芒果苷通過MMP9調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化對(duì)胰腺癌的作用及其機(jī)制研究

崔連鷙 趙丹寧 孫洪帥 翟 悅 潘 悅 野麗莉 （吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130012）

胰腺癌作為一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康［1］。胰腺癌發(fā)生發(fā)展與免疫微環(huán)境紊亂密切相關(guān)，因此探究胰腺癌免疫微環(huán)境調(diào)控并針對(duì)其開發(fā)新的治療藥物對(duì)胰腺癌臨床治療具有重要意義［2］。巨噬細(xì)胞是免疫微環(huán)境的重要組成，研究表明，M0巨噬細(xì)胞在IL-4和IL-13激活下形成M2 巨噬細(xì)胞，M2 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物有CD206、CD163、CD204 等，還可分泌IL-10、TGF-β 和Arg-1 等因子；腫瘤研究中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，M2 巨噬細(xì)胞既能抑制炎癥，又能促進(jìn)腫瘤增殖，通過TGF-β/Smads 信號(hào)通路發(fā)揮作用，分泌TGF-β，不僅促進(jìn)Smad2/3 磷酸化，且顯著增強(qiáng)Smad4 表達(dá)［3-5］。研究表明，M2 型TAM 在胰腺癌組織中表達(dá)升高，與胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［6］。因此抑制M2 型巨噬細(xì)胞是治療胰腺癌的重要因素。MMP9（明膠酶B/92 kD Ⅳ型膠原酶）與M2 型TAM 密切相關(guān)，同時(shí)也是治療胰腺癌的重要靶點(diǎn)，可通過調(diào)控M2 型TAM 對(duì)腫瘤起治療作用［7-8］。芒果苷作為一種天然化合物，藥理活性廣泛，對(duì)多種疾病均具有治療作用，尤其對(duì)多種腫瘤均具有良好的治療效果［9］，但其對(duì)胰腺癌的作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬闡明芒果苷對(duì)胰腺癌的治療效果，并探討其對(duì)MMP9 及M2 型TAM 的調(diào)控作用，探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 4～5 周齡C57BL/6 雄性健康小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001，倫理審批號(hào)：DUTFM230719-02。Pan02 小鼠胰腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、RIPA 緩沖液購(gòu)自Biosharp；芒果苷購(gòu)自Sigma 公司（實(shí)驗(yàn)級(jí)）；蛋白印跡分析試劑購(gòu)自北京百歐泰生物科技有限公司；TGF-β、IL-10、Arg-1 ELISA 試劑盒購(gòu)自康肽生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa（Code：RR047A）；qRT-PCR 試 劑 盒 購(gòu) 自Novoprotein公司；熒光標(biāo)記DAPI購(gòu)自索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑購(gòu)自海氏海諾醫(yī)療科技有限公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬細(xì)胞提取 脫臼處死小鼠，浸泡于75%乙醇，在超凈臺(tái)中剪開皮毛，完全暴露腹腔，乙醇棉球擦拭腹腔表面，用鑷子夾起腹膜，吸取冷PBS注入腹腔，手指大力揉腹部，鑷子夾起腹膜再用針管吸出灌洗液，灌洗液中的巨噬細(xì)胞即被采集［10］。

1.2.2 小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型構(gòu)建 取Panc02 細(xì)胞懸液（4×107個(gè)/ml），每只小鼠于右背側(cè)近腋部皮下接種200 μl 細(xì)胞懸液，共接種20 只，待腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm3時(shí)，隨機(jī)將小鼠平均分為2組：模型組（生理鹽水200 μl，腹腔注射）、芒果苷組（5 mg/kg，腹腔注射），每天給藥1 次。待1 周后腫瘤成瘤，隔天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和寬徑，腫瘤體積按V=0.5×長(zhǎng)徑×寬徑2計(jì)算，接種腫瘤4 周后處死所有小鼠，剝?nèi)∧[瘤并拍照稱重，觀察芒果苷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用［11］。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 用RIPA 緩沖液（RIPA∶PMSF為1∶50）將Panc02細(xì)胞和小鼠胰腺組織裂解，細(xì)胞置于冰上快速充分研磨1 min；腫瘤組織放于液氮后置于破碎機(jī)研磨充分破碎，冰上放置15 min，4 ℃、11 000 r/min 離心15 min，吸取上清于新的離心管，加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液后95 ℃金屬浴加熱10 min，制備SDS-PAGE 濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜（300 mA），TBST 洗膜，脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，回收一抗后TBST溶液清洗3次，二抗孵育1 h 后回收，清洗，配制顯影液，均勻孵于PVDF 膜，顯影儀中顯影。檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞極化 相 關(guān) 蛋 白pSMAD2、SMAD2、pSMAD3、SMAD3、SMAD4表達(dá)。

1.2.4 ELISA 取共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠血清為樣本，分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔，按試劑盒步驟檢測(cè)M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TGF-β、Arg-1 和IL-10水平，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處各孔光密度（OD）。

