不同生物填料構(gòu)建零換水凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)研究

袁光年,徐愛玲,劉勇新,丁 寧,周 濤,宋志文

(青島理工大學 環(huán)境與市政工程學院,青島 266525)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦,是世界三大高產(chǎn)量對蝦養(yǎng)殖品種之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷的擴大,傳統(tǒng)換水養(yǎng)殖模式使水域環(huán)境污染問題日益嚴重,水質(zhì)惡化會誘發(fā)蝦病暴發(fā),并阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展,眾多學者對零換水技術(shù)(Zero Water Discharge,ZWD)進行了研究,目前國內(nèi)主要研究的零換水養(yǎng)殖系統(tǒng)有工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)和生物絮團系統(tǒng)[1-2]。工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中對蝦產(chǎn)量高,水環(huán)境可控,但是設(shè)備投資成本高,運行費用昂貴;而原位處理的生物絮團系統(tǒng)可調(diào)控水質(zhì)、減少換水、減少疾病爆發(fā)、提高飼料利用率,但是操作難度大,且無法較好地控制亞硝氮的增長,此外投加大量碳源會增加額外養(yǎng)殖成本。

相比生物絮團系統(tǒng),人工基質(zhì)-生物膜是一種低碳、清潔的養(yǎng)殖水體原位修復技術(shù),具有提高凡納濱對蝦存活率、增強免疫力和凈化水質(zhì)等優(yōu)點[3]。聚氨酯海綿具有孔隙率高、比表面積大和吸附力強等特點,在工業(yè)廢水中氨氮和亞硝酸鹽氮去除率為90.1%和89.3%[4-5]。絲瓜絡(luò)具有天然纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可為微生物提供更多的附著點,研究表明絲瓜絡(luò)掛膜填料對生活污水氨氮和總氮的去除率可達到90%和78%[6-7]。聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯環(huán)都具有較好的機械強度以及抗沖刷能力等優(yōu)點[8-9],王光玉等[10]研究了不同大小PVA球?qū)Π钡娜コ?結(jié)果表明PVA小球和PVA大球在18和22 min時對氨氮去除速率為58和48 g/ (m3·d);章霞等[11]研究了聚乙烯環(huán)掛膜填料對氨氮去除效果,研究表明聚乙烯環(huán)填料42 h氨氮去除率為90.8%。適宜的人工基質(zhì)對發(fā)揮穩(wěn)定、持續(xù)的水體凈化作用有積極影響,研究不同填料生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)組成、功能具有重要意義。

本實驗以預(yù)掛膜聚氨酯海綿、聚乙烯環(huán)、PVA球和絲瓜絡(luò)作為生物膜基質(zhì),將其內(nèi)置凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng),比較分析不同養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)變化、對蝦生長狀況與生物膜細菌群落結(jié)構(gòu)組成,以期為人工基質(zhì)-生物膜養(yǎng)殖系統(tǒng)生物載體的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物填料生物膜培養(yǎng)方法

1.2 實驗裝置和養(yǎng)殖管理辦法

8個養(yǎng)殖池(有效容積100 L/個)分為4個實驗組,按2%體積比將各填料放入養(yǎng)殖池中。實驗海水由人工海水素配制而成,鹽度15‰。凡納濱對蝦P5蝦苗購于廣東湛江某蝦苗廠,每個養(yǎng)殖池放入64尾(相當于養(yǎng)殖密度:800 ind/m3)。飼料購自澳華飼料有限公司,每日投喂量按照對蝦體重4%～10%,每日分3次投喂,時間分別為9:00,14:00,20:00。實驗后期采用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體pH。整個養(yǎng)殖期間不換水,定期補充蒸發(fā)水量和排污,排污周期為1周進行1次,每次排污損失水量低于總體水量的5%。每周對KA和JA填料進行清洗,整個實驗持續(xù)76 d。

表1 4種填料物理性質(zhì)與生物膜硝化性能

1.3 高通量測序方法

實驗第50天各實驗組水質(zhì)指標基本穩(wěn)定,從養(yǎng)殖系統(tǒng)取填料樣品,按照土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)操作步驟對樣品DNA進行提取,采用P360超微分光光度計(IMPLEN公司,德國)檢測總DNA濃度與純度,將符合擴增要求DNA樣品送至上海美吉生物有限公司進行16S rRNA基因高通量測序。通過拼接、指控、去接頭等獲得優(yōu)化序列,將優(yōu)化序列以97%相似度進行OTU聚類,通過生信云平臺進行Shannon,Simpson,Ace和Chao指數(shù)分析,采用RDP classlfler貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析。

1.4 水質(zhì)分析方法

1.5 凡納濱對蝦生長狀況

實驗結(jié)束后記錄凡納濱對蝦體重、存活率、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)。計算公式如下:

FCR=F/(W1-W0)

