黃柏堿對高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞自噬和凋亡影響

［摘要］ 目的

探討黃柏堿對高糖（HG）誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞（LEC）自噬和凋亡的影響及機制。

方法 將HLEB3細胞隨機分為對照組（A組）、HG組（B組）、黃柏堿組（C組）、Compound C（AMPK抑制劑）組（D組）。應(yīng)用CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞術(shù)測定細胞凋亡，活性氧熒光探針（DCFH-DA）法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）含量，ELISA試劑盒檢測細胞內(nèi)丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，Western blot法檢測Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表達。

結(jié)果 5 mg/L為黃柏堿對HLEB3細胞最佳作用濃度。與A組比較，B組細胞活力、自噬體數(shù)量以及SOD、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2、p-AMPK/AMPK水平顯著降低（F=30.857～213.971，P＜0.001），細胞凋亡率及ROS、MDA、Bax、p-mTOR/mTOR水平顯著升高（F=19.111～156.780，P＜0.001）；與B組相比，C組細胞活力、自噬體數(shù)量以及SOD、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2、p-AMPK/AMPK水平顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率及ROS、MDA、Bax、p-mTOR/mTOR水平顯著降低（P＜0.05）；Compound C可逆轉(zhuǎn)黃柏堿對HLEB3細胞自噬和凋亡的改善作用（P＜0.05）。

結(jié)論 黃柏堿能減少HG誘導(dǎo)的LEC氧化應(yīng)激和凋亡，促進細胞自噬，其作用機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 黃柏；晶體；上皮細胞；自噬；細胞凋亡；AMP活化蛋白激酶激酶類；TOR絲氨酸-蘇氨酸激酶

［中圖分類號］ R285.5;R776.1

［文獻標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0673-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.170

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241127.0920.005;2024-11-28 09：37：47

Effect of phellodendrine on the autophagy and apoptosis of lens epithelial cells induced by high glucose

LI Chengmao， WU Xiaoyu， LI Weina

（Ophthalmology Department， 910 Hospital of the Joint Support Force of the People’s Liberation Army of China， Quanzhou 362000， China）

［Abstract］Objective To investigate the effect of phellodendrine on the autophagy and apoptosis of lens epithelial cells （LECs） induced by high glucose （HG） and its mechanism.

Methods HLEB3 cells were randomly divided into control group （group A）， HG group （group B）， phellodendrine group （group C）， and Compound C （AMPK inhibitor） group （group D）. CCK-8 assay was used to measure cell viability; flow cytometry was used to measure cell apoptosis; the DCFH-DA probe was used to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in cells; ELISA kits were used to measure the levels of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD）; Western blot was used to measure the protein expression levels of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2 related X gene （Bax）， Beclin-1， microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ （LC3-Ⅱ）， microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ （LC3-Ⅰ）， AMP-activated protein kinase （AMPK）， phosphorylated AMPK （p-AMPK）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， and phosphorylated mTOR （p-mTOR）.

Results The results showed that 5 mg/L phellodendrine was the best concentration for the culture of HLEB3 cells. Compared with group A， group B had significant reductions in cell viabi-

lity， the number of autophagosomes， and the levels of SOD， Beclin-1， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ， Bcl-2， and p-AMPK/AMPK （F=30.857-213.971，Plt;0.001） and significant increases in cell apoptosis rate and the levels of ROS， MDA， Bax， and p-mTOR/mTOR （F=19.111-156.780，Plt;0.001）. Compared with group B， group C had significant increases in cell viability， the number of autophagosomes， and the levels of SOD， Beclin-1， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ， Bcl-2， and p-AMPK/AMPK （Plt;0.05） and significant reductions in cell apoptosis rate and the levels of ROS， MDA， Bax， and p-mTOR/mTOR （Plt;0.05）. The AMPK inhibitor Compound C could reverse the effect of phellodendrine in improving the autophagy and apoptosis of HLEB3 cells （Plt;0.05）.

Conclusion Phellodendrine can reduce the oxidative stress and apoptosis of LEC induced by HG and promote autophagy， possibly by re-

gulating the AMPK/mTOR signaling pathway.

