PARP-1 抑制劑通過激活SIRT1-PGC-1α 軸減輕慢性阻塞性肺疾病大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)

侯亞儒 舒新樂 張 霞 李 森 雍文穆 （漢中市中心醫(yī)院，漢中 723000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，以肺部及肺血管出現(xiàn)炎癥為主要特征，造成體內(nèi)氧化/抗氧化失衡，引起咳嗽、咳痰、喘息等癥狀，嚴重時會危及患者生命［1-2］。目前該疾病尚無法根治，只能通過藥物治療緩解疾病危害，因此對于如何根治或更好地緩解該類疾病成為研究熱點［3］。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶（Sirtuin，SIRT）可通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator 1α，PGC-1α）參與生物體的氧化代謝作用，對COPD大鼠肺部損傷起到保護作用，從而在一定程度上緩解COPD病情［4］。

PARP 蛋白家族在氧化應(yīng)激反應(yīng)中對細胞損傷具有重要調(diào)控作用［5-6］。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（poly adenosine diphosphate ribose polymerase-1，PARP-1）是PARP 蛋白家族重要成員，已被證實可對炎癥引起的組織損傷起到保護作用［7］。但PARP-1抑制劑是否能調(diào)控SIRT1-PGC-1α軸，進而參與調(diào)控COPD 大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)仍有待探索［8］。本研究基于SIRT1-PGC-1α軸探究PARP-1抑制劑對COPD 大鼠炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，探討SIRT1-PGC-1α 軸作為PARP-1抑制劑作用新靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 48只SPF級健康成年SD雄性大鼠購于山東新華制藥有限公司，許可證號：SCXK（魯） 2018 0007，體質(zhì)量（300±10） g。本實驗經(jīng)漢中市中心醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批（20200617-002）。

1.1.2 主要試劑及儀器 PARP-1 抑制劑INO1001（貨號：M10254）購于北京百奧萊博科技有限公司；PGC-1α 抑制劑SR-18292（貨號：HY-101491）購于萊恩生物科技有限公司；血清TNF-α ELISA 檢測試劑盒（貨號：JN110）購于上海紀寧實業(yè)有限公司；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（貨號：ml112819）購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；IL-6 ELISA 檢測試劑盒（貨號：ab234570）、SIRT1 抗體（貨號：ab189494）、PGC-1α抗體（貨號：ab176328）、羊抗兔IgG 抗體（貨號：ab150077）購于Abcam 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA） ELISA 檢測試劑盒（貨號：FT-D23738）購于上海梵態(tài)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）ELISA 檢測試劑盒（貨號：ZY-SOD-Ra）購于上海澤葉生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號：G1120）購于北京索萊寶生物科技有限公司；熒光定量PCR 儀（7500，ABI 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（HE-120，上海生工生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構(gòu)建 將48 只SD 大鼠隨機分為健康組、模型組、PARP-1 抑制劑處理組、PARP-1抑制劑+PGC-1α 抑制劑組，每組12 只。依據(jù)參考文獻［4］方法，模型組、PARP-1 抑制劑處理組、PARP-1抑制劑+PGC-1α 抑制劑組大鼠置于玻璃熏煙染毒箱（50 cm×50 cm×50 cm）中，內(nèi)熏香煙煙霧，2 次/d，每次5 只香煙熏30 min，每只香煙含焦油14 mg，連續(xù)2 周。健康組置于玻璃熏煙染毒箱，但不做任何處理。在煙熏處理的第1、7、14 天，麻醉各組大鼠，固定于固定板，快速暴露氣管，模型組、PARP-1抑制劑處理組、PARP-1抑制劑+PGC-1α抑制劑組大鼠在氣管內(nèi)注射200 μl 脂多糖溶液（1 mg/ml，生理鹽水稀釋），健康組注射等量生理鹽水，旋轉(zhuǎn)固定板使溶液在肺部均勻分布。煙熏處理結(jié)束后，PARP-1抑制劑處理組向大鼠腹腔內(nèi)注射100 μl PARP-1 抑制劑溶液（2 mg/ml，生理鹽水稀釋），PARP-1 抑制劑+PGC-1α 抑制劑組向大鼠腹腔內(nèi)注射100 μl PARP-1抑制劑+PGC-1α 抑制劑溶液（1 mg/ml PARP-1 抑制劑，1 mg/ml PGC-1α抑制劑，生理鹽水稀釋），健康組和模型組注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2 肺泡灌洗液炎癥因子檢測 檢測肺組織功能指標后，結(jié)扎固定氣管插管，注射器吸取2 ml 生理鹽水，注入大鼠肺組織，充分灌洗，不斷按壓大鼠胸前區(qū)，緩慢抽取灌洗液，將抽取獲得的灌洗液重新注入肺組織，再次按壓，而后抽取灌洗液，如此反復(fù)，直至抽取灌洗液明顯有大量乳白色泡沫為止，收集灌洗液，置于離心管中，4 ℃ 2 000 r/min 離心10 min，取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書方法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.3 大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測 收集灌洗液后，抽取大鼠動脈血，靜置片刻，4 ℃ 2 000 r/min 離心10 min，分離血清。剖開肺部，取出肺組織，部分用4%多聚甲醛固定，部分液氮處理，研磨至粉，凍存用于后續(xù)實驗。分離的血清根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測MDA、SOD含量。

