牛蛙胚胎發(fā)育的形態(tài)特征觀察

陳秋羽，鄭曉婷，仲勁松，陳智兵，王 瑩，梁雪瑩，董宏標(biāo)，張家松

1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3.中洋漁業(yè) (清遠(yuǎn)) 有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 513129

4.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州 510145

牛蛙 (Ranacatesbeiana) 屬兩棲綱、無尾目、蛙科，其肉質(zhì)鮮嫩、細(xì)軟爽口，蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量高且脂質(zhì)含量較低，加工方便，深受消費(fèi)者喜愛[1]。牛蛙皮中可提取一種生物活性肽，可作為新型抗菌肽開發(fā)原料[2]；而牛蛙的脂肪可通過生物技術(shù)處理生成一種天然油脂，因其具有優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性，在營養(yǎng)食品及制藥市場上有很大的潛力[3]。2021 年，我國牛蛙養(yǎng)殖產(chǎn)量超過60 萬噸，三產(chǎn)產(chǎn)值近千億[4]。然而，由于目前我國牛蛙養(yǎng)殖技術(shù)落后、種質(zhì)退化以及對種蛙濫用藥物等原因，雖每年投放蝌蚪苗種近20 萬尾進(jìn)行繁育，但僅三成可養(yǎng)成至商品蛙規(guī)格[5]；因此，高質(zhì)量苗種培育是關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。

在脊椎動(dòng)物中，兩棲綱動(dòng)物具有獨(dú)特的變形期，其早期胚胎發(fā)育過程及胚后幼體發(fā)育過程在苗種培育、比較胚胎學(xué)和分子機(jī)制研究中均具有重要意義[6-7]。劉楚吾和陳信初[8]于1987 年系統(tǒng)研究了機(jī)械振蕩、溫度、pH、溶解氧對牛蛙受精卵孵化率的影響；王雪虹[9]進(jìn)一步研究了溫度驟變和機(jī)械振蕩對不同發(fā)育階段牛蛙胚胎的影響。目前，對牛蛙胚胎發(fā)育時(shí)期的研究僅簡單劃分了受精卵的發(fā)育時(shí)期[7]，只有手繪發(fā)育過程圖，并未對其發(fā)育過程進(jìn)行全面劃分，也未記錄每個(gè)發(fā)育時(shí)期所需的生物積溫。因此，本研究通過觀察牛蛙的胚胎發(fā)育過程，詳細(xì)記錄牛蛙胚胎從合子階段的受精卵發(fā)育至孵化完成階段的鰓蓋閉合期的各時(shí)期形態(tài)變化特征、發(fā)育所需時(shí)間及生物積溫，充實(shí)其影像學(xué)資料及生物學(xué)資料，旨在為牛蛙的苗種培育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 種蛙馴養(yǎng)

牛蛙種蛙取自位于廣東省清遠(yuǎn)市陽山縣白蓮村的中洋漁業(yè) (清遠(yuǎn)) 有限公司養(yǎng)殖基地。雌雄種蛙在車間內(nèi)的水泥養(yǎng)殖池分開馴養(yǎng)，水源為山泉水，24 h 常流水，平均水溫為 (21.5±0.5) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度為 (9.10±0.75) mg·L-1，車間內(nèi)室溫為 (26.5±0.5) ℃。每日投喂牛蛙配合飼料2 次，投喂時(shí)間為9:00 和18:00，日投喂量為牛蛙體質(zhì)量的7%～15%。

1.1.2 種蛙選擇

選擇規(guī)格較大、腹部緊致有彈性、四肢形態(tài)正常、后腿有勁、眼睛有神、處于發(fā)情期且趾端婚墊特征明顯的8 只雄蛙作父本，平均體質(zhì)量為 (723.75±40.90) g；選擇腹部膨大柔軟圓潤、形態(tài)正常、皮膚光滑油亮、眼睛有神、輕壓腹部能擠壓出少許卵粒的8 只雌蛙作母本，平均體質(zhì)量為 (503.75±23.93) g ；在配對繁殖前3 d 對雌蛙進(jìn)行禁食，以減少其體內(nèi)脂肪積累，保證產(chǎn)卵順利與卵子的質(zhì)量[10]。

