分子對(duì)接闡明草甘膦與水稻醛酮還原酶（OsALR2）的作用及QsALR2的表達(dá)純化

孫躍 劉蓉 王思威 徐漢虹 吳鷹花

關(guān)鍵詞：水稻；草甘膦；分子對(duì)接；原核表達(dá)；包涵體變復(fù)性；酶活測(cè)定

草甘膦（glyphosate）是一種重要的除草劑，具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性強(qiáng)，廣譜，藥效好，靶向性高，環(huán)境兼容性高等優(yōu)點(diǎn)。草甘膦以植物葉綠體中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvate shikimate-3phosphate synthase，EPSPS）為靶標(biāo)。EPSPS是莽草酸代謝途徑的第6個(gè)酶，負(fù)責(zé)催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸莽草酸（S3P）生成5一烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP），這個(gè)步驟是進(jìn)一步合成芳香族氨基酸、激素和次生代謝物的關(guān)鍵。草甘膦以競(jìng)爭(zhēng)PEP和非競(jìng)爭(zhēng)S3P的方式與植物體內(nèi)EPSPS結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合物，從而導(dǎo)致EPSPS活性喪失，進(jìn)而使莽草酸在組織中大量積累。同時(shí)，蛋白質(zhì)生物合成所需的芳香族氨基酸的合成嚴(yán)重受阻，最終導(dǎo)致植物死亡。此外，植物葉綠體的亞微結(jié)構(gòu)、核糖體、RNA和色素的形成都受到草甘膦的影響。

醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）是一類結(jié)構(gòu)和功能相似的依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化還原酶蛋白超家族，廣泛分布于原核生物、酵母、植物、動(dòng)物和人類等所有生物中。研究發(fā)現(xiàn)，AKR可以催化多種羰基化合物，包括葡萄糖、小型羰基代謝物、谷胱甘肽結(jié)合物、脂質(zhì)過(guò)氧化物等的氧化還原反應(yīng)。AKR以NADPH作為輔酶，將醛和酮類物質(zhì)還原成初級(jí)和次級(jí)的醇。除了這些主要功能外，研究發(fā)現(xiàn)AKR在植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)后能緩解草甘膦的毒性，暗示植物體內(nèi)的AKR可能具有降解草甘膦的作用。Pan等在澳大利亞的野生稗草Echinochloa Crus-galliP．Beauv.中過(guò)表達(dá)AKR基因使稗草獲得了草甘膦抗性。目前草甘膦在水稻中的作用機(jī)理尚不清楚，這使得草甘膦在水稻田的推廣使用受到了嚴(yán)重限制。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)水稻體內(nèi)OsALR2蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜特性，二硫鍵含量等生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。再通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件模擬了水稻OsALR2蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)Auto Dock Vina展示草甘膦與OsALR2分子對(duì)接的結(jié)果。最后，在原核系統(tǒng)中表達(dá)和純化OsALR2。本研究為OsALR2與草甘膦的共結(jié)晶奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為抗草甘膦水稻的商業(yè)化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大腸桿菌trans-T1感受態(tài)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌C43（DE3）感受態(tài)購(gòu)自安徽吐露港生物科技有限公司。pET-32a質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保藏。氯化鈉、酵母提取物、蛋白胨、咪唑、丙三醇、Tris、SDS和IPTG等試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗生素Ampicillin （Amp）購(gòu)自Sigma; His（融合HRP）抗體購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶Not、Xho和KOD高保真酶購(gòu)自NEB。LxnaseⅡ重組酶購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司。DNA marker、Protein marker購(gòu)自大連寶生物，膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自北京全式金公司。引物合成和常規(guī)測(cè)序分析由華大基因完成。質(zhì)譜分析服務(wù)由北京生物物理所質(zhì)譜平臺(tái)提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1OsALR2蛋白生物信息學(xué)分析

利用TMHMM 2.0（https：∥servlces. health-tech. dtu. dk/service.php？ TMHMM-2.0）分析OsALR2蛋白的跨膜次數(shù)；利用DiANNA1.1webserver （http：∥clavius. bc. edu/Nclotelab/DiAN-NA/）分析OsALR2蛋白的二硫鍵數(shù)目；利用A1-phaFold（https：∥www. alphafold. ebi. ac. uk/search/text/OsOlg0847600）和UniProt（https：∥www. uniprot. org/）預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.20sALR2蛋白與小分子草甘膦的分子對(duì)接及對(duì)接結(jié)果分析

