基于CRISPR/Cas9的基因編輯及其在甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9； 基因編輯； 甘藍(lán)型油菜； 種質(zhì)資源創(chuàng)新； 作物遺傳改良

油菜是世界上最重要的油料作物之一。甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.， AACC， 2n=38）是由二倍體親本白菜（B. rapa， AA， 2n=20）與甘藍(lán)（B. olera?cea， CC， 2n=18）在距今7 500 年前通過自然雜交產(chǎn)生的異源四倍體物種，擁有復(fù)雜的基因組，包含大量重復(fù)基因。甘藍(lán)型油菜中多拷貝基因序列相似性高，阻礙了油菜基因功能研究。對油菜來說，敲除基因的所有同源拷貝是獲得可靠表型的必要條件。近幾十年來，X 射線輻射誘變等物理方法、甲基磺酸乙酯（EMS）誘變等化學(xué)方法以及T-DNA 插入等生物方法已被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究和作物育種。上述這些方法雖然能夠產(chǎn)生可遺傳的穩(wěn)定突變，但是它們誘發(fā)的突變都是隨機(jī)的。后續(xù)需要經(jīng)過耗時且費(fèi)力的大規(guī)模篩選，才能獲得有效的目標(biāo)突變體，這對于異源四倍體的油菜來說尤為不便。因此，需要尋找高效、省時、低成本、穩(wěn)定遺傳的新方法來促進(jìn)作物遺傳改良，加快種質(zhì)資源創(chuàng)新。

近幾十年來，基因編輯技術(shù)從無到有，發(fā)展迅

速。這項(xiàng)技術(shù)是在DNA 水平上對基因靶點(diǎn)進(jìn)行一系列定點(diǎn)修飾或改造，包括堿基的插入、缺失或替換。由于能實(shí)現(xiàn)對靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控，自誕生以來基因編輯技術(shù)便被廣泛地應(yīng)用于不同物種的基因組DNA 修飾。基因編輯技術(shù)主要分為3 類：鋅指核酸酶系統(tǒng)（zinc-fingers nucleases， ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器樣核酸酶系統(tǒng)（transcription activator-like effec?tor nucleases， TALENs）以及CRISPR/Cas 系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic re?peats/CRISPR-associated proteins， CRISPR/Cas）。ZFN 系統(tǒng)和TALEN 系統(tǒng)由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本高、效率低等問題迅速被簡單快捷高效的CRISPR/Cas 系統(tǒng)取代。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以縮短作物改良領(lǐng)域中基因功能鑒定和新品種選育的時間。截至目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已成功應(yīng)用于包括油菜在內(nèi)的50多種植物上［1］。本文簡要介紹了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的幾種基因編輯工具，總結(jié)了迄今為止CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在甘藍(lán)型油菜基因功能探究和遺傳改良方面的研究現(xiàn)狀和未來發(fā)展方向，以期為相關(guān)研究者快速了解該領(lǐng)域發(fā)展現(xiàn)狀提供參考。

1 基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)

1.1 CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)

經(jīng)典的CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù)效應(yīng)模塊的架構(gòu)可分為2 類：Ⅰ型和Ⅱ型（圖1A）。通常Ⅰ型CRIS?PR/Cas 系統(tǒng)通過多個效應(yīng)子的配合來發(fā)揮其DNA切割功能，基因編輯操作相對較為復(fù)雜。與之相反，Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)僅使用1 個大的效應(yīng)蛋白來進(jìn)行DNA 切割，操作更簡單。目前最常用的有CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1。

CRISPR/Cas9 屬于Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)，由兩部分組成：Cas9 蛋白和sgRNA。其工作原理是，sgRNA 通過堿基互補(bǔ)配對引導(dǎo)Cas9 蛋白靶向目標(biāo)基因特定位點(diǎn)，該位點(diǎn)被稱為PAM 位點(diǎn)（protospac?ers adjacent motif， PAM），Cas9 蛋白隨后在PAM 位點(diǎn)附近切割雙鏈DNA，造成雙鏈斷裂（DSB， doublestrandbreak）。DSB 引發(fā)細(xì)胞自損修復(fù)機(jī)制，即同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ），在修復(fù)的過程中隨機(jī)引入堿基的插入或缺失，從而在目標(biāo)基因靶點(diǎn)處產(chǎn)生隨機(jī)突變。得益于其巨大的優(yōu)勢，CRISPR/Cas9 已用于水稻、小麥、玉米、大豆和油菜等作物的遺傳改良。

1.2 堿基編輯技術(shù)

