不同分子質(zhì)量蝦源殼寡糖的抗菌抗氧化活性差異研究

羅威,黃曉月,鐘萍,,陳斯琪,區(qū)家豪,房志家,鄧旗,孫力軍,王雅玲*

1(嶺南師范學(xué)院 基礎(chǔ)教育學(xué)院,廣東 湛江,524084)2(湛江幼兒師范專科學(xué)校,廣東 湛江,524084) 3(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江,524088)4(廣東省江門市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所,廣東 江門,529000)

殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)是一種由氨基葡萄糖組成的多糖類物質(zhì),聚合度在2～20,具有抗菌、抗氧化等多種生物活性功能[1-4]。殼寡糖可由殼聚糖降解制得,與殼聚糖相比,殼寡糖具有更低的黏度和更高的水溶性,有利于其在食品、藥理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[4-8]。本課題組前期對(duì)蝦源殼聚糖的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到高抗氧化活性的殼聚糖酶解物[1],但是該酶解產(chǎn)物包含的殼寡糖分子質(zhì)量較寬泛,而不同分子質(zhì)量的殼寡糖抗菌抗氧化活性有較大差異,因此有必要對(duì)該酶解產(chǎn)物進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀以得到不同分子質(zhì)量的殼寡糖,并探究其抗菌抗氧化特性,以提高目標(biāo)酶解產(chǎn)物的利用率。有較多學(xué)者采用乙醇沉淀這一方法對(duì)殼寡糖進(jìn)行提純,舒德海等[9]使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇沉淀殼寡糖,得到主要成分為2～4糖的殼寡糖產(chǎn)品;孫婷[10]使用75%和87.5%的乙醇沉淀殼寡糖,分別得到主要聚合度9以上和聚合度7以上的殼寡糖;張青[11]使用體積分?jǐn)?shù)為60%、75.0%、87.5%的乙醇對(duì)殼寡糖進(jìn)行分級(jí)沉淀以獲得不同數(shù)均分子質(zhì)量的殼寡糖。綜合前人的研究,本實(shí)驗(yàn)擬采用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%的乙醇對(duì)目標(biāo)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)沉淀,以獲得相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。

關(guān)于殼寡糖的分子質(zhì)量與其抗菌抗氧化特性的關(guān)系,學(xué)者們有不同的見解[5,12-13]。對(duì)于抗菌活性,張青[11]認(rèn)為分子質(zhì)量小的蠅蛆源殼寡糖抗菌效果更佳,而SNCHEZ等[12]則認(rèn)為分子質(zhì)量大的蜘蛛蟹源殼寡糖抗菌效果更好;對(duì)于抗氧化活性,普遍認(rèn)為分子質(zhì)量小的殼寡糖抗氧化效果更佳[5,11],但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)殼寡糖的超氧自由基清除活性隨著分子質(zhì)量的增加而增加[13],因此,殼寡糖的分子質(zhì)量與其抗菌抗氧化活性之間的特性與殼寡糖的來源、微生物的種類、抗氧化的指標(biāo)等息息相關(guān)。本課題擬研究蝦源殼寡糖分子質(zhì)量與其抗菌抗氧化活性之間的相關(guān)性,獲得抗菌抗氧化特性良好的優(yōu)選殼寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦源殼聚糖(批號(hào):200820,脫乙酰度>85%),山東海得貝生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(固體,800 u/mg,CAS:9001-73-4),上海瑞永生物科技有限公司;D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,中國藥檢;抗壞血酸,Sigma Aldrich公司。

ALYE G3-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司;LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司;THERMO Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司;PHS-3E型pH計(jì),上海雷磁;84-1A磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司。

1.2 四種不同分子質(zhì)量殼寡糖產(chǎn)品的制備

參照文獻(xiàn)[1]的最優(yōu)酶解條件制備殼聚糖酶解物。將蝦源殼聚糖溶解于醋酸緩沖溶液中,調(diào)節(jié)pH值至4.80,按酶底比20%加入木瓜蛋白酶,于48.00 ℃溫度條件下水浴1 h,沸水浴10 min滅酶活,于冰水中快速冷卻,8 000 r/min離心,上清液為殼聚糖酶解物,然后進(jìn)行真空濃縮,得到殼聚糖酶解物濃縮液。