檢索PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥pubchem. nc-bi. nlm．nih. gov/）獲得草甘膦的分子結(jié)構(gòu)式。在Auto Dock中對(duì)小分子進(jìn)行加氫和加電荷處理，再定義tortion確定小分子哪些鍵可旋轉(zhuǎn)。通過(guò)Al-phaFold和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載OsALR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，用PyMOL刪去其多余水分子，然后用在線網(wǎng)站Prepare PDB file for dockingprograms （https：∥swift. cmbi. umcn. nl/servers/html/prepdock. html）對(duì)蛋白進(jìn)行修復(fù)。將OS-ALR2蛋白和草甘膦在Auto Dock中打開，通過(guò)查詢文獻(xiàn)確定蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)，輸入坐標(biāo)生成對(duì)接盒子，進(jìn)行對(duì)接。選取對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能較低且構(gòu)象較好的，對(duì)蛋白和小分子相互作用位點(diǎn)的氨基酸和作用力進(jìn)行可視化展示。將ADT生成的分子對(duì)接結(jié)果分別上傳到PDBsum Generate（http：∥WWW.ebi. ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）和https：∥saves．mbi．ucla．edu/在線網(wǎng)站中，評(píng)價(jià)對(duì)接獲得的三維結(jié)構(gòu)的可靠性。

1.2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取水稻‘中花11'總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，以5，-ATGGCGAGTGC_CAAGGCGAT-3為正向引物，5，-TTAGAC-CTCGTTATCCCAGACC-3為反向引物，擴(kuò)增出水稻編碼AKR的基因Os-ALR9，并將其克隆至T載體。利用同源重組的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體：以含有水稻OsA/R2的T載體為模板，用KOD高保真酶擴(kuò)增水稻OsALR2?；厥誔CR產(chǎn)物并測(cè)定濃度，分別用內(nèi)切酶Not工和Xho工對(duì)OsALR7基因和pET32a質(zhì)粒在37℃下雙酶切3h，利用ExnaseⅡ重組酶將酶切后的OsALR9和pET-32a產(chǎn)物按照2：1的摩爾比在37℃連接30min。取5uL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans-T1進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取陽(yáng)性克隆送華大基因進(jìn)行序列測(cè)定，選取序列完全正確的克隆，提取質(zhì)粒，即為原核表達(dá)載體pET32a-His-OsALR2，-20℃保存。

1.2.40sALR2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET32a-His-OsALR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株C43 （DE3）。先進(jìn)行小量誘導(dǎo)：挑取4個(gè)單克隆分別接種于3mL LB培養(yǎng)液中，37℃、200r/min培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8，在4管菌液中分別加人終濃度為0、0. 25、0.5、1mmol/L的IPTG。在16℃、120r/min條件下誘導(dǎo)12h。取2ml。菌液25℃、2500r/min離心10min，棄上清，加入40uL的2×SDSloading buffer，煮沸5～10min，13000 r/rmn離心5min，取20ul-上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色和Western blot檢測(cè)蛋白是否表達(dá)，并確定最適IPTG濃度。大量誘導(dǎo)表達(dá)：將小量誘導(dǎo)已確認(rèn)表達(dá)的新鮮菌液按1：500的體積比加入到2L的LB液體培養(yǎng)基中，加入抗生素Amp至終濃度50ug/mL37℃、200r/min培養(yǎng)至菌液OD600為1．0～1.2，加入終濃度為0.25mmol/L的IPTG，16℃、120r/min誘導(dǎo)12h，25℃、2500r/min離心10min，收集菌體。

1.2.5OsALR2蛋白的純化

His標(biāo)簽的OsALR2蛋白純化：將4L誘導(dǎo)表達(dá)的菌體（10g左右）重懸于100mL裂解液（25mmol/L pH 8.0Tris， 300mmol/L NaCI， 5%甘油）中高壓（1500psi）破碎2次。細(xì)胞破碎液18000r/min離心30min，取上清液在Ni-NTA重力層析柱中進(jìn)行親和層析。使用5個(gè)柱體積的洗滌緩沖液（25mmol/L pH 8.0Tris，300mmol/LNaCI，40mmol/l。咪唑）洗滌Ni-NTA中的雜蛋白，用洗脫緩沖液（2 mmol/l。pH 8．0Tris，300mmol/l。NaCI，300mmol/L咪唑）洗脫并收集目的蛋白。

