萬(wàn)州尤力克檸檬果皮精油的提取工藝及其抗氧化、抑菌、抗腫瘤活性研究

張瀟雪,杜慧慧*,胡武靜,江鴻翎,肖國(guó)生,楊東林

1(重慶三峽學(xué)院,重慶,404120)2(重慶文理學(xué)院 創(chuàng)新靶向藥物國(guó)際研究院,重慶,402160)

檸檬(Citruslimon)富含檸檬酸、類(lèi)黃酮、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病、護(hù)膚美容和抗腫瘤等功效,是繼柑和橙之后的第三大柑橘品種, 在全世界范圍內(nèi)有廣泛的栽培。重慶市萬(wàn)州區(qū)白羊鎮(zhèn)作為全國(guó)檸檬三大主產(chǎn)區(qū)之一,被譽(yù)為“重慶市檸檬之鄉(xiāng)”,檸檬年產(chǎn)量可達(dá)6萬(wàn)t,但目前銷(xiāo)售模式多以鮮銷(xiāo)為主,加之檸檬加工產(chǎn)業(yè)起步較晚,加工產(chǎn)品單一,附加值較低,造成豐產(chǎn)不豐收的現(xiàn)狀[1]。因此,開(kāi)發(fā)多樣化的檸檬加工產(chǎn)品是增加檸檬經(jīng)濟(jì)效益亟需解決的問(wèn)題。

精油是從植物中提取的天然化合物,具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗焦慮等作用[2-3],其成分及生物活性越來(lái)越受到人們的關(guān)注[4-5]。有學(xué)者[6-8]對(duì)檸檬果皮精油進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析發(fā)現(xiàn),不同方法提取的檸檬果皮精油其揮發(fā)性成分均以烯類(lèi)為主,醇類(lèi)、酯類(lèi)和醛類(lèi)等含氧化合物次之。目前檸檬精油的研究和應(yīng)用主要集中于芳香理療或改善神經(jīng)系統(tǒng)作用和膜材料的制備[9-10],隨著一些活性成分生理活性的發(fā)現(xiàn),檸檬精油作為功能食品及藥品化妝品的原料具有廣闊的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景[11-12],需求將日益增加。為響應(yīng)國(guó)家號(hào)召,堅(jiān)持因地制宜、循序漸進(jìn)的綠色發(fā)展理念和鄉(xiāng)村振興的戰(zhàn)略方針,本研究以萬(wàn)州區(qū)白羊鎮(zhèn)尤力克檸檬果皮為原料,通過(guò)單因素、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝獲取檸檬精油,并探究檸檬精油的抑菌、抗氧化及抗腫瘤活性,以期為萬(wàn)州檸檬深加工產(chǎn)業(yè)以及廢渣利用的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

萬(wàn)州尤力克檸檬,重慶市萬(wàn)州區(qū)白羊鎮(zhèn);結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HCT116、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251,宮頸癌細(xì)胞Hela、頭頸癌細(xì)胞SCC15、胰腺癌細(xì)胞BXPC-3、前列腺癌細(xì)胞PC3、人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC,重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國(guó)際研究院提供;金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌,重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

DPPH;碘化丙啶 (propidium iodide,PI)、核糖核酸酶(ribonuclease,RNase);噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT);二甲基亞砜 (dimethyl Sulfoxide,DMSO);RPMI-1640 (roswell park memorial institute-1640)液體培養(yǎng)基、DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)液體培養(yǎng)基、F12K液體培養(yǎng)基、無(wú)支原體胎牛血清、胰蛋白酶;抗體CDK1、CyclinB、LC3B、α-Tubulin;熒光二抗。

1.2 儀器與設(shè)備

GI80T高壓蒸汽滅菌鍋,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;MINI G S25/Eppendorf AG輕小型離心機(jī),德國(guó)艾本德股份公司;1-16K高速冷凍離心機(jī),重慶市瑞利電子儀器設(shè)備有限公司;5K43734倒置顯微鏡,日本Olympus 公司;F2215-185A-460細(xì)胞計(jì)數(shù)器,賽默飛世爾科技;XB70-FZ/R34A制冰機(jī),東南科儀有限公司;PowerPacTM Basic蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀,美國(guó)BIO-RAD公司;Cycation 5多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)BIO-TEK公司;ODYSSEY CLX LI-COR Odeyssey激光掃描儀,美國(guó)Gene limited company基因有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檸檬精油提取工藝流程