Sr=(N1/N0)×100

SGR=[(lnW1-lnW0)/t1]×100

式中:FCR為飼料系數(shù)(FCR);Sr為存活率,%;SGR為特定生長率(SGR),%;N1,N0分別為終末存活數(shù)和初始投放數(shù);t1為養(yǎng)殖76 d;F為總投喂量,g;W1,W0分別為終末平均體重和初始平均體重,g。

1.6 數(shù)據(jù)分析和處理

采用Excel和Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)用平均值及標準差(means±SD)表示。使用ANOVA方差分析,P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)情況

養(yǎng)殖過程中凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)指標情況見表2。由表2可知,不同實驗組溫度、鹽度、pH和溶解氧無顯著差異,均滿足凡納濱對蝦生長要求;SA實驗組濁度最高,其次為PA,與KA和JA實驗組存在顯著差異。

表2 水質(zhì)參數(shù)

2.2 養(yǎng)殖過程中TAN濃度變化情況

各實驗組中TAN濃度變化情況如圖1所示。由圖1可以看出,養(yǎng)殖過程中,在5～76 d各實驗組TAN濃度均表現(xiàn)出先緩慢升高最后降低的趨勢。實驗組JA和KA在0～10 d出現(xiàn)濃度峰值,分別為(1.66±0.61)和(2.18±0.94) mg/L,之后迅速下降。各實驗組在60～76 d內(nèi)出現(xiàn)TAN濃度峰值,各實驗組JA,KA,SA和PA的峰值分別為(3.64±0.77),(3.72±0.03),(6.89±0.52)和(2.75±0.42) mg/L。

2.3 養(yǎng)殖過程中濃度變化情況

2.4 養(yǎng)殖過程中濃度變化情況

2.5 凡納濱對蝦生長狀況

實驗過程中凡納濱對蝦生長情況見表3。各實驗組對蝦均重和存活率分別為8.19～8.49 g和61.7%～68.8%,JA組和SA組對蝦均重顯著高于KA組和PA組(P<0.05),KA組SGR和FCR上與其他實驗組有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 生物膜細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

2.6.1 細菌Alpha多樣性分析

各實驗組生物膜細菌Alpha多樣性分析結(jié)果見表4。由表4可知,各實驗組有效OTUs為490～564,測序覆蓋率在99.7%～99.8%,測序覆蓋率說明測序結(jié)果能較好地展現(xiàn)各填料生物膜微生物群落組成:JA組具有最高的微生物豐富度和群落多樣性;KA組的多樣性指數(shù)最低;SA組的豐富度指數(shù)最低。

表3 凡納濱對蝦生長狀況

表4 填料表面細菌群落Alpha多樣性指數(shù)

2.6.2 細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

各樣品中相對豐度大于0.01%的菌門有16個(圖4(a)),優(yōu)勢菌門主要包括變形菌門(Proteobacteria,35.45%～56.54%)、浮霉菌門(Planctomycetota,5.12%～38.14%)、擬桿菌門(Bacteroidota,8.24%～15.29%)和綠彎菌門(Chloroflexi,2.87%～15.57%),其中JA,SA和PA組中變形菌門為第一優(yōu)勢菌門,相對豐度分別為44.99%,46.47%和56.54%;JA和PA組中擬桿菌門為第二優(yōu)勢菌門,相對豐度分別為15.29%,12.29%,SA組中綠彎菌門(15.37%)為第二優(yōu)勢菌門,KA組中浮霉菌門的相對豐度超過變形菌門,分別為38.14%和35.45%。

總共檢測出菌屬353個,對相對豐度大于1%的屬水平進行分析(圖4(b))。JA組中的優(yōu)勢菌屬有norank_c_OM190(9.33%),norank_f__A4b(5.18%)和Simiduia屬(3.96%);KA生物膜中的優(yōu)勢菌屬有unclassified_p__Planctomycetota(21.61%),norank_f__A4b(13.77%)和norank_c_OM190(9.33%);SA組中優(yōu)勢菌屬有norank_f__A4b(15.80%)、噬甲基菌屬(Methylophaga,7.24%)和norank_f__Balneolaceae(5.79%);PA組中優(yōu)勢菌屬有魯杰氏菌屬(Ruegeria,16.98%)、Simiduia屬(6.31%)和SM1A02(5.27%)。

養(yǎng)殖階段具有硝化和反硝化功能的細菌屬分布結(jié)果見表5。由表5可知,硝化細菌包括氨氧化細菌、氨氧化古菌和亞硝酸氧化細菌。與氨氧化功能相關(guān)的有亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和unclassified_Nitrosomonadaceae,與亞硝酸氧化功能相關(guān)的有硝化螺旋菌屬(Nitrospira)。JA,KA,SA和PA氨氧化細菌相對豐度分別為1.98%,2.34%,0.40%和1.30%。亞硝酸氧化細菌相對豐度遠低于氨氧化細菌。與反硝化相關(guān)的有假單胞菌屬(Pseudomona)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)和魯杰氏菌屬(Ruegeria)。假單胞菌屬、生絲微菌屬和魯杰氏菌屬為JA的優(yōu)勢屬,生絲微菌屬和魯杰氏菌屬為KA的優(yōu)勢屬,固氮弧菌屬和魯杰氏菌屬分別為SA和PA的優(yōu)勢屬。