采用UNICORN 6.3控制的AKTA avant色譜系統(tǒng)，通過(guò)陰離子交換柱（HiTrap，HP5 mL，Cyti-va）和分子篩進(jìn)一步純化OsALR2蛋白。AKTAavant純化步驟均在16℃下進(jìn)行。用2個(gè)柱體積的經(jīng)0. 22um濾膜過(guò)濾的超純水清洗陰離子交換柱，再用5個(gè)柱體積的平衡緩沖液（20mmol/LpH 8．0Tris-HC1，0.1 mol/L NaC1）平衡陰離子交換柱。用注射器將蛋白質(zhì)混合物加載到預(yù)平衡的陰離子交換柱上。用5個(gè)柱體積的洗滌緩沖液（20mmol/L pH8．0Tris-HC1，0.1mol/l NaCI）洗滌陰離子交換柱。在AKTA上設(shè)置洗脫程序：洗脫時(shí)將低鹽緩沖液（20mmol/LpH 8.0Tris-HC1，0.1mol/IJ NaCI）和高鹽緩沖液（20mmol/L pH 8．0Tris-HC1，1mol/LNaCI）由AKTA混合配置洗脫緩沖液，洗脫時(shí)NaCI的濃度線性上升，高鹽緩沖液占比從10%線性上升到70%。再用5個(gè)柱體積的過(guò)濾超純水和5個(gè)柱體積的20%乙醇分別清洗陰離子交換柱。收集紫外信號(hào)UV280出峰位置所對(duì)應(yīng)的蛋白，即為目標(biāo)蛋白。

分子篩純化使用凝膠層析柱superdex 10/300lncrease （24.7mL） （Cytiva）。先用2個(gè)柱體積的過(guò)濾超純水清洗凝膠層析柱，再用2個(gè)柱體積的平衡緩沖液（20mmol/L pH 8．0Tris-HC1，0.1mol/LNaC1）平衡凝膠層析柱。平衡后，通過(guò)注射器將600uL經(jīng)陰離子交換柱洗脫的OsALR2蛋白注入到500uL的上樣環(huán)中。再用平衡緩沖液洗脫目的蛋白，收集紫外信號(hào)UV280出峰位置所對(duì)應(yīng)的蛋白。

1.2.6包涵體蛋白的變復(fù)性

按照1.2.4的方法表達(dá)蛋白質(zhì)。收集菌體，高壓破碎（1500psi）裂解菌液2次后將細(xì)胞破碎液18000r/min離心30min，收集沉淀，得到粗制包涵體。使用含有低濃度變性劑的洗滌液[2mol/L尿素，50mmol/IJ，pH8.0Tris， 50 mmol/IJ NaCI，1mmol/L EDTA，0.5% （V/V） Triton X-IOO]重懸包涵體，12000r/min離心10min，重復(fù)此清洗步驟3次，去除雜蛋白獲得精制包涵體。使用含有高濃度變性劑的變性液（6 mol/L尿素，20 mmol/L pH8.0Tris， 500 mmol/lJ， NaC1，5mmol/l。咪唑，1mmol/L）對(duì)精制包涵體進(jìn)行溶解變性：用變性液將包涵體重懸混勻，室溫振蕩溶解2h。將溶解變性后的包涵體蛋白溶液加載到預(yù)先用變性液平衡的Ni-NTA重力層析柱中，再用復(fù)性液（20 mmol/LpH 8.0 Tris， 500 mmol/L，NaCI，5 mmol/l．咪唑，1mmol/L）洗滌層析柱，使包涵體蛋白逐漸復(fù)性。最后用洗脫液（20mmol/L pH 8．0Tris，500mmol/L NaCI， 500mmol/L咪唑，1mmol/L）洗脫復(fù)性后的蛋白，并用Nanodrop測(cè)定蛋白濃度。