基于CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的單堿基編輯能夠以可設(shè)計的方式實(shí)現(xiàn)直接、不可逆的堿基轉(zhuǎn)換，并且不需要創(chuàng)建DSB。目前的堿基編輯器是由人工改造的Cas9 核酸酶和單鏈DNA 特異性脫氨酶組成的融合蛋白。在sgRNA 的引導(dǎo)下，d/nCas9 將脫氨酶定位到靶點(diǎn)序列，形成1 個R-loop。R-loop 內(nèi)的核苷酸充當(dāng)脫氨酶的底物，這些核苷酸的位置定義了堿基編輯的“活動窗口”。目前廣泛使用的單堿基編輯技術(shù)有2 類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE，圖1B）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base edi?tor， ABE，圖1C）。除此之外，還有在CBE 基礎(chǔ)上開發(fā)的糖基化酶堿基編輯器（glycosylase base editor，GBE，圖1D）以及將2 種不同的單堿基編輯器融合形成的雙堿基編輯器（dual base editor）。

1）胞嘧啶堿基編輯器。2016 年報道的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）是第1 個建立的基于CRISPR 的單堿基編輯系統(tǒng)［2］。在CBE 中，nCas9（D10A）與胞苷脫氨酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶（uracil DNA glyco?sylase， UNG）抑制劑（uracil DNA glycosylase inhibi?tor， UGI）形成融合蛋白。在sgRNA 的引導(dǎo)下，融合蛋白定位到靶點(diǎn)序列，在編輯窗口內(nèi)直接誘導(dǎo)C/G變成T/A。為了提高CBEs 的編輯效率，CBEs 已經(jīng)歷了從CBE1 到CBE4 共4 代的發(fā)展。最初CBE1 是由大鼠胞苷脫氨酶（rAPOBEC1）和dCas9 組成，體內(nèi)編輯效率較低，僅有7.7%；CBE2 的體內(nèi)編輯效率高達(dá)20%；CBE3 的編輯效率是CBE2 的2～6 倍；而優(yōu)化后形成的CBE4 的編輯效率又比CBE3 提高了1.5 倍，并且C 到G 或A 和indel 出現(xiàn)的頻率大大降低［2］。

2）腺嘌呤堿基編輯器。腺嘌呤堿基編輯器（ABE）于2017 年首次報道［3］。理論上ABE 可以通過用腺苷脫氨酶代替胞苷脫氨酶來產(chǎn)生。然而自然界中沒有已知的酶可以使DNA 中的腺苷脫氨基。因此，科學(xué)家將大腸桿菌tRNA 腺苷脫氨酶（ecTa?dA）改造為脫氧腺苷脫氨酶（TadA*），可以使ssDNA上的腺苷脫氨基。接下來nCas9（D10A）與腺苷脫氨酶TadA*融合形成ABE 系統(tǒng)。ABE 可以直接誘導(dǎo)A：T 到G：C 的轉(zhuǎn)換。在這些ABE 系統(tǒng)中，ABE7.10被推薦用于A/T 到G/C 的轉(zhuǎn)換，其效果已在多種細(xì)胞和生物中得到驗(yàn)證［3］。

3）糖基化酶堿基編輯器。糖基化酶堿基編輯器（GBE）于2020 年首次報道，是一種可以將C 轉(zhuǎn)換為A 或者G 的堿基編輯技術(shù)。GBE 由nCas9、胞苷脫氨酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG）組成，該系統(tǒng)在sgRNA 的引導(dǎo)下定位到靶點(diǎn)序列，UNG 將胞苷脫氨酶產(chǎn)生的U 切除，形成一個誘導(dǎo)DNA 修復(fù)機(jī)制的無嘌呤/無嘧啶（apurinic/apyrimidinic， AP）位點(diǎn)。該位點(diǎn)啟動DNA 損傷修復(fù)，從而誘導(dǎo)C 轉(zhuǎn)換為A 或者G［4］。為了進(jìn)一步提高GBE 的性能，研究人員在GBE 的基礎(chǔ)上構(gòu)建了APOBEC（R33A）-nCas9-Rad51-Ung1 的融合蛋白，并命名為GBE2.0。該編輯器能夠?qū)崿F(xiàn)更高的編輯效率（平均30.88%），同時C 到G 的轉(zhuǎn)換純度更高。