檸檬精油提取工藝流程如下:

新鮮檸檬→清洗→切皮、去白瓤→破碎→超聲→蒸餾→無(wú)水硫酸鈉干燥→精油

1.3.2 超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取檸檬精油

新鮮檸檬皮去除白瓤,高速粉碎機(jī)研磨1 min,稱(chēng)取30 g粉碎后的新鮮檸檬皮置于1 000 mL圓底燒瓶中,按照對(duì)應(yīng)比例加入適量蒸餾水,超聲一定時(shí)間后,連接揮發(fā)油提取裝置,蒸餾一定時(shí)間,計(jì)算精油的提取率,提取率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:c,提取率,%;v1,檸檬精油體積,mL;m2,新鮮檸檬果皮質(zhì)量,g。

1.3.3 單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

結(jié)合文獻(xiàn)[13-15],分別以液料比3∶1～15∶1(mL∶g),蒸餾時(shí)間30～210 min,超聲時(shí)間10～60 min,氯化鈉添加2～15 g/L為基礎(chǔ),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以液料比(mL∶g)、超聲時(shí)間(min)、蒸餾時(shí)間(min)、氯化鈉添加量(g/L)為自變量,檸檬精油提取率(%)為響應(yīng)值,按照B-Behnken Design原理[16]設(shè)計(jì)4因素3水平(表1),采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析,以得到最優(yōu)提取工藝。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Level of response surface experimental factors

1.3.4 GC-MS 分析檸檬精油成分

a)樣品預(yù)處理:取提取的檸檬精油用二氯甲烷稀釋 10 倍,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

b)氣相色譜條件:色譜柱為 HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm),載氣為高純氦氣(99.999%),流速為0.91 mL/min,不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,進(jìn)樣量 0.4 μL。采用程序升溫模式:柱溫 80 ℃,保持3 min,再以 8 ℃/min升溫至280 ℃,保持23 min。

c)質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃,溶劑延遲2 min,EI電子源,電子能量70 eV,m/z掃面范圍1.5～1 090 amu。檢索庫(kù)為NIST庫(kù)。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

稱(chēng)取0.01 g DPPH,溶解于無(wú)水乙醇并定容至250 mL,配制成0.1 mmol/L DPPH溶液;取2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液和2 mL不同質(zhì)量濃度(3、105、185、264、343 mg/mL)的檸檬精油溶液,混合均勻,避光靜置30 min,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)1;取2 mL無(wú)水乙醇溶液和2 mL不同濃度的檸檬精油溶液分別混合,避光靜置30 min,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)2;取2 mL無(wú)水乙醇溶液與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合,避光靜置30 min,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0;維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,所有樣品平行測(cè)定3次取平均值,根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率(E):

(2)

1.3.6 抑菌活性測(cè)定

分別挑取金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種細(xì)菌單菌落,于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,菌液濃度稀釋至106～107CFU。分別取4種待測(cè)菌懸液100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基,待其完全吹干,將滅菌后的濾紙片呈“品”字型貼3片于培養(yǎng)基表面,每片濾紙滴加10 μL檸檬精油,同時(shí)要以相同的操作以無(wú)菌水代替檸檬精油做空白實(shí)驗(yàn),以慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照,37 ℃培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值[7]。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存于液氮罐中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇,即在37 ℃水浴鍋中迅速完全融化,于800 r/min離心5 min,棄去上清液。分別將結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620,宮頸癌細(xì)胞Hela,膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251和頭頸癌細(xì)胞SCC15 接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,胰腺癌細(xì)胞BXPC-3接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,前列腺癌細(xì)胞PC3接種于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基,結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116接種于含10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基,人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC接種于含10%胎牛血清的F12K+DMEM混合培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度),定期換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