1.2.7蛋白活性測(cè)定

OsALR2蛋白以NADPH為輔酶，將醛和酮類物質(zhì)還原成初級(jí)和次級(jí)醇。通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)產(chǎn)物吸光度的變化即可分析OsALR2蛋白是否具有酶活性。如果OsALR2蛋白具有酶活性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)吸光度會(huì)不斷升高，直至反應(yīng)完全，吸光度不再變化。如果將OsALR2蛋白加入反應(yīng)體系后，吸光度無(wú)變化，說(shuō)明OsALR2蛋白無(wú)酶活性。OsALR2蛋白酶活性測(cè)定反應(yīng)體系：1mL的反應(yīng)液[50mmol/L，pH 7.4的K3PO40.1 mmol/L，NADPH，10mmol/L，苯甲醛（濃度分別設(shè)置為2.5、5．0、7.5、10、15、20mmol/L）]和100ug的OsALR2蛋白。測(cè)定OsALR2以草甘膦為底物的作用活性時(shí)，作為初始值，加入OsALR2后每隔30 s測(cè)定并記錄OD340，共測(cè)定3min。所有測(cè)量重復(fù)3次，陰性對(duì)照中用緩沖液75 mmol/L Tris-HCl（pH 8.6）取代OsALR2蛋白。

2結(jié)果與分析

2.10sALR2蛋白的理化性質(zhì)分析

水稻OsALR2蛋白由311個(gè)氨基酸組成。OsALR2分子量為35kD，理論等電點(diǎn)為5.89。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OsALR2蛋白不具有跨膜螺旋區(qū)，不是膜蛋白。DiANNA 1.1 web server分析表明，OsALR2蛋白含有3組二硫鍵，說(shuō)明該蛋白較易形成包涵體。

2.20sALR2蛋白與草甘膦的分子對(duì)接

通過(guò)AlphaFold預(yù)測(cè)得到的水稻OsALR2蛋白的三維結(jié)構(gòu)見圖1a。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得與水稻OsALR2蛋白氨基酸序列一致性最高的蛋白AKR4C9，其PDB ID為6kb1。通過(guò)查詢文獻(xiàn)，確定6kbl的小分子配體結(jié)合位點(diǎn)的坐標(biāo)為：AKR4C9（center_x=18.8，center y=13.6，center-Z=34.2），參照該坐標(biāo)設(shè)置OsALR2的對(duì)接盒子的位置。對(duì)接結(jié)果顯示草甘膦配體與AKR蛋白受體對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能最低的為-13.4 kcal/mol。草甘膦與OsALR2主要通過(guò)氫鍵作用連接：草甘膦磷酸基團(tuán)的2個(gè)羥基分別與Lys253的氨基相互作用，草甘膦磷酸基團(tuán)的羰基和草甘膦中間的氨基分別與Ser208的氨基和羥基相互作用，草甘膦另一側(cè)的羰基分別與Ser204的氨基和羥基相互作用（圖lc）。蛋白與小分子2D相互作用結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了小分子與蛋白發(fā)生相互作用的氨基酸位點(diǎn)（圖1b）。OsALR2與草甘膦對(duì)接結(jié)果的可靠性用Ramachandran圖評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示93.3%的氨基酸落在允許區(qū)域，大于90%，衡量對(duì)接復(fù)合體中各二面角和主鏈共價(jià)鍵作用力等參數(shù)的合理性的GFactors各指數(shù)均大于-0.5（圖1d），表明對(duì)接結(jié)果是合理的。ERRAT評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果表明，ERRAT中overall quality factor值為97.03%，大于95%，即對(duì)接獲得的結(jié)構(gòu)是高分辨率的（圖le）。用Veri-fy 3D分析對(duì)接結(jié)果，其中94.53%的殘基對(duì)應(yīng)的3D/ID的平均得分大于等于0.2，殘基比例大于等于80%（圖1f）。綜上表明分子對(duì)接獲得的三維結(jié)構(gòu)是合理的。

