基于Nrf2/ARE通路探討CDDO-Im對缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護作用①

郭瀟瀟 劉夢珂 劉歡歡 宋景貴 （新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衛(wèi)輝 453100）

缺血性腦卒中是最常見的致殘性疾病，其病理機制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、能量代謝障礙等，其中炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中后神經(jīng)功能的損傷及修復(fù)中起著關(guān)鍵性作用，炎癥反應(yīng)調(diào)控可能是缺血性腦卒中一個治療靶點［1-2］。

核轉(zhuǎn)錄因E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）通路是機體重要的防御機制，能夠在多種模型中對炎癥刺激做出響應(yīng)，并發(fā)揮保護細(xì)胞或組織的作用［3-4］。最新研究表明，Nrf2/ARE 通路的抗炎作用可能與巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)［5-6］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，可以極化為經(jīng)典激活型（M1）和替代激活型（M2 型）兩種表型，釋放不同的細(xì)胞因子，發(fā)揮促炎與抗炎的雙重作用［7-8］。因此，本課題組推測激活Nrf2/ARE通路可能通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，在缺血性腦卒中后發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但目前關(guān)于這方面的研究還相對較少。

研究發(fā)現(xiàn)，CDDO-Im（2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-imidazolide）是一種人工合成的三萜類化合物，能激活Nrf2/ARE 通路［9］。本研究建立了缺血性腦卒中大鼠模型，經(jīng)尾靜脈給予CDDO-Im，探究CDDO-Im 激活Nrf2/ARE 通路對大鼠腦形態(tài)、神經(jīng)功能的影響，并通過分析小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1、促炎因子IL-1β 和抗炎因子IL-4 的表達(dá)情況，進(jìn)一步探究其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只質(zhì)量為180～220 g 的SPF級雄性SD 大鼠，購自北京Charles River 公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006，在獨立通風(fēng)籠具中飼養(yǎng)1周以適應(yīng)實驗室環(huán)境，飼養(yǎng)條件為（23±1） ℃，濕度（55±3）%，12 h/12 h 明暗周期，自由飲食飲水，此次動物實驗經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院批準(zhǔn)（審批號2019049）。

1.1.2 試劑 Nrf2 抗體（Abcam 公司）；IL-4 抗體、HO-1 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；IL-1β抗體（武漢云克隆科技股份有限公司）；Iba1 抗體（Cell signaling technology 公司）；CDDO-Im（Medchemexpress 公司）；TTC 染料（2，3，5-triphenyte-trazolium-chloride，TTC）（Sigma-aldrich 公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)）；胞漿胞核分離試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司）；Histone 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 SD 大鼠隨機分為3 組：假手術(shù)組（S 組）、卒中組（M 組）及CDDO-Im 干預(yù)組（M+C 組）。M 組及M+C 組大鼠采用大腦中動脈阻塞法（MCAO）［10］制作卒中模型，S組大鼠于相同部位切開皮膚并分離左側(cè)頸動脈后縫合處理，左側(cè)頸總動脈不插入線栓。M+C 組大鼠在行MCAO 術(shù)后連續(xù)3 d 12 h/次經(jīng)尾靜脈注射64 μg/300 g 的CDDOIm，S組和M組大鼠給予等量生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能評定 采用腦神經(jīng)缺損癥狀評分，即Longa 評分［10］，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定。評分越高代表神經(jīng)功能缺損越明顯，選擇評分1～3分大鼠入組，最終每組入選18只以上。

1.2.3 TTC染色 取大鼠新鮮腦組織后，立即放在-20 ℃下冷凍20 min。將其切成冠狀位腦片，并放入盛有TTC 溶液的避光容器中，在37 ℃條件下染色30 min。為便于拍照，將腦片轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中。梗死區(qū)域呈蒼白色，正常區(qū)域呈鮮紅色，最后采用Image J軟件計算腦梗死面積，腦梗死面積百分比=梗死區(qū)域面積/總面積×100%。