9種細(xì)胞均分為不同質(zhì)量濃度檸檬精油組(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)、陰性對(duì)照組為添加DMSO。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的9 種細(xì)胞的細(xì)胞懸液200 μL(1×103個(gè)/孔)接種于 96 孔板,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的檸檬精油和DMSO(陰性對(duì)照),并將9 種細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出各組細(xì)胞,棄上清液后每孔加入200 μL DMSO,搖床10 min,酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為570 nm,記錄吸光度值并計(jì)算檸檬精油對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔[17]。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

1.3.9 蛋白免疫印跡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞2×106個(gè)接種于6 cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁且變形后,分別加入檸檬精油,使得終質(zhì)量濃度為595、425、255 μg/mL,并以DMSO溶劑為對(duì)照組,培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。使用Western及IP裂解液(含蛋白酶抑制劑)分別提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì),并用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣20 μg總蛋白質(zhì),進(jìn)行10%～15% SDS-PAGE 膠電泳;采用濕轉(zhuǎn)方法(100 V,120 min)將PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上,再用5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗滌5次,每次5 min;相應(yīng)的一抗按照推薦稀釋濃度4 ℃孵育過(guò)夜,TBST 洗滌3次,每次10 min;IRDye標(biāo)記二抗稀釋比例為1∶15 000,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次5 min;采用LI-COR Odeyssey激光掃描儀檢測(cè)目的條帶,并分析檢測(cè)結(jié)果[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

液料比、蒸餾時(shí)間、超聲時(shí)間及氯化鈉添加量均對(duì)檸檬精油的提取率有較大的影響,檸檬精油的提取率隨液料比的增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)(圖1-a),當(dāng)液料比達(dá)到1∶9左右時(shí)檸檬精油的提取率曲線出現(xiàn)峰值,即提取率達(dá)到最大值,表明檸檬精油在此時(shí)達(dá)到飽和,繼續(xù)增加液料比反而會(huì)使蒸餾時(shí)間延長(zhǎng),從而延長(zhǎng)受熱時(shí)間,使精油發(fā)生分解,提取率下降。因此,確定液料比在1∶9左右時(shí)為最佳。

蒸餾時(shí)間在120 min之內(nèi)時(shí),提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈穩(wěn)步上升的趨勢(shì),120 min左右時(shí),提取率達(dá)到最大,之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),提取率不斷下降(圖1-b)。蒸餾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起精油分解,導(dǎo)致提取率降低,說(shuō)明蒸餾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于提取的順利進(jìn)行,因此最佳蒸餾時(shí)間應(yīng)保持在120 min左右。

超聲波輔助提取利用超聲波的空化效應(yīng)增加溶劑穿透力[19],提高檸檬精油的溶出速度和溶出量,從而提高檸檬精油的提取率。而超聲波也可以增加物質(zhì)成分的擴(kuò)散,若超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),反而會(huì)使檸檬精油中的一些組分被破壞或成分揮發(fā),甚至加劇乳化,降低檸檬精油的得率。因此本實(shí)驗(yàn)選取超聲20 min左右為宜(圖1-c)。

隨著氯化鈉添加量的增加,檸檬精油的提取效果呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),其中當(dāng)氯化鈉添加量在6 g/L左右時(shí),提取率達(dá)到最高值,此時(shí)的提取效果最佳(圖1-d)。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化檸檬精油提取工藝

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析[6](表2),得到了檸檬精油提取率與液料比(A)、超聲時(shí)間(B)、蒸餾時(shí)間(C)、氯化鈉添加量(D)的二次回歸方程模型:

Y=2.58+0.034A+0.10B+0.037C-0.047D+0.38AB+0.21AC+0.18AD+0.067BC+0.065BD+0.20CD-0.26A2-0.19B2-0.33C2-0.43D2

a-液料比;b-蒸餾時(shí)間;c-超聲時(shí)間;d-氯化鈉添加量圖1 液料比、蒸餾時(shí)間、超聲時(shí)間及氯化鈉添加量對(duì)檸檬精油提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, distillation time, ultrasonic time and sodium chloride addition amount on the extraction yield of lemon essential oil

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Response surface experimental design

