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    玫瑰茄水提物抗氧化及抑菌活性研究

    2023-12-28 10:11:58歐小勇潘文章楊通蓮歐工華
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年11期
    關(guān)鍵詞:芽孢清除率無(wú)菌

    歐小勇,潘文章,楊通蓮,歐工華

    (貴州省從江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州 從江 557400)

    2020 年,中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)文件指出,為維護(hù)我國(guó)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全,決定停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營(yíng)、使用部分藥物飼料添加劑。隨著該公告的頒布,多種促生長(zhǎng)的藥物添加劑及抗生素不得在飼料中使用。因此,尋找富含生物活性物質(zhì)、毒副作用小且殘留性低的植物提取物添加劑迫在眉睫[1-2]。玫瑰茄(Hibiscus sabdariffaL.)屬錦葵科木槿屬藥食同源類(lèi)植物,其花萼色彩鮮艷、色質(zhì)好,富含有機(jī)酸、花色苷、多酚、多糖及黃酮等活性成分,具有抗氧化、抗癌及降血糖等功效[3-5],廣泛用于食品、化妝品等領(lǐng)域[6]。除此之外,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn),玫瑰茄還具有防治心血管疾病和殺菌驅(qū)蟲(chóng)等功效[4-5]。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)玫瑰茄的研究集中在其醇提花色苷的抗氧化和抗腫瘤作用等方面。劉小琳等[5]發(fā)現(xiàn),玫瑰茄醇提花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力,清除羥自由基的IC50值為169.1 μg/mL,優(yōu)于VC 的448.5 μg/mL。Malacrida 等[7]和Lin 等[8]研究表明,玫瑰茄花色苷對(duì)乳腺癌和胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用。而關(guān)于玫瑰茄水提物的抗氧化及抑菌活性鮮有報(bào)到。基于此,筆者以玫瑰茄水提物為研究對(duì)象,探索玫瑰茄作為飼用抗氧化劑及抑菌防腐劑時(shí)的綜合利用效果。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試的玫瑰茄購(gòu)買(mǎi)于云南省武定縣,生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為Q/LAKX0009S,其他試劑還有1,1–二苯基–2–三硝基苯肼(DPPH,梯希愛(ài)上?;晒I(yè)發(fā)展有限公司),F(xiàn)RAP、ABTS 總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),抗壞血酸(VC,阿拉丁公司),鹽酸金霉素(中國(guó)食品藥品檢定研究院),胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。供試的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及腸炎沙門(mén)氏菌均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。主要儀器設(shè)備有全波段酶標(biāo)儀(帝肯InfiniteM 200PRO 型)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平UV 2400 型)。

    1.2 玫瑰茄水提物(HWE)的制備

    將玫瑰茄花萼置于粉碎機(jī)中粉碎,以料液比1 ∶25 的配比將玫瑰茄花萼粉末加入蒸餾水中進(jìn)行超聲提取,提取液真空抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黏稠狀,移入低溫真空冷凍干燥箱,干燥后碾壓成粉末狀,裝入密封袋于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

    參考楊麗華等[9]的方法,準(zhǔn)確配制1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 和0.1 mg/mL 的HWE 乙 醇 溶 液 及2.0×10-4mol/L 的DPPH 乙醇溶液。吸取DPPH 乙醇溶液3 mL,加入無(wú)水乙醇3 mL,標(biāo)記為A0;分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL,加入DPPH 溶液3 mL,標(biāo)記為A1;分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL,加入無(wú)水乙醇3 mL,標(biāo)記為A2;所有溶液避光反應(yīng)30 min,采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值,每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次取其平均值,以VC 為對(duì)照。用公式(1)計(jì)算HWE 的DPPH 自由基清除率(Y)。

    1.4 FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測(cè)定

    準(zhǔn)確配制1、2、4、6、8 和10 mg/mL 的HWE乙醇溶液。采用FRAP 及ABTS 總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定HWE 乙醇溶液的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力,具體操作參照說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)[10-12]的方法進(jìn)行。圖1 為FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系均表現(xiàn)良好。

    圖1 FRAP(左)及ABTS(右)總抗氧化能力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    1.5 抑菌活性測(cè)定

    1.5.1 LB 液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基的配制 參考羅飛亞[13]的方法配制LB 液體培養(yǎng)基和LB 固體培養(yǎng)基。LB 液體培養(yǎng)基中各成分比例為酵母粉(g)∶胰蛋白胨(g)∶氯化鈉(g)∶無(wú)菌水(mL)=1 ∶2 ∶2 ∶200,LB 固體培養(yǎng)基中各成分比例為酵母粉(g)∶胰蛋白胨(g)∶氯化鈉(g)∶瓊脂粉(g)∶無(wú)菌水(mL)=1 ∶2 ∶2 ∶3 ∶250,培養(yǎng)基配好后用封口膜密封,于立體式高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20 min,待冷卻到室溫后,放于4℃冰箱備用。