1.2.4 Western blot 取大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)區(qū)等量腦組織，使用胞漿胞核分離試劑盒提取胞核蛋白或RIPA 裂解液提取勻漿蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)含量。加入蛋白上樣緩沖液并變性后，使用12%SDSPAGE 分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后在脫脂牛奶中封閉。洗膜后加入一抗稀釋液（Nrf2、HO-1、IL-1β、IL-4 及Iba1 抗體）在4 ℃冰箱過夜，第2 天選擇合適的二抗（辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG），室溫下孵育1 h并洗膜。最后將目的條帶進(jìn)行曝光，并使用Image J 軟件進(jìn)行定量。結(jié)果分別用Histone H3、β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計、分析等處理。多組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩之間采用LSD-t檢驗進(jìn)行比較，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給予CDDO-Im 可改善卒中大鼠的神經(jīng)功能根據(jù)Longa 評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定，結(jié)果顯示S 組大鼠無神經(jīng)功能缺損，Longa 評分均為0 分；M 組大鼠與S 組大鼠相比，出現(xiàn)不同程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，Longa 評分為（2.333±0.767）分，集中在2～3 分，提示MCAO 造模成功；而使用CDDO-Im 干預(yù)后，M+C 組大鼠雖然也出現(xiàn)了運動、肢體伸展受限等癥狀，但Longa 評分整體較M組降低［（1.833±0.707）分，P<0.05］，表明CDDO-Im 可降低大鼠Longa 評分，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 給予CDDO-Im 能減少卒中大鼠的腦梗死面積 經(jīng)過TTC 染色，并經(jīng)處理后計算腦梗死面積，如圖1 所示，S 組大鼠未插入線栓，沒有出現(xiàn)腦梗死區(qū)域，其余兩組大鼠均出現(xiàn)了明顯的腦梗死區(qū)域，M組與M+C 組大鼠相比腦梗死區(qū)域顯著，表明CDDOIm可減少大鼠腦梗死面積（P<0.05）。

圖1 各組大鼠腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarct area of rats in each group

2.3 給予CDDO-Im 可激活Nrf2 通路，促進(jìn)下游蛋白HO-1 的表達(dá) 使用胞核胞漿分離試劑盒分離出胞核蛋白，并用Western blot 法檢測Nrf2 水平，結(jié)果如圖2A 所示，與S 組大鼠相比，M 組大鼠胞核Nrf2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但有升高趨勢，而M+C 組大鼠Nrf2 水平較M 組大鼠升高顯著（P<0.05），提示CDDO-Im 可以促使Nrf2 入核。再次使用Western blot 法檢測大鼠勻漿蛋白中HO-1 水平，結(jié)果如圖2B 所示，與S 組相比，M 組大鼠HO-1 表達(dá)顯著升高（P<0.05），且與M 組大鼠相比，M+C 組大鼠HO-1 蛋白水平進(jìn)一步升高（P<0.05），表明經(jīng)過CDDO-Im 處理，可以激活Nrf2通路，上調(diào)Nrf2、HO-1的表達(dá)。

圖2 各組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)區(qū)腦組織Nrf2/ARE 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of Nrf2/ARE pathway related proteins in infarcted cortex of rats in each group

2.4 給予CDDO-Im 能調(diào)控卒中后大鼠的炎癥反應(yīng) 通過Western blot 檢測各組大鼠炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，如圖3所示，與S組大鼠相比，M組大鼠Iba1、IL-1β、IL-4 水平均明顯升高（P<0.05），提示卒中后存在小膠質(zhì)細(xì)胞激活，以及促炎及抗炎因子的釋放；給予CDDO-Im 后，Iba1、IL-1β 水平與M 組大鼠相比均明顯降低（P<0.05），而IL-4蛋白表達(dá)則較M組顯著升高（P<0.05），提示給予CDDO-Im可以減少M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，并促進(jìn)其向M2型轉(zhuǎn)化。

圖3 各組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)區(qū)腦組織Iba1、IL-1β、IL-4 蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of Iba1，IL-1β and IL-4 proteins in infarcted cortex of rats in each group