［Key words］ phellodendri chinensis cortex; lens， crystalline; epithelial cells; autophagy; apoptosis; AMP-activated protein kinase kinases; TOR serine-threonine kinases

糖尿病性白內(nèi)障（DC）是糖尿病的主要并發(fā)癥，會導(dǎo)致視力障礙或失明［1-3］。高糖（HG）在DC的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并可通過誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞（LEC）的凋亡和氧化應(yīng)激引發(fā)晶狀體混濁［4-6］。在特定的條件下，自噬可以抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激，清除LEC蛋白和降解的細胞器，維持晶狀體的透明度［7-8］。因此，探索DC的發(fā)病機制對尋找有效的治療方法至關(guān)重要。黃柏堿具有降血糖、抗氧化、抗炎、降壓以及免疫調(diào)節(jié)等作用［9］，它可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路對抗糖尿病［10］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可調(diào)節(jié)細胞和器官的生長，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是AMPK的關(guān)鍵下游靶標(biāo)，可以調(diào)節(jié)細胞翻譯、轉(zhuǎn)錄和自噬，AMPK信號通路參與調(diào)控DC的自噬［11-13］。此外，黃柏堿通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路促進自噬［14-16］。目前尚不清楚黃柏堿是否能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路影響HG誘導(dǎo)的LEC自噬和凋亡。本研究探討了黃柏堿對HG誘導(dǎo)的LEC自噬和凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

人LEC（HLEB3細胞系，美國ACCT細胞庫）；黃柏堿（純度≥98%，成都植標(biāo)化純生物有限公司）；DCFH-DA試劑盒以及Compound C（美國MedChemExpress公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）；胎牛血清（FBS）、DEME培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；細胞計數(shù)（CCK-8）檢測試劑盒、AnnexinV-FITC/PI檢測試劑盒（上海碧云天公司）；一抗蛋白B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、自噬蛋白Beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅰ/Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和內(nèi)參β-actin抗體（美國賽默飛公司）；二抗山羊抗兔IgG（南京建成生物工程研究所）。流式細胞儀（北京安諾倫公司）；透射電子顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；全自動酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HLEB3細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2和體積分數(shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。當(dāng)細胞復(fù)蘇至80%時，用胰酶消化傳代，每隔2～3 d傳代1次。將復(fù)蘇后的HLEB3細胞分為對照組（5.5 mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)）和HG組（30.0 mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)），分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 黃柏堿最佳濃度篩選 取對數(shù)生長期的對照組HLEB3細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種至96孔板中，使用不同濃度的黃柏堿（0、1、3、5、7、9 mg/L）培養(yǎng)24 h；處于對數(shù)生長期的HG組HLEB3細胞處理同對照組，后在30.0 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。每組重復(fù)3次，細胞處理完成后，每孔加入100 g/L CCK-8溶液（10 μL）在37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處的吸光度值，計算細胞活力。篩選出黃柏堿最佳濃度用于后續(xù)實驗。

1.2.3 實驗分組 將HLEB3細胞分為對照組（A組）、HG組（B組）、黃柏堿組（C組）、Compound C（AMPK抑制劑）組（D組）。其中黃柏堿組細胞用篩選出的最佳濃度（5 mg/L）的黃柏堿處理24 h，在30.0 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；Compound C組細胞用10 mmol/L Compound C［17］和5 mg/L黃柏堿培養(yǎng)24 h，后在30.0 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 取各組細胞以每孔1×103個細胞密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。然后每孔加入100 g/L CCK-8溶液（10 μL）在37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處的吸光度值，計算細胞活力。每組重復(fù)3次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組細胞以每孔1×105個細胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。

按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書逐步進行染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 將各組細胞置25 g/L戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，后在室溫下固定、脫水，環(huán)氧樹脂包埋處理，切片染色，并在透射電鏡下觀察拍照。

1.2.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 對各組細胞ROS、MDA、SOD水平進行檢測，采用活性氧熒光探針（DCFH-DA）法檢測細胞內(nèi)ROS含量，并在熒光顯微鏡下觀察拍照；MDA、SOD水平按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 將各組細胞破碎后提取總蛋白，用BCA試劑盒進行濃度定量，按步驟將蛋白SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR（1∶2 000）和β-actin過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶1 000），孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶的灰度值應(yīng)用Image J軟件處理分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以±s形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 黃柏堿最佳濃度篩選