1.2.4 肺組織病理學(xué)變化觀察 取出4%多聚甲醛固定的肺組織，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備切片樣品，切片厚5 μm。蘇木精染色3 min，清水洗凈，低濃度鹽酸乙醇分化直至返藍，0.5%伊紅染色3 min，清水洗凈，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.5 肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 檢測 取出凍存?zhèn)溆玫姆谓M織粉末少許，Trizol 提取總RNA，而后定量，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，上機檢測SIRT1、PGC-1α mRNA 的表達水平，引物序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。①ACTIN F：5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'，R：5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'；②SIRT1 F：5'-TCATCTGTGAAAGTGATGAGGA-3'，R：5'-CTGCCACAGTGTCATATCATCA-3'；③PGC-1α F：5'-GTGCAGCCAAGACTCTGTATGG-3'，R：5'-GTCCAGGTCATTCACATCAAGCAAGTT-3'。

1.2.6 肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白檢測 取出凍存?zhèn)溆玫姆谓M織粉末少許，加入裂解液，振蕩使蛋白質(zhì)充分裂解，加入0.5 ml 提取液，4 ℃靜置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，收集蛋白，與上樣緩沖液混合加熱5 min，倒入孔道，跑膠后取出，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一 抗（GAPDH 抗 體、SIRT1 抗 體、PGC-1α 抗 體，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。棄封閉液，TBST清洗3次，5 min/次。加入二抗（1∶1 500），常溫孵育45 min，TBST 清洗3 次，5 min/次。將發(fā)光液混合倒于膜上，室溫充分浸泡1 min，置于Syngene 光密度掃描系統(tǒng)上進行條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 PARP-1 抑制劑對COPD 大鼠肺組織病理變化的影響 健康組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡完好，肺泡壁完整，未出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、充血、滲出等現(xiàn)象；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大面積損傷，喪失完整的肺泡壁，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤；PARP-1 抑制劑處理組肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡壁較為完整，較模型組有所改善，仍有少量炎癥細胞浸潤；PARP-1 抑制劑+PGC-1α抑制劑組肺組織結(jié)構(gòu)缺失較多，肺泡壁有大量炎癥細胞浸潤，見圖1。

圖1 COPD大鼠肺組織病理變化（HE，×400）Fig.1 Pathological changes of lung tissue in COPD rats（HE，×400）

2.2 PARP-1 抑制劑對COPD 大鼠肺組織炎癥的影響 與健康組相比，模型組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，PARP-1 抑制劑處理組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著降低（P<0.05）；與PARP-1抑制劑處理組相比，PARP-1抑制劑+PGC-1α抑制劑組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均顯著升高（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 levels in lung tissue of rats in each group （±s， n=12）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 levels in lung tissue of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with healthy group， 1）P<0.05；compared with model group， 2）P<0.05；compared with PARP-1 inhibitor treatment group， 3）P<0.05.

