫻桃衰退?。?］、櫻桃致病黃化［6］和甜櫻桃?guī)Щ。?］等。目前，國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的櫻桃植原體病害主要有櫻桃致死黃化［8］、櫻桃叢枝?。?］、櫻桃花變綠?。?0］、中國(guó)櫻桃花變?nèi)~病［11］和櫻桃衰退?。?2］等，分別由16SrI、16SrIII、16SrⅤ組植原體引起。山東省甜櫻桃植原體病害的發(fā)生逐年加重，主要有甜櫻桃叢枝病和櫻桃花變綠病，在部分地區(qū)對(duì)甜櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)泰安市櫻桃園內(nèi)采集到的甜櫻桃感病樣品進(jìn)行植原體檢測(cè)，明確了分類，為進(jìn)一步制定有效的防控措施提供了理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

表現(xiàn)綠變癥狀的甜櫻桃樣品及健康對(duì)照樣品均采自山東省泰安市泰山區(qū)甜櫻桃種植區(qū)內(nèi)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker、Taq DNA聚合酶等購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；一步法植物DNA提取試劑盒（多糖多酚）購自北京諾貝萊生物科技有限公司；引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1" 總DNA的提取。利用一步法植物DNA提取試劑盒分別提取表現(xiàn)綠變癥狀的甜櫻桃及健康對(duì)照樣品的總DNA。電泳檢測(cè)所提取DNA完整性，于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2甜櫻桃綠變植原體16SrRNA基因、rp基因及tuf基因的PCR擴(kuò)增。以提取的感病樣品及健康對(duì)照的總DNA為模板，用引物R16F2n/R16R2對(duì)樣品進(jìn)行直接擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以引物rp（V）F1A/rp（V）R1A基因進(jìn)行直接擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)NCBI上16SrⅤ組tuf序列設(shè)計(jì)引物Ftuf2/Rtuf2對(duì)tuf基因進(jìn)行直接擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，46 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。所有引物序列具體如表1所示。

1.2.3" PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析。將PCR產(chǎn)物純化后，與pCE2 TA載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，將PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測(cè)序。

利用SeqMan軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行拼接，在NCBI中對(duì)獲得的基因序列采用Blast在線對(duì)比獲取同源序列，下載植原體不同組及亞組的代表株系相關(guān)序列，采用MEGA-X軟件［16］對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中已下載的相關(guān)株系相應(yīng)基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

利用植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier（http： / /plantpathology．ba．a(chǎn)rs．usda．gov /cgi-bin / resource /iphyclassifier．cgi）進(jìn)行相關(guān)植原體株系候選種的確定和基于相似系數(shù)分析的16Sr組或亞組的確定［17］。

2" 結(jié)果與分析

2.1甜櫻桃綠變病株的癥狀表現(xiàn)

感病的甜櫻桃植株花瓣變?yōu)槊黠@的綠色，新生葉片變小、皺縮，果實(shí)變?yōu)榻┕?，不能成熟，?yán)重時(shí)植株枯死（圖1）。

2.2 甜櫻桃綠變植原體16SrRNA克隆及序列分析

從表現(xiàn)綠變癥狀的甜櫻桃中提取的總DNA均擴(kuò)增到長(zhǎng)度約為1.2 kb的16SrRNA基因片段，與預(yù)期大小相符，健康植株中未擴(kuò)增出特異條帶，說明表現(xiàn)綠變癥狀的櫻桃植株中存在植原體。將此植原體分離物命名為甜櫻桃綠變植原體（SCHV）。

甜櫻桃綠變植原體的16S rRNA基因含有1 248個(gè)核苷酸，G + C的含量為45.75%。將該分離物與GenBank中21個(gè)植原體分離物的16SrRNA基因進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

結(jié)果表明，SCHV與棗瘋病植原體（AB052876）、甜櫻桃綠變植原體（MF848961）、中國(guó)櫻桃花變?nèi)~植原體（MH399891）和櫻桃綠變植原體ChV-Mn分離物（JN607240）的序列一致率均為99.8%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，SCHV與甜櫻桃綠變植原體（MF848961）、櫻桃綠變植原體ChV-Mn分離物（JN607240）和棗瘋植原體（AB052876）聚為一簇，同一16SrⅤ-B亞組（圖2）。