1.1.3 受精卵采集

用100 目篩絹網(wǎng)在種蛙產(chǎn)卵池中分別圍出1 m×1 m×1 m 的網(wǎng)兜，網(wǎng)兜遠(yuǎn)離出水口和入水口。適當(dāng)調(diào)節(jié)水深控制在約0.4 m，保持24 h 流水。每個(gè)網(wǎng)兜內(nèi)放入1 對種蛙，其中4 對種蛙成功抱對產(chǎn)卵。在種蛙抱對產(chǎn)卵后，立即用篩絹網(wǎng)撈兜輕輕撈取受精卵，轉(zhuǎn)移到孵化盆，每個(gè)盆內(nèi)放入300 顆受精卵，并把產(chǎn)卵后的種蛙取出放回養(yǎng)殖池中。受精時(shí)間從種蛙抱對產(chǎn)出第一批散開在水面的卵后的第5 分鐘開始計(jì)時(shí)。蛙受精卵外有膠質(zhì)膜，產(chǎn)出后吸水膨大，漂浮于水面；若產(chǎn)出的受精卵未及時(shí)撈起，則易下沉不便于采卵；轉(zhuǎn)移蛙卵時(shí)避免震動(dòng)，以免導(dǎo)致受精卵發(fā)育畸形[8-9]。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

1.2.1 孵化準(zhǔn)備

選取方形塑料盆 (0.54 m×0.39 m×0.32 m) 作為孵化盆，將孵化盆的水位保持在0.2 m。水源皆為山泉水，水溫為(24.5±0.4) ℃，光照周期為14 L∶10 D，光照強(qiáng)度為1 000～1 400 lx。pH 和溶解氧的設(shè)置參照劉楚吾和陳信初[8]的實(shí)驗(yàn)，pH 保持在7.0～7.5，溶解氧質(zhì)量濃度在7 mg·L-1以上，每12 h 檢測水中溶氧量，采用曝氣石持續(xù)增氧。蝌蚪脫膜前，每天8:00 換水1/3，及時(shí)處理胚胎的代謝產(chǎn)物和死掉的胚胎。每組設(shè)3 個(gè)平行。

1.2.2 胚胎發(fā)育觀察

用2 mL 的吸管從孵化盆中取10～15 顆受精卵均勻地鋪于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡(LICHEN XSP-02，10×4 倍) 下觀察并拍照，詳細(xì)記錄各時(shí)期的發(fā)育特征及所需時(shí)間。使用高精度電子游標(biāo)卡尺測量受精卵的徑長。每期每組隨機(jī)取20～30 顆受精卵進(jìn)行觀察，參考謝永廣等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，以40%以上胚胎達(dá)到某期確定為該發(fā)育時(shí)期的起始時(shí)間，60% 以上胚胎達(dá)到某期確定為該發(fā)育時(shí)期的結(jié)束時(shí)間。受精卵在卵裂階段時(shí)，胚胎發(fā)育較快，每10 min 觀察1 次胚胎發(fā)育情況；進(jìn)入囊胚階段后，發(fā)育速度變緩，每30 min 觀察1次胚胎發(fā)育情況。生物積溫的計(jì)算參考邢君霞等[12]的研究，以每期的發(fā)育所需時(shí)間和平均水溫計(jì)算胚胎發(fā)育該期的生物積溫，計(jì)算公式為：

式中：K為生物積溫(h·℃)；T為該階段發(fā)育時(shí)的平均水溫(℃)；n為某一階段發(fā)育至下一階段所需時(shí)間 (h)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2021 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Adobe Photoshop 2022 軟件處理圖片。