    1.5.2 菌種的復(fù)蘇與純化 參照菌種使用說(shuō)明書(shū)及何濤[14]的方法,在超凈工作臺(tái)里取出新購(gòu)菌種,分別接種到裝有適量LB 液體培養(yǎng)基的離心管中,置于臺(tái)式恒溫振蕩器中37℃培養(yǎng)12 h;然后在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)液接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化,一般至少傳3 代后再用接種環(huán)挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h 待用;純化后的菌液用之后60%甘油制成甘油菌,具體比例為0.8 mL 菌液+0.4 mL60%甘油,置于-80℃冰箱冷藏保存。

    1.5.3 紙片抑菌法活性評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[15-16]的方法,將HWE 用20%DMSO 水溶液溶解并過(guò)0.22 μm 濾膜,然后將HWE 濃度依次稀釋成200、100、50 和25 mg/mL,以相同溶劑配制10 mg/mL 的鹽酸金霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照,在配制好的藥液中加入無(wú)菌紙片(d=6 mm)浸泡12 h。吸取200 μL 菌懸液(濃度為1×105~2×105CFU/mL)于培養(yǎng)基的表面,用無(wú)菌涂布棒均勻涂布;將已浸泡過(guò)藥劑并瀝干的無(wú)菌濾紙片用無(wú)菌鑷子夾取貼在固體平板上,每個(gè)培養(yǎng)皿貼6 片,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中下培養(yǎng)24 h,采用十字交叉法[17]測(cè)定抑菌圈大小,取3 組平均值。

    1.5.4 MIC 與MBC 評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[18-19]中的二倍稀釋法,用20%DMSO 水溶液將HWE 配制成100 mg/mL 的藥液,過(guò)0.22 μm 濾膜,用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 mg/mL,將各濃度藥液取100 μL 依次加入96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板的前8 個(gè)孔中,然后每孔均加入100 μL 已經(jīng)稀釋好的菌液,第9 孔加100 μL 培養(yǎng)基和100 μL菌液,第10 孔加200 μL 培養(yǎng)基,設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將孔板混勻蓋好,放37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h 后觀察孔內(nèi)無(wú)彌散狀渾濁或孔底無(wú)沉淀的最低藥物濃度即為該測(cè)試菌株對(duì)HWE 的MIC。取無(wú)菌生長(zhǎng)孔的液體培養(yǎng)物100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)24 h,以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MBC。同時(shí)設(shè)立以母液為10 mg/mL 的鹽酸金霉素作為陽(yáng)性藥物代替HWE 按照上述步驟同步測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HWE 的抗氧化活性

    2.1.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 由圖2 可知,當(dāng)2 種溶液濃度為0.1~0.6 mg/mL 時(shí),VC 的DPPH自由基清除率大于HWE,當(dāng)樣品溶液濃度大于0.6 mg/mL 時(shí),HWE 的DPPH 自由基清除率明顯高于VC,當(dāng)HWE 的濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí),其DPPH清除率達(dá)到最高,為98%,而VC 在1 mg/mL 時(shí)DPPH 自由基清除率最高,為88.69%。

    圖2 HWE 及陽(yáng)性對(duì)照藥VC 的DPPH 自由基清除率

    2.1.2 ABTS 及FRAP 抗 氧 化 能 力 測(cè) 定 圖3 為HWE 和VC 分別采用ABTS 法和FRAP 法測(cè)定的總抗氧化能力結(jié)果。由ABTS 法結(jié)果可以看出,HWE和VC 的ABTS 總抗氧化能力值分別為5.44 和6.51 mmol/g,VC 的ABTS 值高于HWE;由FRAP 法結(jié)果可以看出,HWE 和VC 的FRAP 總抗氧化能力值分別為0.79 和1.47 mmol/g,VC 的FRAP 值高于HWE??傮w來(lái)看,VC 的總抗氧化能力強(qiáng)于HWE。