該模型的F=21.75,P<0.000 1(表3),表明該模型具有極顯著性,失擬項(xiàng)中P=0.185 6,說(shuō)明僅有18.56%可能會(huì)因?yàn)楦鞣N因素影響導(dǎo)致模型不吻合,因而該模型擬合程度較好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可用此模型對(duì)檸檬精油提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。一次項(xiàng)中B(超聲時(shí)間)的P<0.05,說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)檸檬精油提取率的影響顯著。二次項(xiàng)中C2、D2的P值均小于0.000 1,A2<0.01,B2<0.05,結(jié)合F值可知,各因素對(duì)檸檬精油提取率的影響大小依次為B(超聲時(shí)間)>D(氯化鈉添加量)>C(蒸餾時(shí)間)>A(液料比)。各因子交互作用的響應(yīng)面中,兩兩交互作用的響應(yīng)面都呈弧形(圖2),說(shuō)明它們對(duì)響應(yīng)值都具有顯著作用[20],根據(jù)響應(yīng)面不難看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度從大到小依次為B(超聲時(shí))>D(氯化鈉添加)>C(蒸餾時(shí)間)>A(液料比),與方差分析中結(jié)果基本一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了其結(jié)果。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significance results of regression model

通過(guò)響應(yīng)面結(jié)果分析確定了最佳工藝的參數(shù)為液料比12∶1、超聲時(shí)間29.01 min、蒸餾時(shí)間133.21 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,在此條件下預(yù)測(cè)檸檬精油提取率可達(dá)2.72%。為方便實(shí)驗(yàn)操作,調(diào)整工藝參數(shù):液料比12∶1、超聲時(shí)間29 min、蒸餾時(shí)間133 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,重復(fù)3次,檸檬精油的提取率為(2.61±0.12)%,與回歸模型預(yù)測(cè)值2.72%相近,說(shuō)明該工藝條件可行。

圖2 兩因子交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot of the effect of two-factor interaction on extraction yield

2.3 檸檬精油組成成分分析

采用GC-MS對(duì)超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的檸檬精油進(jìn)行定性分析后,得到檸檬精油揮發(fā)性成分的總離子流圖(圖3)。檸檬精油成分保留時(shí)間集中在8.2～13.3 min,出峰數(shù)占總峰數(shù)的比例為48%。從尤力克檸檬果皮精油中共得到102種化合物(表4),其中相對(duì)含量較大的主要成分有1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(17.26%)、檜烯(10.62%)、β-蒎烯(9.91%)、左旋-α-蒎烯(6.93%)、γ-松油烯(6.11%)、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(5.5%)、檸檬醛(4.39%)、檸檬醇(3.09%)。

圖3 檸檬精油揮發(fā)成分總離子流圖Fig.3 Total ion diagram of volatile constituents extracted from lemon essential oil

2.4 檸檬精油具有抗氧化活性

檸檬精油清除DPPH自由基的原理是DPPH有單電子,其醇溶液呈紫色,在517 nm處有最大吸收峰,當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)能夠與其單電子結(jié)合而使溶液顏色變淺[21]。檸檬精油對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)343 mg/mL時(shí)有最大的清除率92.68%(圖4)。與維生素C相比,檸檬精油對(duì)DPPH自由基的清除效果稍差一些,但隨著質(zhì)量濃度的增加,檸檬精油清除DPPH自由基的效果逐漸接近維生素C。由此可確定檸檬精油具有一定的抗氧化活性。

表4 尤力克檸檬精油的化學(xué)組分Table 4 Composition of essential oil from Eureka lemon

圖4 檸檬精油有效清除DPPH自由基Fig.4 DPPH radical scavenging effect of lemon essential oil

2.5 檸檬精油具有抑菌活性

檸檬精油對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌均具有一定的抑菌效果(表5),且維氏氣單胞菌對(duì)檸檬精油最敏感,嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌次之,副溶血性弧菌對(duì)檸檬精油敏感性最差。

表5 檸檬精油對(duì)4 種受試菌的抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of lemon essential oil against four tested bacteria