2 結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，并參照水產(chǎn)動(dòng)物的胚胎發(fā)育過程[13]，可將牛蛙胚胎發(fā)育過程劃分為7 個(gè)階段。從受精卵開始為合子階段；受精卵出現(xiàn)倍增性的細(xì)胞分裂，為卵裂階段；伴隨細(xì)胞的繼續(xù)分裂分化，胚體形成一個(gè)多細(xì)胞的囊狀胚體，為囊胚階段；囊胚形成后，由于胚體的原腸作用，細(xì)胞會(huì)進(jìn)行內(nèi)陷和外包，形成原腸胚，為原腸胚階段；之后，胚體繼續(xù)發(fā)育會(huì)形成具有神經(jīng)管、脊索的胚體，此為神經(jīng)胚階段；神經(jīng)胚階段后，胚體上逐漸形成器官，此為器官形成階段；此后至鰓蓋完全閉合后，為孵化完成階段。為了進(jìn)一步細(xì)化牛蛙的胚胎發(fā)育過程，參照前人對蛙類的胚胎發(fā)育時(shí)期劃分[7-9,13-14]，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果，將牛蛙胚胎發(fā)育的7 個(gè)階段再細(xì)分為最明顯且最具代表性的24 個(gè)時(shí)期 (圖1)。

圖1 牛蛙胚胎發(fā)育分期及各期的形態(tài)特征注：a.受精卵；b.2 細(xì)胞期；c.4 細(xì)胞期；d.8 細(xì)胞期；e.16 細(xì)胞期；f.32 細(xì)胞期；g.64 細(xì)胞期；h.囊胚早期；i.囊胚晚期；j.原腸早期；k.原腸中期；l.原腸晚期；m.神經(jīng)板期；n.神經(jīng)褶期；o.胚胎轉(zhuǎn)動(dòng)期；p.神經(jīng)管期；q.尾芽期；r.肌肉效應(yīng)期；s.心跳期；t1.鰓血循環(huán)期 (頭部側(cè)面圖)；t2.鰓血循環(huán)期 (尾部側(cè)面圖)；u1.開口期 (頭部側(cè)面圖)；u2.開口期 (尾部側(cè)面圖)；v1.尾血循環(huán)期 (頭部側(cè)面圖)；v2.尾血循環(huán)期 (尾部側(cè)面圖)；w1.右端鰓蓋閉合期 (頭部背面圖)；w2.右端鰓蓋閉合期 (頭部腹面圖)；x1.鰓蓋閉合完成期 (背面圖)；x2.鰓蓋閉合完成期 (腹面圖)。Fig.1 Developmental stages and morphological characteristics of embryo of R.catesbeianaNote: a.Fertilized eggs; b.2-cell stage; c.4-cell stage; d.8-cell stage; e.16-cell stage; f.32-cell stage; g.64-cell stage; h.Early blastula; i.Late blastocyst;j.Early gastrula stage; k.Mid-gastrula stage; l.Late gastrula stage; m.Neural plate stage; n.Neural folds stage; o.Embryo rotation stage; p.Neural tube stage;q.Tail-bud period; r.Muscular contraction stage; s.Heart beat stage; t1.Gill blood circulation period (Head side); t2.Gill blood circulation period (Tail side);u1.Opening period (Head side); u2.Opening period (Tail side); v1.Tail blood circulation period (Head side); v2.Tail blood circulation period (Tail side);w1.Right gill cover closure period (Head back); w2.Right gill cover closure period (Head abdomen) x1.Gill cover closure period (Back view); x2.Gill cover closure period (Abdomen view).