4）雙堿基編輯器。上述幾種單堿基編輯技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)單一的堿基轉(zhuǎn)換，具有局限性。為了實(shí)現(xiàn)同時產(chǎn)生不同類型的堿基轉(zhuǎn)換，研究者開發(fā)出了雙堿基編輯技術(shù)（圖2A）。該編輯器可以同時誘導(dǎo)C 到T和A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換。例如，Zhang 等［5］成功開發(fā)了一種nCas9（D10A）-NG 介導(dǎo)的高效胞嘧啶和腺嘌呤雙堿基編輯融合系統(tǒng)STCBE-2，并利用該系統(tǒng)對水稻OsEPSPS 基因編碼區(qū)和預(yù)測的草甘膦結(jié)合區(qū)域進(jìn)行近飽和突變，獲得了高抗草甘膦的水稻新型基因資源。

1.3 先導(dǎo)編輯技術(shù)

先導(dǎo)編輯器（prime editor， PE）首次報道于2019年，它可以實(shí)現(xiàn)所有12 種堿基替換，特別是堿基顛換、精確插入和刪除，而無需依賴DSB 和供體DNA。PE 由nCas9（H840A）和逆轉(zhuǎn)錄酶形成的融合蛋白以及pegRNA（prime editing guide RNA）組成（圖2B）。pegRNA 包含2 個功能部分，sgRNA 靶定位序列和逆轉(zhuǎn)錄模板（reverse transcription template， RTT）。RTT 包括引物結(jié)合位點(diǎn)和編碼突變信息的位點(diǎn)。當(dāng)PE 系統(tǒng)融合蛋白錨定到靶位點(diǎn)時，nCas9 切割非互補(bǔ)鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶通過RTT 逆轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的含突變位點(diǎn)的ssDNA，然后通過DNA 修復(fù)將突變整合到受體基因組中。為了提高其效率和準(zhǔn)確性，研究者在PE的基礎(chǔ)上開發(fā)了PE2、PE3、PE3b3、PE4、PE5 和PEmax 共6 種編輯器［6］。最近，Sun 等［7］建立了一種在染色體上精確插入大片段DNA 的先導(dǎo)編輯技術(shù)PrimeRoot，能夠?qū)⒏哌_(dá)11.1 kb 的大片段DNA 精確插入植物基因組中，效率達(dá)到6.3%。

2 基因編輯技術(shù)在甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9 在甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用

甘藍(lán)型油菜是一種經(jīng)濟(jì)價值高、用途廣泛的油料作物。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可在甘藍(lán)型油菜中實(shí)現(xiàn)1 個或多個基因的有效突變，產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的突變體。后續(xù)通過雜交分離出無T-DNA 的基因編輯植株。目前油菜中的基因編輯主要是利用CRISPR/Cas9 進(jìn)行基因功能的鑒定與優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新［ 8］，包括油菜產(chǎn)量、含油量和脂肪酸組成、宜機(jī)收、粒色花色、開花時間和花發(fā)育、育性、營養(yǎng)成分、生物和非生物脅迫耐受性等性狀。

1）產(chǎn)量相關(guān)性狀。產(chǎn)量相關(guān)性狀一直是作物育種中重點(diǎn)關(guān)注的性狀之一，種子大小、每角果粒數(shù)和單株角果數(shù)與油菜產(chǎn)量密切相關(guān)。Yang 等［9］敲除了CLV-WUS 通路中的BnCLV1（CLAVATA1）、Bn?CLV2 和BnCLV3，每個基因均獲得了雙拷貝純合突變體。其中BnCLV3 的雙拷貝突變體每角果粒數(shù)和千粒重增加，可能有助于增加種子產(chǎn)量。Khan 等［10］敲除了BnEOD3（ENHANCER3 OF DA1）的4 個同源拷貝，觀察到突變體種子變小，每角果粒數(shù)增加，4拷貝突變體的單株產(chǎn)量平均提高了13.9%。Wang等［11］敲除了2 種調(diào)控花粉管引導(dǎo)性的天冬氨酸蛋白酶基因BnAP36s（ASPARTATE PROTEASES 36）和BnAP39s，突變體的結(jié)實(shí)率分別降低了50% 和60%，由此導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。