2.30sALR2蛋白表達(dá)與純化

將pET32a-His-OsALR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株C43 （DE3）中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)小量誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白樣品分別進(jìn)行Western blot和SDS-PAGE分析檢測(cè)。結(jié)果顯示：不加IPTG時(shí)蛋白表達(dá)量極低；在IPTG終濃度分別為0.25、0.5mmol/L和1．0mmol/L時(shí)，OsALR2都有表達(dá)。后續(xù)大量誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)使用IPTG的終濃度為0.25mmol/l（圖2a，b）。使用Ni-NTA親和層析柱初步純化His-osALR2蛋白，純化過(guò)程的各步驟分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，細(xì)菌裂解液離心后的上清中His-Os-ALR2蛋白較少，且含有較多雜質(zhì)；而離心后的沉淀中含有較多的OsALR2蛋白（圖2c），說(shuō)明osALR2蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。為了降低上清中可溶性O(shè)sALR2蛋白的雜質(zhì)含量，先后使用陰離子交換柱和凝膠過(guò)濾層析柱純化OsALR2蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示OsALR2蛋白經(jīng)過(guò)陰離子交換柱和分子篩純化后雜質(zhì)含量有所降低（圖2d），但是其純度仍然不足90%，不能滿足后續(xù)結(jié)晶試驗(yàn)的要求。

2.4包涵體蛋白的變性，復(fù)性及純化

由于破菌離心后的上清中OsALR2蛋白雜質(zhì)含量高，純度不符合后續(xù)試驗(yàn)要求，而沉淀中含有大量的OsALR2蛋白，我們嘗試將沉淀中的包涵體進(jìn)行變復(fù)性，以獲得大量的有活性的OsALR2蛋白。通過(guò)SDS-PAGE分析變復(fù)性后獲得的蛋白，結(jié)果顯示包涵體變復(fù)性后的蛋白與上清中所表達(dá)的OS-ALR2分子量大小一致，均為50kD，且蛋白含量較高，雜質(zhì)較少（圖3a）。根據(jù)OsALR2蛋白氨基酸序列預(yù)測(cè)得到的理論分子量為35kD，表達(dá)得到的蛋白分子量與理論值差距較大，這是因?yàn)樵贠sALR2蛋白表達(dá)載體pET32a的多克隆位點(diǎn)（即Os-ALR2基因的插入位點(diǎn)）的上游有一個(gè)TrxA tag。TrxA tag與下游目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，且其分子量為20.4kD左右，所以O(shè)sALR2蛋白在SDS-PAGE上的表觀分子量為TrxA與OsALR2融合蛋白的分子量總和。為了檢驗(yàn)包涵體復(fù)性后所得到蛋白的結(jié)構(gòu)均一性，我們使用分子篩對(duì)復(fù)性后的蛋白進(jìn)行純化。分子篩結(jié)果顯示在洗脫體積62mL處出現(xiàn)單一的尖銳的峰，說(shuō)明包涵體變復(fù)性后的蛋白的寡聚狀態(tài)較均一（圖3b）。切割SDS-PAGE膠中變復(fù)性后的OS-ALR2蛋白對(duì)應(yīng)的條帶，送質(zhì)譜平臺(tái)運(yùn)用MALDI-TOF/TOF UltraflextremeTM進(jìn)行分析，根據(jù)酶解后所產(chǎn)生的肽段的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，搜索水稻數(shù)據(jù)庫(kù)Swissprot并進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證明檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的條帶確實(shí)為水稻OsALR2蛋白（圖3c）。

2.5酶活測(cè)定

為了測(cè)定包涵體變復(fù)性后得到的OsALR2蛋白是否具有降解草甘膦的活性。我們首先分析水稻OsALR2蛋白與醛類底物的結(jié)合活性，分別在2.5、5.0、7.5、10、15mmol/L和20 mmol/l。等6個(gè)不同苯甲醛濃度下測(cè)定340 nm處吸光度在3min內(nèi)的變化，將結(jié)果擬合成相應(yīng)曲線。結(jié)果（圖4a）表明，OsALR2蛋白具有醛酮還原酶的活性，能在NADPH作為輔酶的條件下將苯甲醛還原成苯甲醇。為了測(cè)定OsALR2蛋白降解草甘膦的活性，在含OS-ALR2蛋白的反應(yīng)體系中加入0.5mmol/L的草甘膦并測(cè)定30min內(nèi)OD340變化值。結(jié)果顯示，隨時(shí)間延長(zhǎng)OD340值增加，這說(shuō)明OsALR2蛋白可以在NADPH作為輔酶的條件下與草甘膦發(fā)生反應(yīng)，使OD340升高，即以草甘膦為底物時(shí)OsALR2具有酶活性（圖4b）。