2.6 檸檬精油具有抗腫瘤活性

2.6.1 檸檬精油抑制腫瘤細(xì)胞的增殖

為了評(píng)價(jià)檸檬精油的抗腫瘤活性,測(cè)定了檸檬精油對(duì)8種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力。檸檬精油在不同濃度(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)分別作用于(結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HCT116、宮頸癌細(xì)胞Hela、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、頭頸癌細(xì)胞SCC15、胰腺癌細(xì)胞BXPC-3、前列腺癌細(xì)胞PC3)8種腫瘤細(xì)胞和1種人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC,48 h后測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著檸檬精油質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞活力下降,抑制率顯著升高(圖5-a)。在人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC中,IC50顯著高于腫瘤細(xì)胞,表明檸檬精油不影響人正常細(xì)胞的活力(圖5-b)。由此可見(jiàn),檸檬精油增加細(xì)胞抑制率呈濃度依賴(lài)性,且具有抗多種腫瘤細(xì)胞的活性。

圖5 檸檬精油抑制腫瘤細(xì)胞增殖Fig.5 Inhibition of lemon essential oil on tumor cell proliferation注:***表示P<0.001。

2.6.2 檸檬精油誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期阻滯

為分析檸檬精油抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)理,利用western blotting(WB)分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況(圖5-c),結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK1隨檸檬精油質(zhì)量濃度的增加而被顯著下調(diào),表明檸檬精油可導(dǎo)致HCT116、SW620細(xì)胞周期發(fā)生阻滯,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

2.6.3 檸檬精油促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬

自噬在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,對(duì)自噬標(biāo)志性蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5-d),檸檬精油促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬,可見(jiàn)檸檬精油可以通過(guò)促進(jìn)自噬抑制細(xì)胞增殖。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取萬(wàn)州尤力克檸檬精油,并通過(guò)單因素及響應(yīng)面確定最佳工藝條件為:液料比12∶1(mL∶g)、蒸餾時(shí)間29 min、超聲時(shí)間133 min、氯化鈉添加量5.2 g/L,提取率達(dá)到2.72%。因氯化鈉溶于水不溶于油,可增大水的極性,且添加氯化鈉后,鹽水的密度增大,加速油層和水層的分離,進(jìn)而提高了精油的提取率,該工藝方法比肖娟等[22]的水蒸氣蒸餾法的提取率高出0.75%,因此該工藝方法可以視為一種有效的提取方法。GC-MS測(cè)定組成成分發(fā)現(xiàn)萬(wàn)州尤力克檸檬精油中烯類(lèi)化合物居多,相對(duì)含量達(dá)62.89%,醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)化合物的相對(duì)含量次之,這與鄧紅梅等[7]和秦軼等[8]的研究結(jié)果相吻合。

萬(wàn)州尤力克檸檬精油有較好的DPPH自由基清除能力,與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致[21,23],證明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。已有研究表明檸檬精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等抑制顯著,其抑菌作用主要是因?yàn)榇碱?lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)和萜烯類(lèi)等化合物的存在[3,24],本研究驗(yàn)證了檸檬精油對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種受試菌的抑制作用,且發(fā)現(xiàn)對(duì)維氏氣單胞菌抑制效果最明顯,表明萬(wàn)州尤力克檸檬精油同樣具有良好的抑菌活性。

本研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油具有抗多種腫瘤細(xì)胞活性,可能是因?yàn)楹胸S富的烯類(lèi)化合物,已有研究表明,烯類(lèi)化合物具有一定的抗腫瘤作用[25]。它們能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或自噬等方式來(lái)抑制并殺死腫瘤細(xì)胞[26]。本研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞阻滯及促進(jìn)自噬抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述,通過(guò)本研究所優(yōu)化的提取工藝,萬(wàn)州尤力克檸檬可獲得更高的精油產(chǎn)量,有利于檸檬深加工產(chǎn)品及廢渣的開(kāi)發(fā)與利用。此外,檸檬精油具有明顯的體外抗腫瘤作用,但還需要用更多技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行完整的體內(nèi)、體外評(píng)價(jià),此方面的研究工作正在深入進(jìn)行中。