在本實(shí)驗(yàn)中水溫為 (24.5±0.4) ℃時(shí)，受精卵發(fā)育至肌肉效應(yīng)期需要67 h 49 min，總積溫為1 896.95 h·℃；到鰓蓋閉合期共耗時(shí)177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃。整個(gè)發(fā)育過程呈現(xiàn)前期發(fā)育速度較快、后期較慢的趨勢。胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的特征、耗時(shí)與積溫見表1 和圖1。

表1 牛蛙胚胎發(fā)育分期Table 1 Embryonic developmental stages of R.catesbeiana

2.1 合子

牛蛙受精卵自受精后到第一卵裂溝出現(xiàn)為止 (0～2 h 1 min)，此階段為合子階段，生物積溫為48.51 h·℃。整個(gè)卵呈球型，卵徑為 (1.41±0.31) mm。牛蛙受精卵屬端黃卵，呈極性分布，分為植物極和動(dòng)物極。植物極卵黃集中，為灰白色，表面積大約占整個(gè)卵的1/3；動(dòng)物極是原生質(zhì)集中的地方，有黑色素，呈黑棕色。受精卵外圍附著一層卵膜，卵膜吸水后膨脹，卵將沉底且能自轉(zhuǎn)，植物極轉(zhuǎn)動(dòng)朝下，動(dòng)物極轉(zhuǎn)動(dòng)朝上 (圖1-a)。

2.2 卵裂

牛蛙的卵裂類型為不均等完全卵裂，整個(gè)卵裂階段共耗時(shí)2 h 1 min～13 h 35 min，生物積溫為304.99 h·℃。自受精2 h 1 min 后，受精卵的動(dòng)物極出現(xiàn)一條縱溝，被分為不完全相等的2 個(gè)卵裂球，為2 細(xì)胞期，此時(shí)期持續(xù)25 min (圖1-b)；受精2 h 35 min 后，第二條卵裂溝出現(xiàn)，為緯裂，垂直于第一條卵裂溝，受精卵此時(shí)分裂為4 個(gè)卵裂球，為4 細(xì)胞期，此時(shí)期持續(xù)27 min (圖1-c)；受精3 h 2 min 后，受精卵出現(xiàn)第3 次卵裂，此時(shí)出現(xiàn)的卵裂溝將受精卵分為8 個(gè)大小不等的卵裂球，其動(dòng)物極的卵裂球較植物極的小，此期為8 細(xì)胞期，持續(xù)42 min (圖1-d)；受精3 h 44 min 后，第4 次卵裂出現(xiàn)，將受精卵分裂為排列不甚規(guī)則且16 個(gè)大小不一致的卵裂球，為16 細(xì)胞期，持續(xù)30 min (圖1-e)；受精4 h 14 min 后，受精卵進(jìn)入32 細(xì)胞期，經(jīng)歷第5 次卵裂，此次分裂不規(guī)則，受精卵被分裂為32 個(gè)形狀各異的分裂球，持續(xù)2 h 1 min (圖1-f)；受精6 h 15 min 后，受精卵經(jīng)歷第6 次卵裂，被不規(guī)則分裂為64 個(gè)分裂球，動(dòng)物極的卵球較植物極的多且小，此期為64 細(xì)胞期，持續(xù)7 h 20 min (圖1-g)。

2.3 囊胚

經(jīng)歷6 次卵裂后，受精卵進(jìn)入囊胚階段，此階段共耗時(shí)13 h 35 min～21 h 48 min，生物積溫為183.09 h·℃。自受精13 h 35 min 后，受精卵被分裂為大小不等的卵裂球，受精卵表面凹凸不平，有明顯卵裂溝，整體呈桑葚狀，此期為囊胚早期 (圖1-h)。在受精20 h 7 min 后，受精卵進(jìn)入囊胚晚期，可見其表面界限明顯的卵裂溝逐漸變得不清晰，但能分辨出有卵裂溝在受精卵表面 (圖1-i)。