株型，包括株高、分枝數(shù)和葉形等性狀，也是影響產(chǎn)量的相關(guān)性狀。Zheng 等［12］敲除BnMAX1（MORE AXILLARY GROWTH 1）獲得了分枝數(shù)增加的半矮化突變體。Stanic 等［13］敲除獨(dú)腳金內(nèi)酯受體基因BnD14 獲得了分枝數(shù)和花器官增加、植株矮化的突變體。Fan 等［14］敲除BnBP（BREVIPEDI?CELLUS）基因發(fā)現(xiàn)BnBP.A03 和BnBP.C03 突變后植株均變矮，株型變緊湊，它們的雙拷貝突變體極度矮化并且不育。Song 等［15］敲除BnBRI1（BRASSI?NOSTEROID INSENSITIVE 1）產(chǎn)生了半矮株系，但對產(chǎn)量無影響。甘藍(lán)型油菜存在廣泛的葉形多樣性，包括邊緣完整的不裂葉、邊緣鋸齒狀的淺裂葉以及裂葉。油菜的裂葉已被證實(shí)是高密度種植和雜交生產(chǎn)的理想性狀。Hu 等［16-17］通過敲除裂葉親本的BnA10.LMI1（LATE MERISTEM IDENTITY 1）和BnA10.RCO（REDUCED COMPLEXITY），產(chǎn)生了不裂葉和淺裂葉的突變體，驗(yàn)證了BnA10.LMI1 和BnA10.RCO 正向調(diào)控甘藍(lán)型油菜葉形的發(fā)育。

2）含油量和脂肪酸組成。提高油菜種子含油量和改善脂肪酸組成一直是油菜育種的2 個關(guān)鍵目標(biāo)。敲除BnSFAR4/5（SEED FATTY ACID REDUC?ER 4/5）、BnFAX1（FATTY ACID EXPORTER 1）和BnCIPK9 （CALCINEURIN B-LIKE INTER?ACTING PROTEIN KINASE 9）基因可以提高種子含油量［18-20］，而敲除BnLPAT2/5（LYSOPHOS?PHATIDIC ACID ACYLTRANSFERASE 2/5）和BnBASS2（BILE ACID SODIUM SYMPORTERFAMILY PROTEIN 2）種子含油量會降低［21-22］。脂肪酸組成是決定菜籽油品質(zhì)的關(guān)鍵因素，脂肪酸去飽和酶基因BnFAD2（FATTY ACID DESATU?RASE 2）是影響脂肪酸3 種主要成分油酸、亞油酸和亞麻酸組成和比例的關(guān)鍵基因。敲除BnFAD2 后種子中油酸的含量提高，亞油酸和亞麻酸的含量相應(yīng)降低［23］。Yan 等［24］敲除BnLEC1（LEAFY COTY?LEDON 1）后，突變體種子含油量和油酸含量降低，亞油酸含量提高。磷酸烯醇丙酮酸/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（phosphoenolpyruvate/phosphate translocator， PPT）將磷酸烯醇丙酮酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中，用于脂肪酸（FA）和其他代謝物的生物合成。敲除BnPPT1后，植株生長緩慢，葉片變黃，種子含油量也下降了2.2%～9.1%［25］。

3）抗裂莢性狀。油菜角果成熟易開裂的特性是造成田間產(chǎn)量損失的主要原因。Braatz 等［26］敲除BnALC （ALCATRAZ）基因發(fā)現(xiàn)突變體角果抗裂。Zaman 等［27］敲除BnJAG （JAGGED）的5 個同源拷貝，發(fā)現(xiàn)其中BnJAG.A08 拷貝突變后角果抗裂性能提高了2 倍。Zhai 等［28］敲除BnIND （INDEHIS?CENT）的2 個同源拷貝，發(fā)現(xiàn)BnIND.A03 單拷貝突變體和BnIND.A03/C03 雙拷貝突變體的角果均顯著抗裂。Zaman 等［29］敲除BnSHP1/2 （SHATTER?PROOF1/2）的所有同源拷貝，其中BnSHP1.A09、BnSHP1. A04、BnSHP1. C04-A、BnSHP2. C04-B 和BnSHP2.A05 5 個拷貝突變體表現(xiàn)出明顯的角果抗裂性。

4）粒色、花色、葉色等色澤相關(guān)性狀。油菜的黃籽性狀是一種優(yōu)良表型，與黑籽相比，具有種皮薄、原花青素含量低、油脂和蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)點(diǎn)。目前已知通過敲除類黃酮途徑的關(guān)鍵基因獲得黃籽突變體的基因有BnTT2 （TRANSPARENT TESTA2）、BnTT4、BnTT8 以及BnPAP2 （PRODUCTIONOF ANTHOCYANIN PIGMENT 2），上述突變體均可提高種子含油量并改善脂肪酸組成［30-33］。

油菜花具有重要的觀賞價值，花色是油菜遺傳育種中備受關(guān)注的問題。與黃籽性狀不同，甘藍(lán)型油菜的花色是由類胡蘿卜素含量決定的，敲除參與類胡蘿卜素生物合成的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因BnZEP （ZEAXANTHIN EPOXIDASE），得到的Bna09.zep/Bnc09.zep 雙突變體呈現(xiàn)出橘色花瓣［34］。而敲除類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因BnCRTISO（CA?ROTENOID ISOMERASE），得到花瓣乳白色、葉片淡黃色的突變體［35］。