Groups Healthy Model PARP-1 inhibitor treatment PARP-1 inhibitor+PGC-1α inhibitor TNF-α/（pg·ml-1）21.84±2.89 164.73±7.781）53.73±4.791）2）IL-1β/（pg·ml-1）4.83±1.28 62.16±6.871）12.61±5.821）2）IL-6/（ng·ml-1）7.52±3.52 48.63±6.871）13.57±3.351）2）128.98±8.481）2）3）48.15±6.671）2）3）26.73±4.761）2）3）

2.3 PARP-1 抑制劑對COPD 大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與健康組相比，模型組大鼠血清中MDA含量顯著升高，SOD 含量顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，PARP-1 抑制劑處理組大鼠血清中MDA 含量顯著降低，SOD 含量顯著升高（P<0.05）；與PARP-1抑制劑處理組相比，PARP-1抑制劑+PGC-1α抑制劑組大鼠血清中MDA 含量顯著升高，SOD含量顯著降低（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清MDA、SOD水平比較 （±s，n=12）Tab.2 Comparison of serum MDA and SOD levels of rats in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠血清MDA、SOD水平比較 （±s，n=12）Tab.2 Comparison of serum MDA and SOD levels of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with healthy group， 1）P<0.05；compared with model group， 2）P<0.05；compared with PARP-1 inhibitor treatment group， 3）P<0.05.

Groups Healthy Model PARP-1 inhibitor treatment PARP-1 inhibitor+PGC-1α inhibitor MDA/（μmol·L-1）1.45±0.22 16.83±2.431）4.98±0.251）2）12.23±1.451）2）3）SOD/（U·L-1）146.32±5.25 56.52±3.521）115.65±4.721）2）84.48±3.521）2）3）

2.4 PARP-1 抑制劑對COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 表達的影響 模型組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 表達顯著低于健康組（P<0.05）；PARP-1抑制劑處理組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 表達顯著高于模型組（P<0.05）；PARP-1 抑制劑+PGC-1α 抑制劑組COPD 大鼠 肺 組 織SIRT1、PGC-1α mRNA 表 達 顯 著 低 于PARP-1抑制劑處理組（P<0.05），見表3。

表3 各組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 表達比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of SIRT1，PGC-1α mRNA expressions in lung tissue of COPD rats in each group （±s，n=12）

表3 各組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 表達比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of SIRT1，PGC-1α mRNA expressions in lung tissue of COPD rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with healthy group， 1）P<0.05；compared with model group， 2）P<0.05；compared with PARP-1 inhibitor treatment group， 3）P<0.05.

PGC-1α mRNA 0.96±0.08 0.32±0.031）0.83±0.111）2）0.56±0.061）2）3）Groups Healthy Model PARP-1 inhibitor treatment PARP-1 inhibitor+PGC-1α inhibitor SIRT1 mRNA 1.04±0.26 0.26±0.131）0.85±0.141）2）0.58±0.161）2）3）

2.5 PARP-1 抑制劑對COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白表達的影響 模型組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白表達量顯著低于健康組（P<0.05）；PARP-1 抑 制 劑 處 理 組COPD 大 鼠 肺 組 織SIRT1、PGC-1α 蛋白表達量顯著高于模型組（P<0.05）；PARP-1 抑制劑+PGC-1α 抑制劑組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白表達量顯著低于PARP-1抑制劑處理組（P<0.05），見圖2、表4。

表4 各組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白的表達（±s，n=12）Tab.4 Expressions of SIRT1 and PGC-1α proteins in lung tissue of COPD rats in each group （±s，n=12）

表4 各組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α 蛋白的表達（±s，n=12）Tab.4 Expressions of SIRT1 and PGC-1α proteins in lung tissue of COPD rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with healthy group， 1）P<0.05；compared with model group， 2）P<0.05；compared with PARP-1 inhibitor treatment group， 3）P<0.05.