參照張青[11]的方法進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀。在殼聚糖酶解物濃縮液中加入等體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,于4 ℃靜置沉淀6 h,離心分離沉淀和上清液,沉淀為50%乙醇沉淀殼寡糖(COS50)。上清液繼續(xù)加入0.25倍體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,4 ℃靜置6 h后離心,沉淀為50%～60%乙醇沉淀殼寡糖(COS60)。上清液繼續(xù)加入0.33倍體積的無水乙醇,使溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,4 ℃靜置6 h后離心,沉淀為60%～70%乙醇沉淀殼寡糖(COS70),上清液為70%乙醇的上清殼寡糖(COS70 s),COS70 s經(jīng)真空旋蒸后冷凍干燥,其余組分進(jìn)行冷凍干燥,一共獲得4種殼寡糖產(chǎn)品(COS50、COS60、COS70和COS70 s)。

1.3 四種殼寡糖產(chǎn)品數(shù)均分子質(zhì)量和產(chǎn)量的測定

參照文獻(xiàn)[1]的方法測定4種殼寡糖產(chǎn)品的數(shù)均分子質(zhì)量和產(chǎn)量。

1.4 四種殼寡糖產(chǎn)品抗菌活性的測定

1.4.1 牛津杯法測定4種殼寡糖產(chǎn)品的抑菌圈

參照文獻(xiàn)[14]中的牛津杯法測定4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)5種指示菌[大腸桿菌(Escherichiacoli,菌種號(hào):ATCC28922)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis,菌種號(hào):CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,菌種號(hào):ATCC29213)、假單胞菌(Pseudomonas)和希瓦氏菌(Shewanella)(來源于廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室保藏的南美白對(duì)蝦腐敗菌分離株)]的抗菌活性。

1.4.2 試管二倍稀釋法測定4種殼寡糖產(chǎn)品的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)

參照文獻(xiàn)[15]中的二倍試管稀釋法測定4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)5種指示菌的MIC。將濃度等于或高于MIC的試管繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸取培養(yǎng)液涂布于固體培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)24 h,觀察平板上有無菌落生長,無菌生長對(duì)應(yīng)的最低濃度為MBC。

1.5 比色法測定4種殼寡糖產(chǎn)品的抗氧化活性

參照文獻(xiàn)[1]的方法測定4種殼寡糖產(chǎn)品的DPPH自由基清除率和總還原力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用WPS office對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪制圖表,采用SPSS 22進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種殼寡糖產(chǎn)品的數(shù)均分子質(zhì)量和產(chǎn)量

由于多糖不溶于乙醇,因此將乙醇逐步加入殼聚糖酶解物,殼多糖會(huì)逐步沉淀析出,進(jìn)而得到不同分子質(zhì)量的殼寡糖[16]。采用乙醇分級(jí)沉淀法獲得的4種殼寡糖產(chǎn)品的數(shù)均分子質(zhì)量分別為2 365、2 807、3 105、1 390 Da,產(chǎn)量分別為40.95%、25.28%、12.46%、8.12%(表1)。

表1 四種殼寡糖產(chǎn)品的數(shù)均分子質(zhì)量和產(chǎn)量Table 1 Average molecular weight and yield of four chitosan oligosaccharides

2.2 四種殼寡糖產(chǎn)品的抗菌活性比較

2.2.1 四種殼寡糖產(chǎn)品的抑菌效果

表2顯示4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)5種指示菌的抑菌效果。其中殼寡糖產(chǎn)品COS50、COS60、COS70對(duì)5種指示菌均有抑菌效果,而COS70 s在實(shí)驗(yàn)濃度下僅對(duì)希瓦氏菌有抑菌效果,對(duì)其余4種菌則無抑菌效果,表明COS70 s較其余3種殼寡糖的抑菌效果弱。對(duì)大腸桿菌,在10.00 mg/mL質(zhì)量濃度下,COS60的抑菌圈顯著大于COS50和COS70(P<0.05),隨著殼寡糖濃度的降低,3種殼寡糖的抑菌圈大小的差異性減少,抑制效果:COS60>COS50>COS70;對(duì)枯草桿菌,COS50和COS60的抑菌效果沒有顯著性差異(P>0.05),但顯著優(yōu)于COS70的抑菌效果(P<0.05);對(duì)金黃色葡萄球菌,在殼寡糖質(zhì)量濃度為2.50 mg/mL時(shí),COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60和COS70(P<0.05),特別是COS50在質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)仍有抑菌效果,而其余殼寡糖沒有抑菌效果;對(duì)假單胞菌,在殼寡糖質(zhì)量濃度為0.62 mg/mL時(shí),COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60和COS70(P<0.05);對(duì)希瓦氏菌,4種殼寡糖產(chǎn)品在質(zhì)量濃度為0.31 mg/mL濃度下對(duì)希瓦氏菌即有抑菌效果,所需濃度遠(yuǎn)低于上述4種指示菌,表明殼寡糖對(duì)希瓦氏菌有更強(qiáng)的抑制活性,在殼寡糖質(zhì)量濃度為0.62 mg/mL時(shí),COS50的抑菌效果顯著優(yōu)于COS60、COS70和COS70 s(P<0.05)。