葉色主要與葉綠體的發(fā)育相關(guān)，Liu 等［36］敲除參與葉綠體發(fā)育的基因BnYCO （YELLOWCOTYLEDON）后，其突變體子葉黃化、真葉失綠。Xu 等［37］敲除與光合系統(tǒng)PSⅡ周期修復(fù)循環(huán)有關(guān)的基因BnFtsH1，突變體子葉黃化、生物量積累降低。

5）開花時間和花發(fā)育。油菜開花時間不僅影響油菜產(chǎn)量，還會影響下茬作物的播期，因此適宜的花期也是油菜育種的重要目標(biāo)。TERMINAL FLOW?ER 1（TFL1）是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphati?dylethanolamine-binding protein， PEBP）家族成員，在高等植物的花分生組織決定和開花時間調(diào)控中起重要作用。Sriboon 等［38］敲除BnTFL1 的5 個拷貝，發(fā)現(xiàn)只有BnC03.TFL1 的突變體具有早花表型。Ji?ang 等［39］敲除組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因BnS?DG8（ SET DOMAIN GROUP 8），發(fā)現(xiàn)BnSDG8.A/C 功能缺失突變體植株開花時間提前。Ahmar 等［40］敲除BnSVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）的所有拷貝得到不同拷貝組合的突變體，開花時間平均縮短了40.6%～50.7%。COL9 （CONSTANSlike9） 作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，控制著許多不同植物的生長發(fā)育。Guo 等［41］敲除油菜BnCOL9的4 個拷貝，得到的突變體具有早花表型。Li 等［42］敲除BnSPL3 （SQUAMOSA PROMOTER BIND?ING PROTEIN-LIKE 3）后，突變體發(fā)育遲緩，開花延遲。

許多蕓薹屬作物的產(chǎn)量經(jīng)常受到花器官發(fā)育異常的阻礙。然而，這些異常花器官的分子機(jī)制尚不清楚。APETALA2 （AP2）作為植物ABCE 模型中的A 類基因，調(diào)控著花器官的發(fā)育。Zhang 等［43］敲除BnAP2，發(fā)現(xiàn)4 拷貝突變體出現(xiàn)萼片-心皮修飾表型。

6）育性。自交不親和（self incompatibility， SI）是雌雄同體被子植物通過排斥自交花粉來阻止近親交配的遺傳機(jī)制，自交不親和株系有利于雜種優(yōu)勢的利用。通過敲除BnMLPK （M-LOCUS PROTEINKINASE） 和BnARC1 （ARM-REPEAT-CON?TAINING PROTEIN 1），油菜自交不親和性被完全抑制，自花授粉后種子比野生型顯著增加［44］。與此相反的是，敲除BnA5.ZML1 和BnS6-SMI2 （SCRmethylation-inducing region 2），油菜自交不親和性增強(qiáng)［45-46］。

雄性不育是提高作物產(chǎn)量最有效的雜種優(yōu)勢技術(shù)之一。Xin 等［47］敲除BnMS5a （MALE STERILI?TY 5）或BnMS5c，均會導(dǎo)致雄性不育，證明恢復(fù)等基因MS5a 和維持等位基因MS5c 都是甘藍(lán)型油菜雄性育性所必需的。Farooq 等［48］敲除BnRFL11（RESTORATION OF FERTILITY-LIKE 11），bn?rfl11 表現(xiàn)出營養(yǎng)缺陷，包括分枝減少和葉片變小，同時也表現(xiàn)出雄性不育。細(xì)胞色素P450（ CYP450）單加氧酶超家族在植物生長發(fā)育中起著重要作用。Wang 等［49］敲除BnCYP704B1，編輯后的單株在成熟花藥中表現(xiàn)出無花粉、不育的表型。

7）營養(yǎng)成分。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，消除或降低油菜籽中硫苷的含量是提高飼料和食品價值的必要條件。敲除硫代葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BnGTR2（ GLUCOSINO?LATE TRANSPORTER 2），種子硫苷含量顯著降低［50- 51］。植酸 （phytic acid， PA），同樣是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。 Sashidhar 等［52］通過敲除PA 生物合成的關(guān)鍵基因BnITPK （INOSITOL TETRAKISPHOS?PHATE KINASE）的3 個拷貝，得到低植酸的突變體。生育酚，即維生素E，是人體健康必不可少的營養(yǎng)素。Zhang等［53］通過敲除BnVTE4（ VITAMIN EDEFICIENT 4），突變體的α-生育酚含量降低。

