基于生物信息與機(jī)器學(xué)習(xí)分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病特征基因與免疫細(xì)胞的關(guān)系①

宋世雷 陳躍平 陳 鋒 （廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要病理特征的一種自身免疫性疾病，其發(fā)展與自身抗體病理過程相關(guān)，發(fā)病初期可在血清中發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）和抗瓜氨酸蛋白抗體（anti-citrulline protein antibody，ACPA）水平升高［1］。隨著各種免疫細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，滑膜組織逐漸產(chǎn)生慢性炎癥，并發(fā)生骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞，出現(xiàn)臨床癥狀和損傷，進(jìn)而發(fā)展為嚴(yán)重殘疾，此外全身炎癥可損害多個(gè)器官系統(tǒng)，如心臟組織、血管系統(tǒng)、腎臟、肺組織和神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［2-3］。

RA 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與遺傳、表觀遺傳學(xué)、環(huán)境、代謝、免疫和微生物因素相互作用有關(guān)，尚未得到系統(tǒng)性闡述。臨床研究和實(shí)驗(yàn)室研究均發(fā)現(xiàn)RA 疾病進(jìn)展受多種免疫細(xì)胞影響，如T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞等［4］。這些免疫細(xì)胞在疾病微環(huán)境中表現(xiàn)出不同作用，而作用不同取決于疾病環(huán)境與疾病特征基因表達(dá)不同，因此免疫細(xì)胞介導(dǎo)的滑膜炎癥和軟骨破壞機(jī)制可能在不同患者中有不同表現(xiàn)，導(dǎo)致RA 存在臨床異質(zhì)性，極大影響治療的準(zhǔn)確性［5］。因此需要尋找一種可通過檢測不同患者疾病特征基因表達(dá)情況進(jìn)行提前診斷與評估患者RA發(fā)生及發(fā)生后免疫細(xì)胞浸潤情況的方法，實(shí)現(xiàn)早期診斷與精準(zhǔn)治療。

生物信息學(xué)作為一種新型研究手段，可高效系統(tǒng)地了解疾病分子作用方式，利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫中的RA 患者與健康者滑膜組織進(jìn)行合并分析，尋找RA 滑膜組織中的差異基因與分子通路，運(yùn)用機(jī)械學(xué)習(xí)法篩選RA 疾病特征基因并探討疾病特征基因與免疫浸潤情況的相關(guān)性，為系統(tǒng)闡述發(fā)病機(jī)制及預(yù)防和提早診斷RA 提供更多依據(jù)，最終實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫下載GSE12021、GSE55235 和 GSE77298 基因表達(dá)譜芯片。GSE12021 數(shù)據(jù)集包含12 例RA 患者和9 例正常關(guān)節(jié)患者滑膜組織，RA 滑膜組織由德國漢諾威臨床化學(xué)研究所胡貝兒教授對該類患者行關(guān)節(jié)置換術(shù)或滑膜切除術(shù)后提取，正常滑膜組織則由創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)骨折患者提?。?］。GSE55235數(shù)據(jù)集包括10例RA患者和10 例正常關(guān)節(jié)患者滑膜組織，RA 滑膜組織由WOETZEL 等［7］在進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)或滑膜切除術(shù)時(shí)收集，正常組滑膜組織來源于死亡患者正常關(guān)節(jié)或創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)骨折患者；GSE77298數(shù)據(jù)集包括16例RA患者和7例正常關(guān)節(jié)患者滑膜組織，由Mathijs活檢 所 得，基 于GLP570 平 臺 完 成［8］；GSE12021、GSE55235數(shù)據(jù)集均基于GPL96平臺完成。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因篩選 運(yùn)用Perl 腳本對GSE12021、GSE55235 數(shù)據(jù)集進(jìn)行整理，R 軟件（版本4.1.2）“SVA”包對整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理合并，獲取基因批次信息，運(yùn)用R軟件“l(fā)imma”包分別對兩組合并后的批次信息進(jìn)行常規(guī)矯正，輸出矯正后的結(jié)果，篩選矯正后同時(shí)符合adj.P<0.05 和|log2FC|>2 的基因作為差異表達(dá)基因，分析得到差異基因，輸出矯正后的差異基因表達(dá)和差異結(jié)果，“pheatmap”“ggplot2”軟件包構(gòu)建整合數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的分層聚類圖與火山圖。