圖4 細菌群落結(jié)構(gòu)組成

表5 填料表面硝化細菌和反硝化細菌菌屬豐度水平

3 討論

3.1 不同掛膜填料對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

不同掛膜填料對水質(zhì)調(diào)控效果有所不同。懸浮顆粒物增加會影響凡納濱對蝦的進食功能,導致蝦的死亡。本實驗中聚氨酯海綿填料的濁度均值最低,說明其吸附性最強,而絲瓜絡(luò)填料濁度均值最高,原因是絲瓜絡(luò)填料主要由半纖維素、α-纖維素、木質(zhì)素組成,組成成分容易被細菌分解[12],部分分解殘渣使水體中懸浮顆粒物進一步增多,而絲瓜絡(luò)填料分解未對對蝦存活率造成影響,推測原因可能是絲瓜絡(luò)填料懸浮顆粒物濃度未超過凡納濱對蝦養(yǎng)殖的安全值[13]。

3.2 不同掛膜填料對凡納濱對蝦生長狀況的影響

LEZAMA-CERVANTES等[21]研究了聚氨酯生物墊對凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)的影響,研究結(jié)果表明聚氨酯海綿墊對懸浮顆粒物和微生物的吸附作用,為對蝦提供了額外的食物來源。WILéN等[22]認為碳源的增加使異養(yǎng)菌具有更高的菌體蛋白含量。本實驗中聚氨酯海綿和絲瓜絡(luò)實驗組對蝦均重明顯高于聚乙烯環(huán)和PVA球?qū)嶒灲M,由此說明聚氨酯海綿填料能夠吸附、降解和利用的有機物和無機物更多,聚氨酯海綿填料生物膜的生物量也就更大。而絲瓜絡(luò)填料因為釋放更多的有機碳源,導致異養(yǎng)菌數(shù)量增加,同時懸浮顆粒物增多,因此生物量也隨之增大,凡納濱對蝦通過對生物膜或者懸浮物進行濾食后自身重量有所提高。

3.3 不同掛膜填料對生物膜細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

填料表面微生物豐富度和群落多樣性越高說明群落穩(wěn)定性越強。聚氨酯海綿和PVA球填料生物膜Ace,Chao和Shannon指數(shù)高于聚乙烯環(huán)和絲瓜絡(luò)填料。細菌群落豐富度和多樣性指數(shù)越高,水質(zhì)凈化功能也更好,與裘錢玲琳等[23]研究結(jié)果相印證。聚氨酯海綿具有較好的生物再生性,在好氧環(huán)境中生物膜更容易生長,聚氨酯的多孔結(jié)構(gòu)決定該填料細菌群落結(jié)構(gòu)具有更高的多樣性[24]。

變形菌門是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常見的優(yōu)勢菌門,變形菌門廣泛分布于海洋環(huán)境中,并且能夠參與高分子有機物的分解,有研究認為健康的對蝦生長環(huán)境中變形菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門[25-27],與本實驗中PVA球和聚氨酯海綿填料的研究結(jié)果相符。擬桿菌門可對纖維素進行降解[28],該門類菌群可對硝酸鹽進行同化作用[29];有研究表明浮霉菌門在對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中為第二優(yōu)勢菌門[30]。魏亞茹等[31]研究認為浮霉菌門的厭氧氨氧化菌群為生態(tài)友好型脫氮微生物。有研究表明在對蝦發(fā)病前綠彎菌門相對豐度有所升高[32]。在屬水平上,norank_f__A4b來自綠彎菌門中的厭氧繩菌綱,該菌綱為一類絲狀菌綱[33]。norank_c_OM190來自浮霉菌門,研究認為norank_c_OM190對氨氮和硝態(tài)氮可能具有自養(yǎng)氨氧化和反硝化作用[28];研究表明Simiduia屬對弧菌具有抑制作用[34],而實驗中所測各實驗組中的弧菌群落相對豐度很低(<0.05%)。

4 結(jié)論

高通量測序結(jié)果表明,聚氨酯海綿、PVA球和絲瓜絡(luò)實驗組中變形菌門為第一優(yōu)勢菌門,聚氨酯海綿、PVA球中擬桿菌門為第二優(yōu)勢菌門,絲瓜絡(luò)實驗組中綠彎菌門為第二優(yōu)勢菌門;聚乙烯環(huán)實驗組中浮霉菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門。PVA球和聚氨酯海綿實驗組生物膜的細菌豐富度和多樣性指數(shù)均高于絲瓜絡(luò)和聚乙烯環(huán)實驗組,與水質(zhì)凈化效果相對應(yīng)。實驗組中亞硝酸氧化細菌相對豐度遠低于氨氧化細菌,硝化作用優(yōu)勢菌屬均為亞硝化單胞菌屬。