油菜在生長過程中會從土壤中吸收多種營養(yǎng)元素，營養(yǎng)元素在植物的生命代謝中各自有不同的生理功能，相互間是不可代替的。硼（B）在細(xì)胞壁形成、花粉管生長、膜完整性、固氮、糖轉(zhuǎn)運(yùn)和植物代謝中起著關(guān)鍵作用。Feng 等［54］ 敲除BnA09.WRKY47，突變體對低硼脅迫更敏感，而BnA09.WRKY47 的過表達(dá)系對低磷脅迫耐受。甘藍(lán)型油菜是一種鎘（Cd）超富集植物，對食品和飼料安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。Yao 等［55］敲除BnCUP1 （Cd UPTAKERELATED1），突變體降低了油菜植株體內(nèi)鎘的積累。磷（P）缺乏是影響油菜根系生長發(fā)育的主要環(huán)境因素。Xu 等［56］敲除BnGPR1 （GLYCINE-RICHPROTEIN 1），突變體植株對低磷脅迫更敏感，但是過表達(dá)系表現(xiàn)出對低磷脅迫的耐受性。

8）生物和非生物脅迫耐受性。油菜在生長發(fā)育過程中會受到生物和非生物脅迫的考驗(yàn)。油菜菌核病是油菜的一種重要病害，通常會導(dǎo)致5%～100%的田間產(chǎn)量損失。Sun 等［57］發(fā)現(xiàn)敲除BnWRKY70的3 個同源拷貝，突變體對菌核病的抗性增強(qiáng)。Cao等［58］ 敲除BnF5H （FERULATE-5-HYDROXY?LASE）后，突變體的莖桿強(qiáng)度增加，莖葉對菌核病的抗性增強(qiáng)。Zhang 等［59］編輯BnQCR8 的1 個或多個拷貝，獲得的突變體均對菌核病和灰霉病具有較強(qiáng)的抗性，并且主要的農(nóng)藝性狀與野生型沒有顯著差異。Geng 等［60］敲除BnIDA （INFLORESCENCEDEFICIENT IN ABSCISSION），突變體表現(xiàn)出角果抗裂、花器官不脫落、抗菌核病等優(yōu)良特性。Zhang等［61］ 敲除BnMPK3 （MITOGEN-ACTIVATEDPROTEIN KINASE 3）后，突變體菌核病抗性降低，但其過表達(dá)系對菌核病的抗性增強(qiáng)。Probsting 等［62］敲除BnCRT1a（ CALRETICULIN1a）后突變體降低了對黃萎病的敏感性。

油菜生長過程中大部分時期對缺水十分敏感，因此，培育抗旱油菜品種至關(guān)重要。Wu 等［63］敲除BnRGA （REGULATORS OF GA）的4 個拷貝，發(fā)現(xiàn)BnA06.RGA 的突變體BnA6.rga-D 抗旱性增強(qiáng)。Linghu 等［64］敲除U-box E3 泛素連接酶基因Bn?PUB18/19（ Plant U-box 18/19），突變體耐旱性顯著提高。而Liu 等［65］敲除BnSGI （STRESS ANDGROWTH INTERCONNECTOR）后，突變體對干旱脅迫變得更敏感。Song 等［66］敲除BnHOS1（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RE?SPONSIVE GENES 1）增強(qiáng)了油菜耐寒性。

9）其他。擬南芥同源域轉(zhuǎn)錄因子STM（SHOOT MERISTEMLESS ）對于莖尖分生組織功能至關(guān)重要，它與CLV3 （ CLAVATA3）/WUS（WUSCHEL ）反饋調(diào)節(jié)通路配合維持莖尖分生組織中干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。Yu 等［67］敲除BnSTM，突變體出現(xiàn)莖頂端發(fā)育異常、子葉柄融合的表型。通過敲除質(zhì)體核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BnNTT1 （NUCLEO?TIDE TRIPHOSPHATE TRANSPORTER 1）和BnNTT2，突變體均生長遲緩、類囊體發(fā)育異常以及光合效率低下［68- 69］。Wang 等［70］敲除淀粉分支酶基因BnSBE （STARCH BRANCHING ENZYMES） 6拷貝突變體中淀粉結(jié)構(gòu)改變。