1.3 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析 為探求差異表達(dá)基因主要功能和途徑，通過R 軟件“Bioconductor”包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，篩選有顯著差異的基因（P<0.05）；GO 富集分析包含生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular constituent，CC）和分子功能（molecular function，MF），通過“ggplot2”包對富集結(jié)果進(jìn)行可視化，分別繪制GO和KEGG圈圖、氣泡圖和柱狀圖。

1.4 機(jī)器學(xué)習(xí)法獲取疾病特征基因 運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)法在差異基因中尋找疾病特征基因，首先運(yùn)用LASSO回歸法：R 軟件“glmnet”包對差異基因表達(dá)進(jìn)行過濾，通過交叉驗(yàn)證尋找誤差最小的基因則為疾病特征基因。運(yùn)用SVM-RFE 法篩選疾病特征基因：R 軟件“e1071”“kernlab”“caret”包對差異基因表達(dá)進(jìn)行過濾，通過交叉驗(yàn)證尋找誤差最小的基因則為疾病特征基因，將兩者篩選的疾病特征基因取交集，繪制VENN圖，篩選最終的疾病特征基因，對篩選獲得的基因進(jìn)行ROC 曲線檢測，GSE77298 與交集疾病特征基因進(jìn)行驗(yàn)證，繪制ROC曲線。

1.5 芯片的免疫浸潤分析 使用R 軟件（4.1.2 版本）通過CIBERSORT 算法對以上獲得的聯(lián)合芯片的矯正基因表達(dá)矩陣進(jìn)行分析，篩選P<0.05 的樣品，并計(jì)算各樣品中22種免疫細(xì)胞占比。利用“vioplot”軟件包比較篩選的RA 樣品與正常樣品滑膜組織，分析兩組間各免疫細(xì)胞浸潤水平，P<0.05 代表兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 疾病特征基因與免疫細(xì)胞的關(guān)系 使用R 軟件（4.1.2 版 本）“l(fā)imma”“reshape2”“ggpubr”“ggExtra”包對疾病特征基因免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果與校正后的差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行依次相關(guān)性分析，觀察各疾病特征基因表達(dá)與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，并對其統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，繪制相關(guān)性棒棒糖圖。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 在GEO 網(wǎng)站［Home-GEONCBI（nih.gov）］下載原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用Perl 腳本對各基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，處理后的數(shù)據(jù)用R 軟件進(jìn)行再次處理，將GSE55235 和GSE12021 整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、合并、分析，共得到差異基因12 548 個(gè)，包含5 935 個(gè)上調(diào)基因和6 613 個(gè)下調(diào)基因，設(shè)定adj.P<0.05 和|log2FC|>2 為過濾條件，最終篩選出90 個(gè)差異基因，包含64 個(gè)上調(diào)基因和26 個(gè)下調(diào)基因，繪制差異基因熱圖和火山圖（圖1）。圖1A 中正常組為Control 組，疾病組為Treat 組，紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色為低表達(dá)，顏色越深代表程度越高，圖1B紅色為高表達(dá)，綠色為低表達(dá)。

圖1 差異基因熱圖與火山圖Fig.1 Heatmap and volcanic map of difference genes

2.2 差異基因GO與KEGG 富集分析 通過R軟件（4.1.2）對篩選出的90 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，得到GO 和KEGG 圈圖。結(jié)果顯示GO 分析共得到主要條目209 個(gè)，KEGG 富集分析共得到11 個(gè)項(xiàng)目，其中GO BP 190 個(gè)，CC 5 個(gè)，MF 14 個(gè)，主要涉及白細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞活化、B 細(xì)胞受體信號通路、吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、淋巴細(xì)胞分化、體液免疫反應(yīng)等（圖2A）；KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)RA 相關(guān)通路有趨化因子信號通路、IL-17信號通路、Toll 樣受體信號通路、PPAR 信號通路、原發(fā)性免疫缺陷等（圖2B）。