表2 四種殼寡糖產(chǎn)品的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of four chitosan oligosaccharides

2.2.2 四種殼寡糖的MIC和MBC

表3分別為4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)5種指示菌的MIC和MBC,MIC值和MBC值越小,表明該物質(zhì)的抑菌效果越強(qiáng)。對(duì)于大腸桿菌,殼寡糖產(chǎn)品COS50、COS60和COS70的MIC值和MBC值一樣,表明3種殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效果一樣強(qiáng);對(duì)于枯草桿菌,COS50和COS60的MIC和MBC值小于COS70,表明這2種殼寡糖的對(duì)枯草桿菌的抑菌效果強(qiáng)于COS70;對(duì)于金黃色葡萄球菌,COS50的MIC和MBC值小于COS60和COS70,表明COS50對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于其他2種;對(duì)于假單胞菌,3種殼寡糖的MIC值一致,但COS50和COS60的MBC值小于COS70,表明COS70對(duì)假單胞菌的抑菌效果弱于其他2種殼寡糖;對(duì)于希瓦氏菌,4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)其均有抑菌效果,其中乙醇沉淀的3種殼寡糖的抑菌效果強(qiáng)于COS70 s。上述結(jié)果表明,COS50、COS60和COS70對(duì)5種細(xì)菌均有抑菌效果,總體而言抑菌效果:COS50>COS60>COS70,即這3種殼寡糖的抑菌活性隨著殼寡糖分子質(zhì)量的增加而減弱。

表3 四種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)指示菌的MIC/MBC 單位:mg/mL

2.3 四種殼寡糖產(chǎn)品的抗氧化活性比較

對(duì)于DPPH自由基,樣品的IC50值越小表明其對(duì)DPPH自由基的抗氧化能力越強(qiáng),結(jié)果表明4種殼寡糖產(chǎn)品對(duì)于DPPH自由基的抗氧化能力:COS50>COS70 s>COS60>COS70,其中COS50的抗氧化能力約為COS70 s的1.5倍(圖1)。對(duì)于總還原力,COS70 s>COS50>COS60>COS70,其中COS70 s的總還原力約為COS50的2.5倍(圖1)?？傮w而言,4種殼寡糖產(chǎn)品的抗氧化能力強(qiáng)弱排序?yàn)?COS70 s>COS50>COS60>COS70,即殼寡糖的抗氧化能力隨著分子質(zhì)量的增加而減弱。

圖1 四種殼寡糖產(chǎn)品的抗氧化活性比較Fig.1 Comparison of antioxidant activity of four chitosan oligosaccharides

3 討論

殼寡糖是一種堿性多糖,具有抗菌抗氧化等生物活性,多項(xiàng)研究表明殼寡糖的生物活性與其分子質(zhì)量相關(guān)[7]。本研究使用乙醇將目標(biāo)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)沉淀,得到4種不同分子質(zhì)量的殼寡糖(COS50、COS60、COS70、COS70 s),并對(duì)其抗菌抗氧化活性進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀的3種殼寡糖產(chǎn)品(COS50、COS60、COS70)對(duì)5種細(xì)菌均有抑制效果,表明這3種殼寡糖對(duì)細(xì)菌具有廣譜抑菌性,與前人發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑菌多種細(xì)菌生長的結(jié)果相一致[17];COS70 s(數(shù)均分子質(zhì)量為1 390 Da)在同樣實(shí)驗(yàn)濃度下只對(duì)希瓦氏菌有抑制效果,對(duì)其余指示菌沒有抑菌效果,這可能是由于該殼寡糖含有的抑菌有效成分較少,研究表明,對(duì)于殼1～5糖,聚合度低的殼寡糖抑菌效果更弱,長于六聚體的的殼寡糖抑菌效果更佳[18-19],而COS70 s的數(shù)均分子質(zhì)量與其他3種殼寡糖相比,降低了40%～55%,含有殼6糖以上的抑菌有效成分更低,因此需要更高的濃度才可達(dá)到抑制菌種生長的效果,這也是該殼寡糖在相同實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)某些實(shí)驗(yàn)菌種沒有抑菌活性的原因。