2.2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的其他編輯技術(shù)在甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9 已成熟地用于甘藍(lán)型油菜基因功能研究和種質(zhì)資源創(chuàng)新，同時堿基編輯技術(shù)（CBE、ABE）以及病毒介導(dǎo)的定點(diǎn)插入等基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)也在甘藍(lán)型油菜中有成功應(yīng)用。

Cheng 等［71］在甘藍(lán)型油菜中建立并開發(fā)了由人A3A 胞苷脫氨酶與Cas9 切口酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合組成的A3A-PBE 系統(tǒng)。設(shè)計了3 種sgRNA 分別靶向ALS （ACETOLACTATE SYN?THASE）、RGA和IAA7（ INDOLE-3-ACETIC AC?ID 7）基因。所有3 個目標(biāo)基因的堿基編輯效率均超過20%。Hu 等［72］對4 個CBE 系統(tǒng)進(jìn)行了改造，實(shí)現(xiàn)油菜中5 個靶基因的胞苷堿基編輯。結(jié)果表明，3 個CBE 系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)基因組編輯，其中BnA3A1-PBE與之前報道的油菜CBE 系統(tǒng)相比，具有最高的堿基編輯效率（最高達(dá)50.5%）。BnA06.RGA 和BnALS靶位點(diǎn)發(fā)生的胞苷取代可穩(wěn)定遺傳，分別為矮化表型和用于雜草控制的除草劑抗性。Wu 等［73］利用CBE 編輯BnALS1 和BnALS3，但在T1 代僅得到BnALS1 的編輯單株，賦予了油菜苯磺隆抗性。

最近開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）能夠在高等植物真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效、精確的A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換。Kang 等［74］證明ABE 系統(tǒng)可以通過瞬時轉(zhuǎn)染成功應(yīng)用于擬南芥和甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化成功應(yīng)用于植物。在FLOW?ERING LOCUS T（ FT）蛋白中進(jìn)行A到G替換，產(chǎn)生單個氨基酸變化或PHYTOENE DESATU?RASE 3（ PDS3）的RNA轉(zhuǎn)錄本的錯誤剪接，從而獲得分別具有晚花和白化表型的轉(zhuǎn)基因植物。Hu等［75］改造了4 個ABE 骨架，分別針對BnPDS、BnALS 等9 個基因設(shè)計了18 個sgRNA 進(jìn)行不同ABE 系統(tǒng)的效率測試，在甘藍(lán)型油菜中創(chuàng)建了有效的ABE 單堿基編輯系統(tǒng)。

油菜在種植過程中經(jīng)常受到雜草的影響，培育抗除草劑品種是應(yīng)對雜草威脅的有效途徑。草甘膦對大面積的雜草防治非常有效，對環(huán)境的危害很小。但由于其對油菜的毒性，很少直接用于油菜田。研究表明，在不同植物中，烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的草甘膦結(jié)合位點(diǎn)突變賦予了對草甘膦的抗性。Wang 等［76］為了在甘藍(lán)型油菜中實(shí)現(xiàn)有效的基因替換，采用了表達(dá)由來自銅綠假單胞菌的CRIS?PR 相關(guān)RNA 內(nèi)切核糖核酸酶Csy4 切割的單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在內(nèi)源性甘藍(lán)型油菜EPSPS 基因BnC04.EPSPS 中實(shí)現(xiàn)了精確的基因替換，氨基酸替換頻率高達(dá)20%。含有這些基因替換的油菜苗具有較強(qiáng)的草甘膦耐受性。

綜上所述，目前已有大量研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)及其介導(dǎo)的ABE 和CBE 技術(shù)進(jìn)行油菜基因功能鑒定與優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新，從多個方面改良了油菜種質(zhì)資源，我們從產(chǎn)量等9 個方面進(jìn)行分類和匯總（表1）。

3 展望

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)顯示出強(qiáng)大的、特異的、多重基因組編輯的能力，已廣泛用于油菜重要性狀的基礎(chǔ)研究和遺傳改良。但CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些，未來該技術(shù)在油菜中應(yīng)該會有更廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 采用更加精確且多功能的基因編輯工具

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)雖然在油菜中已經(jīng)建立了成熟的體系，但是大部分在油菜中的應(yīng)用都是產(chǎn)生功能缺失突變體。然而許多有價值的性狀是由單核苷酸多態(tài)性或者是精確設(shè)計的indel 賦予的。因此，利用遺傳多樣性和精確修改基因組對于作物育種非常重要。到目前為止，除了CBE 和ABE 在油菜上有初步應(yīng)用外，其他精確的基因編輯例如GBE、雙堿基編輯以及先導(dǎo)編輯PE 均未在油菜中成功實(shí)現(xiàn)。如果能將這些精確且多功能的技術(shù)應(yīng)用于油菜中，將會極大地提高基因編輯對油菜遺傳改良的有效性。