圖2 GO與KEGG圈圖Fig.2 GO and KEGG circle graphs

2.3 機(jī)械學(xué)習(xí)法獲取疾病特征基因 運(yùn)用LASSO回歸，通過R 軟件“glmnet”包對差異基因表達(dá)進(jìn)行過濾，取誤差最小值的前10 個(gè)基因?yàn)榧膊√卣骰?，繪制相關(guān)可視化圖（圖3A），縱坐標(biāo)代表誤差大小，橫坐標(biāo)代表基因個(gè)數(shù)，基因誤差按從高到低排名 依 次 得 到IGHM、SLAMF8、CXCL10、FNDC4、AIM2、EGR1、AKR1B10、FKBP5、TLR8、LIF，發(fā) 現(xiàn)第10個(gè)基因LIF誤差最??；運(yùn)用SVM-RFE 法篩選疾病特征基因：通過R 軟件“e1071”“kernlab”“caret”包對差異基因表達(dá)進(jìn)行過濾，交叉驗(yàn)證尋找誤差最小的疾病特征基因并進(jìn)行可視化分析（圖3B），縱坐標(biāo)代表誤差大小，橫坐標(biāo)代表基因個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)誤差表達(dá)最小的點(diǎn)共90個(gè)基因，將兩者各自得到的疾病特征基因取交集，繪制韋恩圖（圖4），得到IGHM、SLAMF8、CXCL10、FNDC4、AIM2、EGR1、AKR1B10、FKBP5、TLR8、LIF 10 個(gè)疾病特征基因，繪制10 個(gè)疾病特征基因的ROC 曲線，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)疾病特征基因AUC 均>80%，運(yùn)用測試基因芯片對上述10 個(gè)特征基 因 進(jìn) 行 檢 測，發(fā) 現(xiàn)IGHM、SLAMF8、CXCL10、AIM2、AKR1B10 AUC均>0.8，說明IGHM、SLAMF8、CXCL10、AIM2、AKR1B10為疾病特征基因。

圖3 LASSO回歸圖與SVM-RFE圖Fig.3 LASSO regression and SVM-RFE

圖4 VENN圖Fig.4 VENN diagram

2.4 芯片免疫浸潤分析 CIBERSORT 算法分析矯正后的兩個(gè)芯片基因表達(dá)，其中RA 組有22 個(gè)滑膜組織樣本，正常組有19 個(gè)滑膜組織樣本，同時(shí)篩選得到符合條件的22 個(gè)RA 與19 個(gè)正常組的22 個(gè)免疫細(xì)胞浸潤存在差異，計(jì)算41個(gè)樣品免疫細(xì)胞占比（圖5A）。與正?；は啾龋琑A 滑膜中漿細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、記憶靜息T 細(xì)胞CD4、記憶激活T 細(xì)胞CD4、T細(xì)胞濾泡輔助器、激活的NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1、活化的肥大細(xì)胞9 種免疫細(xì)胞與正常組織存在明顯差異（圖5B）。