在對照組HLEB3細胞中，與0 mg/L黃柏堿相比，1、3、5 mg/L黃柏堿干預(yù)對細胞活力無顯著影響（P＞0.05），7、9 mg/L黃柏堿干預(yù)顯著抑制細胞活力（F=38.422，P＜0.001）。見圖1。在HG誘導(dǎo)HLEB3細胞中，與0 mg/L黃柏堿相比較，1、3、5、7、9 mg/L黃柏堿干預(yù)顯著提高了細胞活力（F=55.220，P＜0.001），其中5 mg/L黃柏堿的干預(yù)效果最顯著，故選擇5 mg/L作為黃柏堿后續(xù)實驗濃度。見圖2。

2.2 各組細胞活力比較

A～D組細胞活力分別為（100.00±0）%、（38.65±4.01）%、（83.07±8.26）%和（42.07±4.38）%，4組比較差異有顯著性（F=213.971，P＜0.001）。與A組相比，B組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組細胞活力顯著升高（P＜0.05）；與C組相比，D組細胞活力顯著降低（P＜0.05）。

2.3 各組細胞凋亡率及凋亡蛋白表達比較

本文4組細胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白表達比較，差異均有顯著性（F=19.111～156.780，P＜0.001）。與A組相比，B組細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高（Plt;0.05）；與C組相比，D組細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、4和表1。

2.4 各組細胞自噬情況比較

本文4組細胞自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=48.125、48.467，P＜0.001）。與A組相比，B組自噬體數(shù)量減少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組自噬體數(shù)量增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高（P＜0.05）；與C組相

比，D組自噬體數(shù)量減少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05）。見圖5、6和表2。

2.5 各組細胞氧化應(yīng)激程度比較

本文4組細胞ROS、MDA、SOD水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=101.650～106.693，P＜0.001）。與A組相比，B組細胞ROS、MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組ROS、MDA水平顯著降低，SOD水平顯著升高（P＜0.05）；與C組相比，D組ROS、MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低（P＜0.05）。見圖7、表3。

2.6 各組細胞AMPK/mTOR通路蛋白表達比較

本文4組細胞的p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK水平比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=33.882、30.857，Plt;0.001）。與A組相比，B組細胞p-mTOR/mTOR顯著升高，p-AMPK/AMPK顯著降低（Plt;0.05）；與B組相比，C組細胞p-mTOR/mTOR顯著降低，p-AMPK/AMPK顯著升高（Plt;0.05）；與C組相比，D組細胞p-mTOR/mTOR顯著升高，p-AMPK/AMPK顯著降低（Plt;0.05）。見圖8、表4。

3 討 "論

LEC是晶狀體代謝中最活躍的成分，可以產(chǎn)生晶狀體纖維，維持整個晶狀體的新陳代謝和透明度［18-19］。HG環(huán)境可通過改變晶狀體滲透壓引起LEC氧化應(yīng)激失調(diào)和自噬，導(dǎo)致細胞凋亡和白內(nèi)障［20-22］。因此，探討HG誘導(dǎo)LEC損傷的機制對DC的預(yù)防和治療具有重要意義。本研究以人LEC的HLEB3細胞系作為研究對象，結(jié)果顯示，HG誘導(dǎo)的細胞活力和自噬水平顯著下降，凋亡率和凋亡蛋白增加，并發(fā)生氧化應(yīng)激。提示HG環(huán)境導(dǎo)致LEC氧化損傷、細胞凋亡和自噬抑制，從而導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。自噬對于維持細胞、組織和器官的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，包括在眼睛的角膜、視網(wǎng)膜和晶狀體中

發(fā)揮重要作用［23-24］。其中，LEC和纖維細胞中自噬通量受損可能導(dǎo)致先天性白內(nèi)障、年齡相關(guān)性白內(nèi)障和DC的形成［25-27］。LC3-Ⅱ蛋白是在自噬體形成過程中通過可溶性LC3-Ⅰ與脂質(zhì)成分結(jié)合產(chǎn)生的，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是早期自噬活性的指標(biāo)；Beclin-1是Ⅲ類磷酸肌醇3激酶復(fù)合物的組成成分，是自噬的主要調(diào)節(jié)因子［28-29］。在HG條件下，LEC自噬的表達受到抑制。本研究結(jié)果顯示，HG組細胞自噬體數(shù)量減少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著降低，提示HG可抑制LEC自噬。