3.2 突破油菜遺傳轉(zhuǎn)化受體限制

目前為止，CRISPR/Cas9 在油菜中的應(yīng)用主要依靠農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化來傳遞CRISPR 載體。然而，一些優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜品種往往由于缺乏適合再生的性狀而不易轉(zhuǎn)化。目前報道的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的油菜品種有春性品種和半冬性品種，其中春性品種有Westar、862、Haydn 等，半冬性品種有J9707、J9712、ZS6 等。除此之外，對于那些難以轉(zhuǎn)化的商品油菜品種，可以通過利用形態(tài)發(fā)生基因打破遺傳轉(zhuǎn)化的受體限制，玉米中已經(jīng)成功利用形態(tài)發(fā)生基因WUS2 和BBM 實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。在過去的30 a 里，基礎(chǔ)研究為我們提供了關(guān)于控制形態(tài)發(fā)生基因的詳細(xì)資料。這些見解將繼續(xù)為測試形態(tài)發(fā)生基因提供靈感，并與控制表達(dá)的新方法一起，將導(dǎo)致不斷改進(jìn)，擴(kuò)大適合轉(zhuǎn)化的不同油菜品種的范圍。此外，組織培養(yǎng)過程通常在技術(shù)上要求很高，耗時且費(fèi)力。因此，開發(fā)無需組織培養(yǎng)的遞送方法，如納米顆?；虿《具f送，將有助于進(jìn)一步擴(kuò)大CRIS?PR/Cas9 在油菜中的應(yīng)用。

3.3 利用CRISPR/Cas9 在油菜中構(gòu)建全基因組突變體文庫

CRISPR/Cas9 技術(shù)的高效率非常適合在各種生物體和細(xì)胞類型中進(jìn)行高通量基因編輯。由于CRISPR/Cas9 的靶向特異性是由1 個20 bp 的sgRNA 賦予的，因此可以很容易地大規(guī)模地基于陣列合成寡核苷酸文庫。這種強(qiáng)大的基因組級CRIS?PR/Cas9 誘變系統(tǒng)已經(jīng)成功地用于水稻和玉米的研究。例如，Lu 等［77］利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在水稻中進(jìn)行基因組規(guī)模的誘變，并生成了靶向功能缺失突變體文庫，為水稻研究和育種提供了有用的資源。Liu 等［78］將基于CRISPR/Cas9 的多重高通量靶向誘變與遺傳定位和基因組學(xué)方法相結(jié)合，成功靶向了743 個與農(nóng)藝和營養(yǎng)性狀相關(guān)的候選基因。最近，He等［79］使用CRISPR 混合文庫在甘藍(lán)型油菜異源四倍體作物中實(shí)現(xiàn)基因組規(guī)模的靶向編輯，總共設(shè)計了18 414 個sgRNA 來靶向10 480 個感興趣的基因，隨后獲得了1 104 株含有1 088 個sgRNA 的再生轉(zhuǎn)基因植物，編輯結(jié)果顯示，178 個基因中有93 個被鑒定為突變，編輯效率為52.2%。由此可見，利用CRISPR/Cas9 實(shí)現(xiàn)高通量的靶向基因編輯，篩選大規(guī)模突變文庫，將是發(fā)現(xiàn)改善油菜品種目標(biāo)性狀新基因的良好途徑。

3.4 基因編輯技術(shù)應(yīng)用的前提條件和限制因子

雖然CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)以其簡單、高效的獨(dú)特優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于油菜的基因功能研究和遺傳改良，但是關(guān)于基因編輯技術(shù)的使用并非毫無限制。其使用的前提條件，一是需要對目標(biāo)基因組有深入的了解，包括基因的功能和調(diào)控機(jī)制；二是需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和操作規(guī)范，以確?；蚓庉嫷臏?zhǔn)確性和安全性。

基因編輯技術(shù)并不是萬能的，它同樣具備一些限制因子：（1）細(xì)胞類型和組織的可編輯性。不同類型的細(xì)胞和組織基因編輯的可行性不同，有些細(xì)胞和組織基因編輯的效率較低；（2）基因編輯的準(zhǔn)確性和安全性。基因編輯可能面臨脫靶風(fēng)險或其他不良影響，需要確保編輯的準(zhǔn)確性和安全性；（3）道德和倫理問題。基因編輯涉及到生命和遺傳信息的改變，需要考慮道德和倫理問題，以及相關(guān)的法律法規(guī)。