圖5 免疫細(xì)胞占比柱狀圖及小提琴圖Fig.5 Proportion of immune cells columnar and vioplot

2.5 疾病特征基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 使用 R 軟件（4.1.2 版本）“l(fā)imma”“reshape2”“ggpubr”“ggExtra”包對5個(gè)疾病特征基因的免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果與校正后的差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行依次相關(guān)性分析，觀察各疾病特征基因表達(dá)與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，繪制可視化棒棒糖圖（圖6），從左到右依次對應(yīng)SLAMF8、IGHM、CXCL10、AIM2、AKR1B10，最左側(cè)縱坐標(biāo)代表免疫細(xì)胞，最右側(cè)為P值大小，圓圈越大代表P絕對值越小，發(fā)現(xiàn)CD8 T 細(xì)胞、漿細(xì)胞、濾泡輔助細(xì)胞、激活記憶T 細(xì)胞CD4 在SLAMF8、IGHM、AIM2、CXCL10基因中的表達(dá)較高，且該基因與這些免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性，活化的肥大細(xì)胞、記憶靜息CD4 T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的NK 細(xì)胞在AKR1B10基因中表達(dá)較高，且該基因與這些免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性。SLAMF8還有M1巨噬細(xì)胞和B記憶細(xì)胞，IGHM 基因還有M1 巨噬細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞和γδT 細(xì)胞，AIM2 還有M1 巨噬細(xì)胞與γδT 細(xì)胞，CXCL10還有M1巨噬細(xì)胞。

圖6 疾病特征基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性的棒棒糖圖Fig.6 Lollipop chart of correlation between disease characteristic genes and immune cells

3 討論

RA 是一種慢性、多系統(tǒng)的自身免疫病，其特征為持續(xù)性滑膜炎癥，通常對稱分布于關(guān)節(jié)周圍，某些病例中出現(xiàn)全身癥狀。遺傳、環(huán)境因素和自身免疫3個(gè)重要因素在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