Groups Healthy Model PARP-1 inhibitor treatment PARP-1 inhibitor+PGC-1α inhibitor SIRT1/GAPDH PGC-1α/GAPDH 1.84±0.28 0.43±0.101）1.47±0.161）2）3.73±0.26 1.27±0.241）2.93±0.271）2）1.08±0.261）2）3）1.63±0.161）2）3）

圖2 各組COPD大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α蛋白表達Fig.2 Expressions of SIRT1 and PGC-1α proteins in lung tissue of COPD rats in each group

3 討論

COPD 作為常見的呼吸道疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜多變［9］。有文獻指出，氧化應(yīng)激、組織纖維化、炎癥因子釋放造成的異常炎癥反應(yīng)及蛋白酶失衡均可能引起COPD［10］。越來越多的研究也傾向于炎癥因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)在COPD 等相關(guān)疾病中具有重要作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，健康組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完好，而模型組肺組織損傷，且出現(xiàn)大量炎癥細胞。同時有文獻指出，TNF-α、IL-1β、IL-6 作為常見的促炎因子，常通過其含量變化說明炎癥反應(yīng)的發(fā)生情況［12］。MDA 作為過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，測定MDA含量可反映機體過氧化程度，而SOD 是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子自由基發(fā)揮作用，MDA 與SOD分別是評定氧化應(yīng)激反應(yīng)中氧化能力和抗氧化能力的重要指標［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均顯著升高，同時血清中MDA 含量顯著升高，SOD 含量顯著降低，說明COPD 大鼠的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)均明顯增強，這與文獻中指出的COPD 疾病中炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇的結(jié)果一致［14］。

有文獻指出，PARP-1抑制劑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)，同時對炎癥因子具有調(diào)控作用［15-16］。推測PARP-1 抑制劑可能具有調(diào)節(jié)COPD 大鼠體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕病情的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑處理后，肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡壁較為完整，較模型組有所改善，肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均顯著下降，MDA 含量顯著減少，SOD 含量顯著增多，說明PARP-1 抑制劑處理后，肺組織結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)均有所改善，確有減輕COPD 疾病中炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，與之前的假設(shè)一致，同時與文獻中PARP-1 抑制劑參與調(diào)控炎癥及氧化應(yīng)激的報道一致［17］。

有文獻指出，PGC-1α作為一種氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可增加去乙酰化酶活性，參與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］。也有研究指出PARP-1 抑制劑對SIRT1-PGC-1α軸相關(guān)基因具有調(diào)控作用，可通過增強SIRT1及PGC-1α表達減輕氧化應(yīng)激，減輕糖尿病小鼠的心肌病癥狀［19］。推測PARP-1 抑制劑可通過調(diào)節(jié)SIRT1-PGC-1α 軸相關(guān)基因，參與緩解COPD病情。為明確PARP-1 抑制劑是否通過SIRT1-PGC-1α 軸對COPD 產(chǎn)生影響，本研究同時檢測了SIRT1、PGC-1α mRNA 及蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)模型組COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 及蛋白表達量均顯著低于健康組，而PARP-1 抑制劑處理后，COPD 大鼠肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA 及蛋白表達量顯著升高，表明PARP-1 抑制劑對SIRT1、PGC-1α 有激活作用。為進一步明確PARP-1 抑制劑對SIRT1、PGC-1α 的作用，增設(shè)PARP-1 抑制劑+PGC-1α 抑制劑組，發(fā)現(xiàn)添加PGC-1α 抑制劑后，肺組織SIRT1、PGC-1α mRNA及蛋白表達量顯著降低，同時大鼠肺組織結(jié)構(gòu)分裂，炎癥細胞數(shù)量、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量及血清中MDA 含量均顯著升高，SOD 含量顯著降低，進一步證實PARP-1 抑制劑可能通過激活SIRT1-PGC-1α 軸發(fā)揮對COPD大鼠病情的緩解作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PARP-1 抑制劑可有效降低炎癥因子含量，減輕炎癥危害，同時降低MDA含量，提高SOD 含量，增強抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時，PARP-1 抑制劑可激活SIRT1-PGC-1α 軸，進一步參與通路調(diào)控，從而有效緩解COPD病情。PARP-1 抑制劑有很大的應(yīng)用空間，SIRT1-PGC-1α 軸可作為PARP-1 抑制劑作用的新靶點。PARP-1 抑制劑是否還通過其他作用途徑間接調(diào)控COPD仍有待進一步實驗加以說明。