    圖3 HWE 和VC 的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力

    2.2 HWE 的抑菌活性

    2.2.1 紙片抑菌法活性測(cè)定 通過(guò)抑菌圈直徑的大小可將菌種對(duì)藥液的敏感程度分為高度敏感(>20 mm)、中度敏感(14~20 mm)、低度敏感 (8~14 mm)和不敏感(<8 mm)[20]。由表1 可知,當(dāng)HWE 濃度為25 mg/mL 時(shí),對(duì)4 種菌均表現(xiàn)為不敏感;當(dāng)HWE的濃度為50 mg/mL 時(shí),對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出低敏感;當(dāng)HWE 的濃度為100 mg/mL時(shí),對(duì)4 種菌均表現(xiàn)出低敏感;當(dāng)HWE 濃度為200 mg/mL 時(shí),對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色芽孢桿菌表現(xiàn)出中度敏感??傮w來(lái)看,HWE 對(duì)4 種菌的敏感程度排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>腸炎沙氏桿菌>大腸桿菌,較高濃度的HWE 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果,但效果均差于鹽酸金霉素。

    表1 HWE 對(duì)4 種試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑

    2.2.2 MIC 與MBC 活性測(cè)定 通過(guò)二倍稀釋法可以得出HWE 對(duì)枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 分別為12.5、6.25、3.12、12.5 mg/mL,MBC 值 分 別 為25、25、12.5、25 mg/mL。同時(shí)可以得出,鹽酸金霉素對(duì)枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 值均小于0.01 mg/mL,MBC 的值分別為0.04、0.04、0.04、0.02 mg/mL。

    3 結(jié)論與討論

    玫瑰茄水提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,其抗氧化能力與VC 相當(dāng),對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌活性,雖然抑菌效果不及鹽酸金霉素,但其來(lái)源于天然植物,原材料豐富,且具有廉價(jià)、綠色、健康等優(yōu)勢(shì),可將其作為飼用抗氧化劑或抑菌防霉劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

    試驗(yàn)所采用的DPPH 法與黃瓊等[21]的研究一致,且結(jié)果也相似,即陽(yáng)性對(duì)照VC 的DPPH 自由基清除率均低于90%,且隨濃度的增加清除率無(wú)明顯增加;而HWE 對(duì)DPPH 的自由基清除率當(dāng)其濃度為0.8 mg/mL 時(shí)達(dá)到最高值98%。試驗(yàn)采用的FRAP 法和ABTS 法與王智勇等[22]和Zhang 等[11]的方法基本一致,其中2 種方法測(cè)定HWE 均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,這也與前人的研究基本一致。例如鄭大恒等[23]發(fā)現(xiàn)玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH、羥基、超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除作用,劉雨瀟等[24]發(fā)現(xiàn)玫瑰茄多酚含量與抗氧化能力呈量效關(guān)系。抑菌試驗(yàn)中所采用的微量稀釋法與裴滬榮等[25]和邱亞鐵等[26]的研究一致,樣品均采用DMSO 助溶,其結(jié)果顯示,HWE 在抑制微生物生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出一定活性,抑菌能力與濃度呈較明顯的量效關(guān)系,其中HWE 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最優(yōu),當(dāng)其濃度為200 mg/mL 時(shí),抑菌圈直徑達(dá)18.83±0.58 mm;而在MIC 及MBC 指標(biāo)測(cè)定中,HWE 對(duì)大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)最好,其MIC 和MBC 值分別為3.12和12.5 mg/mL。李夢(mèng)淼等[27]測(cè)定了玫瑰茄醇提物的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出較好的抑菌效果,并通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定出其主要抑菌活性物質(zhì)為黃酮類(lèi)化合物。Borrás–linares 等[28]的研究結(jié)果表明,玫瑰茄提取物對(duì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑制作用更為顯著。

    隨著“全面替抗”時(shí)代的到來(lái),尋找天然無(wú)公害替代抗生素的添加物成為必然趨勢(shì),植物提取物型飼料添加劑是極佳的選擇,也是今后飼料添加劑的主導(dǎo)方向。Saxena 等[29]證明了玫瑰茄提取物對(duì)不同階段絲蟲(chóng)(幼蟲(chóng)、成蟲(chóng))均具有殺滅作用,在250 mg/L 濃度下能體外殺死微絲幼,并認(rèn)為將玫瑰茄開(kāi)發(fā)成治療絲蟲(chóng)病的有效藥物具有良好的前景。玫瑰茄也被證明具有開(kāi)發(fā)成天然抑菌劑的應(yīng)用前景[27-30]。該研究結(jié)果表明,玫瑰茄具備開(kāi)發(fā)成抗氧化劑和抑菌劑的潛力,可作為抗氧化劑及抑菌防霉劑添加到飼料中,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用木槿屬植物提供了新思路。左苗[31]在飼料中添加一定量的玫瑰茄提取物,發(fā)現(xiàn)肉雞及鯰魚(yú)的生長(zhǎng)性能均能得到一定的改善,這表明玫瑰茄在飼料添加劑上的開(kāi)發(fā)與利用具有一定的可行性。

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