1.2.5 qRT-PCR 將小鼠胰腺組織剪去綠豆粒大小組織塊，Trizol 法提取RNA。將總RNA 溶液稀釋成1 μg/μl，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照qRT-PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，檢測(cè)小鼠胰腺組織MMP9 mRNA表達(dá)。

1.2.6 免疫熒光 將小鼠胰腺組織切片根據(jù)免疫熒光說明書制作，熒光顯微鏡觀察MMP9 與巨噬細(xì)胞表達(dá)情況（100倍），采集分析圖像。

1.2.7 免疫組織化學(xué)分析 Ki67 為腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物，根據(jù)免疫組化說明書制作小鼠胰腺組織切片，顯微鏡觀察Ki67 與MMP9 表達(dá)（100 倍），采集分析圖像。

1.2.8 巨噬細(xì)胞與Panc02 小鼠胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)

采用巨噬細(xì)胞-Panc02 細(xì)胞共培養(yǎng)體系，利用Transwell 共培養(yǎng)模型，下室為巨噬細(xì)胞，上室為Panc02 細(xì)胞。共培養(yǎng)體系分為3 組：CON 組、Model組、芒果苷（MGF）組，CON 組下室為腹腔提取的M0巨噬細(xì)胞，Model 組與MGF 組下室為20 ng/ml IL-4誘導(dǎo)24 h 得到的M2 巨噬細(xì)胞。將Panc02 細(xì)胞培養(yǎng)于共培養(yǎng)體系上室，孵育24 h，MGF 組加入芒果苷（10 μg/ml） 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。給藥24 h 后，每孔加入10 μl 0.5%MTT 溶液（5 mg/ml），活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。恒溫孵育4 h，孵育完結(jié)后吸上清，每孔加入150 μl DMSO，DMSO 可溶解細(xì)胞中的甲瓚，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，即可反映細(xì)胞存活數(shù)，搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶甲瓚充分溶解于DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處各孔吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用 Prism 8.0 軟件（Graph Pad Software Inc，San Dieg，CA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為±s，采用雙尾t檢驗(yàn)或單向方差分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行事后檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芒果苷治療胰腺癌的體內(nèi)效果評(píng)價(jià) 構(gòu)建小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，與模型組相比，芒果苷治療后胰腺癌體積減小，生長(zhǎng)變慢（圖1A、B）；為驗(yàn)證芒果苷對(duì)胰腺癌的治療效果，免疫組化檢測(cè)兩組小鼠胰腺癌組織中腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 表達(dá)，結(jié)果顯示，芒果苷組顯微鏡下棕色明顯減少（圖1C），說明腫瘤細(xì)胞增殖明顯減弱，芒果苷對(duì)胰腺癌有良好的治療效果。

圖1 芒果苷對(duì)小鼠胰腺癌的體內(nèi)治療作用Fig.1 Therapy effect of mangiferin on pancreatic cancer in vivo

2.2 芒果苷對(duì)胰腺癌中M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響 為驗(yàn)證芒果苷可抑制胰腺癌M2 型巨噬細(xì)胞極化，ELISA 檢測(cè)兩組小鼠血清中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TGF-β、Arg-1、IL-10 表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)小鼠腫瘤組織中M2 型巨噬細(xì)胞特征性標(biāo)志物CD206 表達(dá)，結(jié)果顯示，芒果苷組小鼠胰腺癌組織中M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TGF-β、Arg-1、IL-10表達(dá)降低（圖2A）；熒光顯微鏡下顯示，芒果苷組綠色熒光明顯減弱（圖2B），說明芒果苷抑制胰腺癌M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)。

圖2 芒果苷對(duì)小鼠胰腺癌M2型極化巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響Fig.2 Effect of mangiferin on expression of M2 polarized macrophages in pancreatic cancer

2.3 芒果苷對(duì)MMP9及下游M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)的影響 為驗(yàn)證芒果苷抑制胰腺癌中MMP9 表達(dá)，分別采用免疫熒光、免疫組化、qRTPCR 檢測(cè)對(duì)照組和芒果苷組小鼠胰腺癌組織中MMP9 表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組相比，熒光顯微鏡下綠色明顯減少，顯微鏡觀察免疫組化切片棕色明顯減少，qRT-PCR 結(jié)果同樣顯示MMP9 含量明顯降低（圖3A～C）。采用蛋白印跡分析檢測(cè)兩組小鼠胰腺癌組織M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白pSMAD2、SMAD2、pSMAD3、SMAD3、SMAD4及MMP9表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)均降低（圖3D）。提示芒果苷通過抑制MMP9 及其下游M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)通路抑制胰腺癌中巨噬細(xì)胞M2型極化。

圖3 芒果苷對(duì)小鼠胰腺癌中MMP9及下游信號(hào)通路表達(dá)的影響Fig.3 Effect of mangiferin on MMP9 expression and its downstream in pancreatic cancer