3結(jié)論與討論

草甘膦是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的高效廣譜除草劑，但是草甘膦與水稻OsALR2蛋白的相互作用機(jī)理尚不清楚。本文通過(guò)生物信息學(xué)分析研究了水稻與草甘膦的作用方式。結(jié)果顯示，OsALR2理論等電點(diǎn)為5.89，為后期純化蛋白時(shí)選擇陰離子交換柱還是陽(yáng)離子交換柱提供了理論依據(jù)；消光系數(shù)為1.859，結(jié)合蛋白在280nm處的吸光度（OD280）利用公式OD280/消光系數(shù)計(jì)算蛋白的實(shí)際濃度；不穩(wěn)定因子為42.75，說(shuō)明蛋白較不穩(wěn)定，在菌體破碎過(guò)程中可加入適量的甘油和合適的還原劑以減少蛋白的降解。OsALR2蛋白含有3組二硫鍵，推測(cè)其很大程度上會(huì)形成包涵體。

純化水稻OsALR2蛋白遇到的難題是OsALR2以包涵體形式表達(dá)。重組蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)時(shí)經(jīng)常生成不可溶的和沒有活性的蛋白聚集體，通常稱作包涵體。當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)量超過(guò)細(xì)胞蛋白質(zhì)總數(shù)的2%時(shí)，易導(dǎo)致包涵體的形成。另外，目的基因的高拷貝、強(qiáng)啟動(dòng)子和高濃度誘導(dǎo)劑都有利于包涵體的形成。目的基因拷貝數(shù)過(guò)高會(huì)使細(xì)胞損耗過(guò)高，當(dāng)細(xì)胞有一個(gè)強(qiáng)大的啟動(dòng)子系統(tǒng)時(shí)，重組蛋白的產(chǎn)生會(huì)使細(xì)胞代謝負(fù)荷水平提高，從而聚集成包涵體。包涵體的形成也依賴于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，疏水性氨基酸較多也會(huì)形成包涵體。此外，胞質(zhì)伴侶ClpB的缺失也會(huì)導(dǎo)致蛋白的不溶性表達(dá)。常通過(guò)以下方法從包涵體中獲得有活性的蛋白：1）裂解細(xì)胞；2）去除細(xì)胞壁和膜組分；3）使用強(qiáng)變性劑溶解蛋白聚集體；4）伴隨著還原型的半胱氨酸殘基氧化成正確的二硫鍵，變性的蛋白正確折疊成天然構(gòu)象。包涵體變性再?gòu)?fù)性后是否具有活性還受以下因素的影響：首先是變性劑的選擇，常用的變性劑有尿素和鹽酸胍，尿素有使用范圍廣，溶解力較溫和，成本低，可用于多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)；鹽酸胍作為強(qiáng)變性劑，溶解時(shí)間短，但是不利于蛋白的共價(jià)修飾，且成本高，在酸性條件下易沉淀，對(duì)蛋白的離子交換色譜有干擾。所以本文選用尿素作為OsALR2包涵體的變性劑。此外，大腸桿菌的外膜蛋白OmpT具有蛋白水解酶的活性，在包涵體變復(fù)性中可能引起重組蛋白的降解，所以必須經(jīng)過(guò)低濃度尿素重復(fù)洗滌以清除包涵體蛋白的膜組分。試驗(yàn)證明OsALR2包涵體蛋白復(fù)性后具有醛酮還原酶活性和降解草甘膦的活性，且分子篩凝膠過(guò)濾層析結(jié)果顯示蛋白的寡聚狀態(tài)均一，這使得我們得到了較高純度和濃度的OsALR2蛋白，有利于后續(xù)蛋白結(jié)晶。

綜上，本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析，分子對(duì)接表明了OsALR2的基本理化性質(zhì)及OsALR2與小分子的作用位點(diǎn)，為試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供方向；其次成功對(duì)OsALR2包涵體進(jìn)行變復(fù)性，并證實(shí)了包涵體復(fù)性后的OsALR2具有降解草甘膦的酶活性，為后續(xù)蛋白與小分子的共結(jié)晶和闡明草甘膦的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。但是驗(yàn)證包涵體變復(fù)性后的蛋白折疊的結(jié)構(gòu)和寡聚狀態(tài)的均一性時(shí)，僅用分子篩的峰圖這一種方法判斷是不夠的，如果結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射，交聯(lián)后跑蛋白膠以及分析超離等多種方法加以論證會(huì)更加可信。