通過公共基因芯片數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載RA 芯片數(shù)據(jù)，對其進(jìn)行數(shù)據(jù)合并分析，設(shè)定篩選條件后共篩選出差異基因90 個(gè)，包含64 個(gè)上調(diào)基因和26 個(gè)下調(diào)基因，對上述基因進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，GO 結(jié)果顯示其主要富集于淋巴細(xì)胞活化、B 細(xì)胞受體信號通路、吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、淋巴細(xì)胞分化、體液免疫反應(yīng)，上述機(jī)體功能表達(dá)均與免疫息息相關(guān)［9］。淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中最小的一種免疫細(xì)胞，由淋巴器官產(chǎn)生，根據(jù)淋巴細(xì)胞來源、表面標(biāo)志物與免疫功能主要分為T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)以上3 種免疫細(xì)胞在RA 發(fā)生機(jī)制上有各自的重要作用［10-12］。當(dāng)T 淋巴細(xì)胞被激活，經(jīng)歷一系列轉(zhuǎn)變得到致敏T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤、抗異體細(xì)胞作用，T 淋巴細(xì)胞激活和分化是促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展的重要生理病理過程。研究發(fā)現(xiàn)RA 初始階段涉及T 細(xì)胞和B 細(xì)胞激活，由T細(xì)胞與B細(xì)胞主導(dǎo)和組織促炎細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，這些炎癥因子包括TNF-α、IL-1、IL-17等，最終刺激骨和軟骨炎癥及降解［13］。B 淋巴細(xì)胞主要通過產(chǎn)生并分泌免疫球蛋白和細(xì)胞內(nèi)因子，包括抗原呈遞和T細(xì)胞激活，與趨化因子相互作用，促進(jìn)TNF-α形成，激活巨噬細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)［14］。另有研究認(rèn)為B細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮更重要作用，主要原因?yàn)锽 細(xì)胞產(chǎn)生RF（抗IgG 自身抗體），且B 細(xì)胞介導(dǎo)的抗CCP 產(chǎn)生后，RA 診斷的特異度已提高至90%～98%［15］。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)RA 相關(guān)通路有趨化因子信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、PPAR 信號通路、原發(fā)性免疫缺陷等。IL-17屬于T 細(xì)胞子集，主要由CD4+Th17 細(xì)胞產(chǎn)生，也可由CD8+T 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴組織誘導(dǎo)劑樣細(xì)胞產(chǎn)生，IL-17 家族由IL-17A～I(xiàn)L-17F 6 個(gè)成員組成，參與自身免疫病發(fā)生發(fā)展［16］。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17 信號通路與RA 顯著相關(guān)，主要與炎癥發(fā)生、軟骨細(xì)胞破壞、骨質(zhì)破壞有關(guān)［17-19］。有證據(jù)表明IL-17 信號通路是關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生的重要誘因，在RA 大鼠關(guān)節(jié)中注射IL-17 后發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞增殖與功能增強(qiáng)，可能與IL-17 信號通過誘導(dǎo)各種趨化因子和多種炎癥介質(zhì)分泌，包括IL-8、CXCL1、CXCL6、IL-1β、IL-6、TNF-α、GM-CSF、MIP-2、MCP-1 和G-CSF 等，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集有關(guān)，IL-17 還發(fā)揮IL-17RA 和IL-17RC 介導(dǎo)的抗凋亡作用，促進(jìn)滑膜組織增生，表明IL-17 通過刺激滑膜炎癥和滑膜組織增生引發(fā)RA［20］。IL-17還可上調(diào)RANK 和M-CSF 因子，在RANKL 和M-CSF刺激下，破骨細(xì)胞分泌各種中間體和促炎介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，促進(jìn)骨丟失，可見IL-17 信號通路在RA 發(fā)生中占據(jù)重要位置［21］。Toll 樣受體屬于蛋白質(zhì)識別受體，人類中Toll 樣受體家族由10 個(gè)成員組成，即TLR1～TLR10，Toll 樣受體通過感知保守的病原體相關(guān)微生物模式和細(xì)胞損傷后產(chǎn)生的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式變化引發(fā)固有免疫應(yīng)答［22］。研究發(fā)現(xiàn)RA 中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7 免疫活性在滑膜組織的內(nèi)膜和下層表達(dá)上調(diào)，而在骨關(guān)節(jié)炎患者和健康供體滑膜組織中低表達(dá)，早期RA 滑膜中主要表現(xiàn)為TLR3 和TLR4 表達(dá)上調(diào)，而后期RA 滑膜則表現(xiàn)為TLR2、TLR3 和TLR4 上調(diào)，Toll 樣受體特異性高表達(dá)說明其在RA 發(fā)病中的重要作用［22］。Toll 樣受體信號通路對RA 的作用機(jī)制主要通過與外源性或內(nèi)源性配體結(jié)合被激活，其中髓系分化原代反應(yīng)蛋白88（MyD88）和誘導(dǎo)含TLR 結(jié)構(gòu)域的適配器蛋白IFN-β（TRIF）是TLR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個(gè)主要配體，TLRs與MyD88結(jié)合后刺激IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）磷酸化，導(dǎo)致TRAF（TNF 受體相關(guān)因子）募集，從而激活NF-κB 信號通路和MAPK 信號通路，MAPK 信號通路下游包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、C-Junn 端激酶（JNK）和P38，最終誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1 和IL-12 表達(dá)，提高炎癥細(xì)胞趨化因子與IFN-α/β 誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物表達(dá)，TLRs與TRIF結(jié)合則誘導(dǎo)IRF3/7表達(dá)從而引起IFN-β表達(dá)升高，說明Toll樣受體信號通路是RA炎癥發(fā)生的機(jī)制之一［23-24］。RA 病理發(fā)展特征為滑膜腫瘤樣擴(kuò)張，隨后鄰近關(guān)節(jié)軟骨和骨被破壞，主要原因?yàn)榛罨睦w維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞過度增殖、遷移和激活，侵襲鄰近軟骨和營養(yǎng)骨血管，因此抑制滑膜細(xì)胞增殖和遷移是治療RA 的理想靶點(diǎn)［25-27］。研究表明PPAR-γ可能參與滑膜細(xì)胞表達(dá)調(diào)控，RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞中，PPAR-γ 表達(dá)下調(diào)，且PPAR-γ 抑制劑增加滑膜細(xì)胞增殖和遷移，而PPAR-γ激動(dòng)劑表達(dá)抑制滑膜細(xì)胞增殖和遷移，為后續(xù)通過PPAR-γ 信號通路對RA 進(jìn)行治療提供了新思路［28-29］。GO 與KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)RA 發(fā)生與淋巴細(xì)胞、IL-17 信號通路、Toll樣受體信號通路激活促進(jìn)炎癥因子釋放及PPAR 信號通路調(diào)控纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞密切相關(guān)。