HG可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并降低LEC的抗氧化能力，導(dǎo)致DC形成［30-32］。其中，HG導(dǎo)致氧化還原失衡，產(chǎn)生過量的ROS，造成生物膜脂質(zhì)氧化產(chǎn)生MDA；SOD屬于抗氧化酶，可減輕細胞損傷［33-34］。此外，細胞的增殖和凋亡受自噬的影響。在應(yīng)激條件下，自噬可以通過維持細胞穩(wěn)態(tài)來防止細胞凋亡；在HG條件下，自噬的減少和氧化應(yīng)激的發(fā)生均會引起LEC損傷和細胞凋亡［35］。Bax和Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的蛋白，其中Bax降低和Bcl-2升高表明細胞對凋亡的抵抗力增強［36］。本研究結(jié)果顯示，HG組的細胞ROS、MDA水平以及凋亡率、Bax蛋白顯著升高，而SOD和Bcl-2表達顯著降低，提示HG可促進細胞凋亡和氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而引起白內(nèi)障的發(fā)生。黃柏堿已被證實具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病等活性。研究顯示，黃柏堿可通過抑制氧化應(yīng)激和凋亡，改善脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷［37］。此外，黃柏堿調(diào)節(jié)鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路和cAMP信號通路是其治療糖尿病的核心機制［10］。本研究結(jié)果顯示，5 mg/L黃柏堿可增加HG環(huán)境下LEC的活力，增加自噬體數(shù)量和Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2水平，降低凋亡率以及ROS、MDA、Bax水平，提示黃柏堿可能通過抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激促進自噬，減少白內(nèi)障的形成。

AMPK在調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸代謝和內(nèi)分泌等生理活動中發(fā)揮重要作用［38-40］。AMPK活性在糖尿病相關(guān)疾病中受到抑制，例如，WANG等［41］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病小鼠的AMPK活性和自噬水平均下降。mTOR是AMPK的關(guān)鍵下游靶標(biāo)，AMPK磷酸化增加可降低mTOR水平，促進下游自噬信號蛋白的表達［42］。相關(guān)研究結(jié)果表明，調(diào)節(jié)AMPK-mTOR途徑可通過促進自噬改善糖尿

病引起的視網(wǎng)膜損傷和細胞凋亡，也可通過促進糖尿病小鼠足細胞自噬而減少細胞凋亡［43-44］。此外，AMPK/mTOR信號通路失調(diào)和自噬活性與白內(nèi)障形成有關(guān)。既往有研究結(jié)果顯示，通過促進AMPK活化和自噬通量恢復(fù)可以減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人LEC衰老［45］；AMPK誘導(dǎo)的自噬在病人的LEC中下調(diào)［46］。本文研究結(jié)果顯示，HG環(huán)境下LEC p-mTOR/mTOR水平顯著升高，p-AMPK/AMPK水平降低，提示HG可能通過抑制AMPK活性、促進mTOR活化和抑制自噬參與白內(nèi)障的形成。此外，黃柏堿可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路來促進自噬，改善潰瘍性結(jié)腸炎［10］。本文研究結(jié)果顯示，黃柏堿干預(yù)后，p-mTOR/mTOR水平顯著降低，p-AMPK/AMPK水平升高，且AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)黃柏堿對HLEB3細胞自噬和凋亡的改善作用。推測黃柏堿可能通過AMPK/mTOR信號通路參與對HG誘導(dǎo)的LEC自噬和凋亡的調(diào)節(jié)。

綜上所述，黃柏堿可減輕HG誘導(dǎo)的LEC氧化應(yīng)激和細胞凋亡，促進細胞自噬，其作用機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。本研究為治療DC中LEC自噬和凋亡提供了一種新方法，但其作用機制有待進一步研究。

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（本文編輯 牛兆山）

［收稿日期］2023-06-08; ［修訂日期］2024-03-23

［基金項目］泉州市科技局/衛(wèi)健委科技計劃項目（2021N169S）

［第一作者］李成茂（1991-），男，碩士，主治醫(yī)師。

［通信作者］李維娜（1978-），女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：liweina2096@126.com。