2.4 原腸胚

在囊胚晚期后，受精卵進(jìn)入原腸胚階段，此階段共耗時(shí)21 h 48 min～33 h 58 min，生物積溫為288.50 h·℃。自受精21 h 48 min 后，受精卵表面的卵裂溝已經(jīng)無法分辨，此時(shí)原腸早期的卵裂球更小，且輪廓逐漸模糊；由于其內(nèi)胚層細(xì)胞的內(nèi)陷，受精卵表面可見有微凹陷部分，微凹陷部分的背側(cè)為背唇，此期為原腸早期 (圖1-j)。在受精26 h 5 min 后，受精卵表面變得光滑，只能分辨出有卵裂線不見卵裂溝；且其背唇位置的細(xì)胞逐漸下包，植物極細(xì)胞內(nèi)卷，逐漸形成圓形胚孔，胚孔中有白色凸起為卵黃栓，此期為原腸中期 (圖1-k)。受精27 h 7 min 后，受精卵隨著動(dòng)植物極細(xì)胞的外包和內(nèi)卷，胚孔逐漸變小，直至被完全包入內(nèi)部，此期為原腸晚期 (圖1-l)。

2.5 神經(jīng)胚

在原腸胚階段之后，受精卵進(jìn)入神經(jīng)胚階段，此階段共耗時(shí)33 h 58 min～62 h 23 min，此階段外胚層特定區(qū)域細(xì)胞內(nèi)陷形成神經(jīng)系統(tǒng)，生物積溫為681.42 h·℃。自受精33 h 58 min 后，胚孔封閉，胚體已略變?yōu)槔嫘?，?cè)面明顯可見有神經(jīng)板出現(xiàn)，此期為神經(jīng)板期(圖1-m)。受精40 h 45 min 后，肉眼可見受精卵的整個(gè)胚體逐漸拉長，已變?yōu)榈湫偷睦嫘?；神?jīng)板逐漸隆起形成神經(jīng)褶，明顯可見神經(jīng)褶中間略有凹陷，此為神經(jīng)褶期 (圖1-n)。受精45 h 46 min 后，神經(jīng)褶的兩側(cè)隆起逐漸向中間靠攏合并，形成神經(jīng)溝，此時(shí)胚胎表面出現(xiàn)纖毛，由于纖毛的擺動(dòng)可見胚體開始在膜內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，為胚胎轉(zhuǎn)動(dòng)期，又稱為神經(jīng)溝期 (圖1-o)。受精49 h 37 min 后，胚體繼續(xù)拉長，神經(jīng)溝逐漸消失合攏為一條線，從而形成神經(jīng)管，在胚體上還可見到有尾芽的原基出現(xiàn)，此為神經(jīng)管期 (圖1-p)。

2.6 器官形成

自原腸胚后，胚體繼續(xù)發(fā)育進(jìn)入器官形成階段，此階段經(jīng)歷時(shí)間為62 h 23 min～142 h 47 min，生物積溫為2 791.71 h·℃。卵受精62 h 23 min 后，胚體頭部出現(xiàn)吸盤，鰓區(qū)開始逐漸分化出現(xiàn)，且在胚體后背部有明顯的尾芽出現(xiàn)，此期為尾芽期 (圖1-q)。受精67 h 49 min 后，胚體進(jìn)入肌肉效應(yīng)期，此時(shí)胚體已完全脫膜，其尾芽更加明顯，胚體整體增長，在受到外部刺激時(shí)，胚體會(huì)做出頭尾彎曲的環(huán)形收縮反應(yīng) (圖1-r)。受精80 h 33 min 后，可見胚體尾部發(fā)育明顯，在頭部可見鰓芽出現(xiàn)；在顯微鏡下可觀察到胚體的咽腹部有規(guī)則的心跳搏動(dòng)，此為心跳期(圖1-s)。受精89 h 45 min 后，胚體頭部側(cè)面有鰓絲長出，鰓絲有明顯收縮，在顯微鏡下可見鰓絲的血管中有血液循環(huán)流動(dòng)；在胚體尾部可見明顯體節(jié)。胚體在孵化盆中常用吸盤側(cè)吸附在盆壁上不動(dòng)，僅在受到外界刺激時(shí)才會(huì)扭曲游動(dòng)，此期為鰓血循環(huán)期 (圖1-t1,1-t2)。受精96 h 37 min后，胚體進(jìn)入開口期，其頭部腹面可見口唇輪廓，兩腮的鰓絲增長，并可見眼部的角膜變透明 (圖1-u1,1-u2)。受精103 h 53 min 后，胚體吸盤逐漸退化；其眼部可見明顯的黑色眼球；外鰓基部可見鰓蓋褶出現(xiàn)；尾部變透明且有血液流動(dòng)；腹部變短變圓，在水中可短暫直立，此期為尾血循環(huán)期 (圖1-v1,1-v2)。受精142 h 47 min后，胚體進(jìn)入右端鰓蓋閉合期，胚體頭部變橢圓，可見兩個(gè)黑色眼球；從背部可見右側(cè)鰓蓋已完全閉合，與體表合為一體，左邊的鰓絲仍然露出；吸盤已完全退化，腹部可見漩渦狀的腸道組織 (圖1-w1,1-w2)。