機(jī)器學(xué)習(xí)是一門多領(lǐng)域交叉學(xué)科，涉及概率論、統(tǒng)計(jì)學(xué)、逼近論、凸分析、算法復(fù)雜度理論等多學(xué)科，其常見算法包括決策樹算法、樸素貝葉斯算法、支持向量機(jī)算法、隨機(jī)森林算法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法等［30］。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)中強(qiáng)大的特征選擇算法（SVM-RFE 和LASSO 回歸法）分別處理芯片數(shù)據(jù)，利用SVM 在數(shù)據(jù)集訓(xùn)練得到的權(quán)重向量對特征進(jìn)行排序，剔除無用特征，用剩余特征再次訓(xùn)練模型進(jìn)行下一次迭代，選出需要的特征數(shù)，保留交叉驗(yàn)證后誤差最小的疾病特征基因，運(yùn)用LASSO回歸法將處理的差異表達(dá)基因進(jìn)行特征篩選，剔除無相關(guān)性或相關(guān)性不顯著的疾病特征基因，得到相關(guān)性顯著的疾病特征基因。將兩種算法得出的結(jié)果取交集，并對所得結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，繪制ROC 曲線，用檢測基因樣本對得到的結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，最終得到AUC>80%的5 個(gè)基因?yàn)榧膊√卣骰?，即SLAMF8、IGHM、CXCL10、AIM2、AKR1B10。

免疫細(xì)胞浸潤是炎癥反應(yīng)的前提，免疫細(xì)胞與RA 基因表達(dá)可能存在密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤情況可有效控制RA 發(fā)生。因此本研究通過CIBERSORT 算法分析免疫細(xì)胞在RA 滑膜中的表達(dá)，并通過將篩選的疾病特征基因表達(dá)與免疫浸潤表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA 滑膜中漿細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、記憶靜息T 細(xì)胞CD4、記憶激活T細(xì)胞CD4、T 細(xì)胞濾泡輔助器、激活的NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞9 種免疫細(xì)胞與正?；ご嬖诿黠@差異，這種差異與疾病特征基因顯著相關(guān)，發(fā)現(xiàn)CD8 T 細(xì)胞、漿細(xì)胞、濾泡輔助細(xì)胞、激活記憶T 細(xì)胞CD4 在SLAMF8、IGHM、AIM2、CXCL10 基因中表達(dá)較高，且該基因與這些免疫細(xì)胞顯著相關(guān)，活化的肥大細(xì)胞、記憶靜息CD4 T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞在AKR1B10基因中表達(dá)較高，且該基因與這些免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。此外SLAMF8 還有M1 巨噬細(xì)胞和B 記憶細(xì)胞，IGHM 基因還有M1 巨噬細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞和γδT 細(xì)胞，AIM2 還有M1 巨噬細(xì)胞與γδT 細(xì)胞，CXCL10 還有M1 巨噬細(xì)胞，不僅證實(shí)了5 個(gè)疾病特征基因?qū)A免疫應(yīng)答的重要性，也可以看出不同基因影響不同免疫細(xì)胞在體內(nèi)的表達(dá)，從而影響RA發(fā)生。

綜上，本研究通過生信分析與機(jī)器學(xué)習(xí)法得到了RA 的主要疾病特征基因及免疫浸潤情況，并闡明了不同特征基因與免疫細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性，說明可通過判斷患者特征基因表達(dá)預(yù)測RA 免疫細(xì)胞表達(dá)，對不同患者進(jìn)行針對性治療，提高疾病治愈率，提供臨床診療思路。