根據(jù)植原體鑒定在線工具iPhyClassifier進(jìn)一步鑒定，確定甜櫻桃綠變植原體（SCHV）屬于16SrV-B亞組（表2）。

2.4 甜櫻桃綠變植原體rp基因克隆及序列分析

用rp基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明甜櫻桃綠變植原體rp基因含有1 222個(gè)核苷酸，G + C的含量為27.82%。將甜櫻桃綠變植原體（SCHV）的rp基因與GenBank中19個(gè)rpV組各亞組植原體分離物的rp基因序列進(jìn)行一致率比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

結(jié)果表明，甜櫻桃綠變植原體（SCHV）與甜櫻桃綠變植原體SCV-XL-2014（MF848953）和棗瘋植原體（AY197681）的序列一致率最高為99.8%。而與其他組植原體一致率均小于90%。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，SCHV分離物與屬于rpV-C亞組的甜櫻桃綠變植原體SCV-XL-2014（MF848953）、棗瘋植原體JWB（AY197681）聚為一簇（圖3），表明甜櫻桃綠變植原體（SCHV）分離物屬于rpV-C亞組。

2.5甜櫻桃綠變植原體tuf基因克隆及序列分析

用tuf基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明甜櫻桃綠變植原體（SCHV）的tuf基因含有828個(gè)核苷酸，其中G + C的含量為32.97%。將SCHV的tuf基因與GenBank中15個(gè)16Sr組各植原體分離物的tuf基因序列進(jìn)行一致率比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，與棗瘋植原體（CP025121）一致率最高，為99.8%，與棗瘋植原體JWB-XFSZ（GU137287）和棗瘋植原體JWB-TXSZ（GU968760）tuf基因序列一致率為99.7%；而與其他組植原體一致率均小于99%。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，SCHV與屬于16SrV組的棗瘋植原體JWB-XFSZ（GU137287）、棗瘋植原體JWB-XFDO（GU968759）等聚為一簇（圖4），SCHV分離物屬于16SrV組。

3" 小結(jié)及討論

國(guó)內(nèi)1982年首次發(fā)現(xiàn)致死黃化植原體，可使櫻桃葉片黃化，櫻桃果實(shí)變小變少并且不能發(fā)育成熟，嚴(yán)重的情況下，發(fā)病2～5年后整株植株死亡［8］。隨后21世紀(jì)初陸續(xù)有關(guān)于櫻桃植原體病害被報(bào)道，2007年首次在煙臺(tái)地區(qū)發(fā)現(xiàn)櫻桃花變綠植原體，被侵染的櫻桃植株表現(xiàn)為花瓣變成綠色，節(jié)間短，不育等癥狀［10］。與櫻桃花變綠植原體癥狀相似的是櫻桃花變?nèi)~植原體的癥狀，癥狀表現(xiàn)為花器官被葉片代替，變成綠色。

山東省櫻桃植原體病害主要是櫻桃花變綠植原體和櫻桃叢枝植原體，王甲威等對(duì)山東泰安、臨沂地區(qū)的甜櫻桃叢枝病株內(nèi)檢測(cè)到了16SrV-B亞組植原體［13］。本研究在表現(xiàn)為綠變的甜櫻桃上檢測(cè)到同為16SrV-B亞組的植原體，而在煙臺(tái)地區(qū)表現(xiàn)花變綠癥狀的櫻桃上則檢測(cè)到了16SrI-B亞組植原體。

雖然國(guó)內(nèi)對(duì)櫻桃植原體病害的報(bào)道極少，但是仍有相關(guān)報(bào)道表明櫻桃植原體病害逐漸成為阻遏櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。近些年有關(guān)山東省櫻桃植原體病害被陸續(xù)報(bào)道，櫻桃花變?nèi)~、花變綠、叢枝等病害發(fā)生日漸嚴(yán)重，使櫻桃產(chǎn)量顯著降低。到目前為止，雖然還沒有相關(guān)報(bào)道表明如何才能有效地防治櫻桃植原體病害，但通過農(nóng)業(yè)防治策略，可以在一定程度上減少植原體的傳播和蔓延［14］。

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