3 討論

缺血性腦卒中是指由血栓形成或血管狹窄導(dǎo)致的局限性腦組織缺血，而長時間缺血可使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆性損傷，最終導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾甚至死亡［1］。本研究在卒中模型的基礎(chǔ)上給予CDDO-Im干預(yù)，結(jié)果顯示大鼠Longa 評分整體降低，運動狀況、肢體伸展、活動狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，TTC 染色顯示腦梗死區(qū)域顯著減小，表明CDDO-Im 可以對缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

CDDO-Im 作為Nrf2/ARE 通路的激活劑被廣泛研究，在慢性腎臟病、心臟衰老等體內(nèi)和體外實驗中均可以發(fā)揮預(yù)防和治療作用［11-12］。研究證實，Nrf2/ARE 通路是機體最重要的內(nèi)源性防御機制，在機體受到刺激后，Nrf2 與負(fù)調(diào)控蛋白Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（kelch-1ike ech-associated protein l，Keap1）解離并入核，激活下游的保護性蛋白酶，發(fā)揮抗腫瘤、抗氧化、抗炎等保護作用［4，13-14］。本研究結(jié)果顯示腦卒中后大鼠細(xì)胞核中Nrf2 蛋白和組織勻漿中HO-1 蛋白表達(dá)均升高，但Nrf2 的升高差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與課題組的預(yù)期結(jié)果不符，但回顧以往相關(guān)研究［15-16］，缺血性腦卒中后Nrf2 及HO-1表達(dá)均上調(diào)，且AMIN 等［17］的結(jié)果與本研究一致，推測在缺血性腦卒中后早期，確實存在著內(nèi)源性Nrf2的升高，但是這種Nrf2 的激活水平較低，可能并不能發(fā)揮充分的神經(jīng)保護作用。CDDO-Im 干預(yù)后，大鼠胞核的Nrf2 及其下游的HO-1 均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明在缺血性腦卒中后，CDDO-Im 可以有效激活Nrf2/ARE 通路，并上調(diào)下游保護性蛋白酶HO-1。

缺血性腦卒中的病理機制復(fù)雜，炎癥與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HO-1 作為Nrf2/ARE 通路的下游蛋白酶，具有強大的抗炎作用。早在1996 年，WILLIS等［18］在胸膜炎動物模型中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HO-1 酶可以預(yù)防炎癥，而抑制HO-1 酶會加劇炎癥。最近研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的抗炎作用機制可能與巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)［5-6，19］，且ZHANG 等［20］研究表明敲除小鼠HO-1 基因后M1 型巨噬細(xì)胞表達(dá)增多，M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)減少，而HO-1 過表達(dá)小鼠的結(jié)果則相反。小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中后首先被激活，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，具有M1 型和M2 型兩種狀態(tài)。多項實驗證實，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎因子，加重腦損傷；而外源性給予IL-4、IL-13 等Th2 型細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，并釋放IL-4、IL-10 和TGF-β 等抗炎因子，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)［8，21］。本研究結(jié)果顯示缺血性腦卒中發(fā)生后Iba1、IL-1β、IL-4 均增多，提示卒中后存在著小膠質(zhì)細(xì)胞激活，以及促炎及抗炎因子的釋放；而使用CDDO-Im 干預(yù)后Iba1、IL-1β 的表達(dá)減少，IL-4 的表達(dá)進(jìn)一步增多，這說明Nrf2/ARE 通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活后的炎癥反應(yīng)，給予CDDO-Im可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，致使促炎因子表達(dá)減少，并向M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，改善神經(jīng)功能損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CDDO-Im 可激活缺血性腦卒中大鼠Nrf2/ARE 信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減輕腦組織損傷，這種作用可能是通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，調(diào)控促炎與抗炎反應(yīng)來實現(xiàn)的。這尚需更多的證據(jù)，但本研究為缺血性腦卒中后神經(jīng)功能的損傷修復(fù)提供了新的思路。