乙醇沉淀的3種殼寡糖對(duì)5種指示菌均有抑菌效果,從MIC值上看,抑菌效果:COS50>COS60>COS70,即殼寡糖的抑菌活性隨著殼寡糖分子質(zhì)量的增加而減弱,這與張青[11]認(rèn)為分子質(zhì)量小的殼寡糖抑菌活性更強(qiáng)的結(jié)論相一致,這可能是由于較低分子質(zhì)量的殼寡糖除了能在細(xì)菌細(xì)胞膜的負(fù)電荷成分結(jié)合外,還能夠進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),吸附DNA,阻斷RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成,從而達(dá)到抗菌的效果[3,20]。

殼寡糖的來源對(duì)其抗菌活性也有影響。張青[11]對(duì)蠅蛆殼聚糖酶解液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀,發(fā)現(xiàn)70.0%～87.5% EP-COS(數(shù)均分子質(zhì)量為1 093 Da)對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好,pH=5.0條件下的MIC為5 mg/mL。COS50(數(shù)均分子質(zhì)量為2 365 Da)的分子質(zhì)量比70.0%～87.5% EP-COS大,理論上其對(duì)大腸桿菌的抗菌活性會(huì)比它弱,但本研究卻發(fā)現(xiàn)其在pH=7.0條件下的MIC僅為2.5 mg/mL,說明蝦源殼寡糖的抑菌效果更好。

對(duì)于抗氧化活性,本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖的總還原力隨著分子質(zhì)量的增加而減弱(COS70 s>COS50>COS60>COS70),與前人的研究結(jié)論一致[5,11,17],出現(xiàn)這種規(guī)律可能是由于較高的分子質(zhì)量的殼寡糖具有更強(qiáng)的分子內(nèi)氫鍵,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)更緊湊,進(jìn)而削弱了羥基和氨基的活性,限制了它們的還原能力[17]。對(duì)于殼寡糖的自由基清除能力,本研究發(fā)現(xiàn)COS50>COS70 s>COS60>COS70,有人認(rèn)為是不穩(wěn)定的自由基與殼寡糖的氨基和羥基反應(yīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的自由基[21],進(jìn)而起到清除自由基的作用;由此可見殼寡糖的氨基和羥基外展的越多,清排自由基能力越強(qiáng),一般認(rèn)為分子質(zhì)量越小,裸露的氨基和羥基越多。但本研究發(fā)現(xiàn),分子質(zhì)量小的COS70 s比分子質(zhì)量大的COS50對(duì)DPPH自由基的清除能力弱,可能是由于COS70 s中存在徹底降解的單糖(氨基葡萄糖),能與自由基有效結(jié)合的氨基和羥基減少,表現(xiàn)出抗氧化性更強(qiáng)的殼寡糖有效成分更少,本研究結(jié)果進(jìn)一步說明殼寡糖的功能并不是簡單認(rèn)為分子質(zhì)量越小越優(yōu)。

本研究所用的木瓜蛋白酶與底物比為1∶5,酶的用量過大,酶解產(chǎn)物中可能存在木瓜蛋白酶自身水解產(chǎn)生的蛋白肽。但是,迄今為止沒有關(guān)于木瓜蛋白酶分解得到的多肽具有抗菌抗氧化活性的任何佐證,而且若存在多肽,在乙醇沉淀過程中多肽也會(huì)析出,特別是本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低,蛋白質(zhì)水解更嚴(yán)重,若分解出的多肽存在抗氧化活性,那么pH越小,水解出來的產(chǎn)物抗氧化能力應(yīng)該更強(qiáng),但試驗(yàn)結(jié)果卻表明,在pH 4.8時(shí)酶解所得產(chǎn)物抗氧化活性更強(qiáng)[1],這也間接說明了木瓜蛋白酶酶解法制備殼聚糖的抗菌抗氧化活性與酶自身水解的蛋白肽無關(guān)。

本研究對(duì)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的4種殼寡糖產(chǎn)品進(jìn)行抗菌抗氧化活性研究,發(fā)現(xiàn)數(shù)均分子質(zhì)量適中的殼寡糖抑菌效果更強(qiáng)(抗菌效果排序?yàn)?COS50>COS60>COS70>COS70 s);殼寡糖的抗氧化能力隨著數(shù)均分子質(zhì)量的增加而減弱(抗氧化效果排序?yàn)?COS70 s>COS50>COS60>COS70);綜合考慮抗菌抗氧化效果,認(rèn)為COS50(數(shù)均分子質(zhì)量為2 365 Da)為同時(shí)擁有抗菌抗氧化性能的優(yōu)選殼寡糖。本研究可為蝦源殼寡糖的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。