2.4 芒果苷體外治療胰腺癌的效果評(píng)價(jià) 為驗(yàn)證芒果苷體外通過抑制巨噬細(xì)胞M2 型極化治療胰腺癌，構(gòu)建M2極化巨噬細(xì)胞-胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示，與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)相比，M2型極化巨噬細(xì)胞可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖（圖4A）；ELISA 檢測(cè)共培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TGF-β、Arg-1、IL-10表達(dá)，結(jié)果表明，加入芒果苷后，3 種標(biāo)志物表達(dá)明顯降低（圖4B）；免疫熒光檢測(cè)共培養(yǎng)模型M2型極化巨噬細(xì)胞中MMP9表達(dá)，結(jié)果顯示，芒果苷給藥后，熒光顯微鏡下綠色明顯減少（圖4C）；蛋白印跡分析檢測(cè)共培養(yǎng)模型中M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白pSMAD2、SMAD2、pSMAD3、SMAD3、SMAD4 及MMP9 表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)均顯著降低（圖4D）。表明芒果苷體外可通過抑制MMP9 及下游M2 巨噬細(xì)胞極化及相關(guān)信號(hào)通路治療胰腺癌。

圖4 芒果苷體外調(diào)控M2巨噬細(xì)胞對(duì)胰腺癌的影響Fig.4 Effect of mangiferin on M2 polarized macrophages induced pancreatic cancer in vitro

3 討論

胰腺癌作為消化道惡性腫瘤，患者發(fā)現(xiàn)即晚期，失去治療機(jī)會(huì)，且胰腺癌化療后極易產(chǎn)生耐藥，臨床治療效果有限。大量研究表明胰腺癌與免疫微環(huán)境密切相關(guān)，是一個(gè)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性?。?2-13］。TAM 是腫瘤免疫微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞，可參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展調(diào)控，包括胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、免疫逃逸及化療耐藥等，在胰腺癌靶向治療中顯示出一定治療潛力［14］。研究表明，在胰腺癌中M2型TAM 占主要地位，且M2巨噬細(xì)胞數(shù)量越多，胰腺癌患者總生存期越低［15］。因此，抑制胰腺癌中M2型TAM 是治療胰腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)［16］。本研究也表明，在巨噬細(xì)胞-胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，M2型極化巨噬細(xì)胞可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。因此，可通過抑制巨噬細(xì)胞M2型極化治療胰腺癌。

巨噬細(xì)胞極性調(diào)控是一個(gè)非常精密的過程，有多種調(diào)控因子參與［17］。MMP9 在多種腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移耐藥中均起重要調(diào)控作用［18］。而MMP9 與免疫微環(huán)境密切相關(guān)，尤其是M2 型TAM，M2 型TAM 可分泌MMP9 促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，而MMP9 高表達(dá)也可調(diào)控其下游信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化［19］。因此MMP9是調(diào)控M2型TAM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究也表明，在M2 型極化的巨噬細(xì)胞中MMP9 高表達(dá)，而抑制MMP9 表達(dá)，其下游M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)信號(hào)通路中pSMAD2、SMAD2、pSMAD3、SMAD3、SMAD4 等低表達(dá)，進(jìn)而抑制胰腺癌中巨噬細(xì)胞M2 型極化，對(duì)胰腺癌起治療作用。因此，MMP9 是胰腺癌中調(diào)控M2 型TAM的治療靶點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用潛力［20］。

天然化合物是抗腫瘤藥物的重要來(lái)源，天然化合物具有來(lái)源廣泛、藥理活性好、安全性高等特點(diǎn)，在腫瘤化療中占有重要作用［21］。芒果苷作為一種黃酮類化合物，對(duì)中樞系統(tǒng)疾病、免疫相關(guān)疾病、心腦血管及腫瘤等多種疾病具有很好的治療效果［15］。芒果苷作為一個(gè)多靶點(diǎn)藥物，其下游調(diào)控靶點(diǎn)眾多，TGF-β、CASPS3、JNK 及EGFR 等均為芒果苷的治療靶點(diǎn)，但芒果苷治療胰腺癌的靶點(diǎn)尚不清楚［22］。本研究表明，芒果苷對(duì)胰腺癌具有良好的治療效果，且可抑制M2 型巨噬細(xì)胞極化，MMP9 可能為芒果苷調(diào)控胰腺癌免疫微環(huán)境的主要靶點(diǎn)，芒果苷可抑制MMP9 及其下游M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)通路表達(dá)。表明在胰腺癌中，芒果苷以MMP9 作為治療靶點(diǎn)，調(diào)控M2 型TAM，最終治療胰腺癌，因此芒果苷在胰腺癌治療中具有良好應(yīng)用前景。

綜上，芒果苷是治療胰腺癌的潛在候選藥物，對(duì)胰腺癌具有良好的治療作用，其治療機(jī)制以MMP9 為靶點(diǎn)，通過抑制MMP9 及其下游M2 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)通路最終抑制巨噬細(xì)胞M2 型極化起治療作用。提示MMP9 可作為胰腺癌的治療靶點(diǎn)，且芒果苷是該靶點(diǎn)的治療藥物，具有一定臨床應(yīng)用前景。