2.7 孵化完成

受精卵歷經(jīng)177 h 38 min，此時(shí)已完全孵化為蝌蚪體，蝌蚪體側(cè)的左端鰓蓋閉合完成，且外鰓已完全消失；口部上下唇已發(fā)育完成，僅留一小孔通水；蝌蚪在水中已能完全自由地游動(dòng)，并平衡地立于水中，此期為鰓蓋閉合完成期 (圖1-x1,1-x2)。

3 討論

3.1 牛蛙受精卵發(fā)育階段與其他蛙類的異同

本研究中，牛蛙的胚胎發(fā)育包括合子、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成及孵化完成7 個(gè)階段。與棘胸蛙 (Quasipaaspinosa)[11]、黑斑蛙 (Pelophylaxnigromaculatus)[15]、花臭蛙 (Odorranaschmackeri)[16]、凹耳臭蛙(O.tormota)[17]、斑腿泛樹蛙 (Rhacophorusmegacephalus)[18]等兩棲無尾目動(dòng)物的胚胎發(fā)育大致相近，自受精卵經(jīng)歷卵裂后，發(fā)育成囊胚，再自囊胚轉(zhuǎn)化為原腸胚，原腸胚發(fā)育成神經(jīng)胚后開始形成器官，最后孵化完成，成為幼體。此外，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)條件下牛蛙受精卵的發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)蛙類胚胎發(fā)育在經(jīng)歷卵裂階段的32 細(xì)胞期時(shí)，卵裂球溝均會(huì)由深卵裂溝分化為淺卵裂溝[13,19]。此時(shí)表層細(xì)胞之間會(huì)形成緊密連接，這些連接會(huì)顯著減少其能量代謝所需的氧氣供應(yīng)，所以此時(shí)胚胎表層細(xì)胞的發(fā)育能影響深層細(xì)胞的耗氧[20]。缺氧則會(huì)誘導(dǎo)激活其內(nèi)部細(xì)胞的糖酵解[21]，而在此時(shí)深層細(xì)胞可能處于缺氧狀態(tài)，從而促進(jìn)內(nèi)部細(xì)胞開始分化，產(chǎn)生胚胎后續(xù)一系列的結(jié)構(gòu)變化[22]?？梢娕Ｍ艿脑缙谂咛グl(fā)育階段遵循大多數(shù)兩棲綱無尾目動(dòng)物的胚胎發(fā)育模式。

1937 年，Pollister 和Moore[23]研究了木蛙 (R.Aylvatica) 的胚胎及幼體發(fā)育過程，將木蛙胚胎及幼體發(fā)育過程劃分為23 個(gè)時(shí)期，卻并未對各時(shí)期進(jìn)行命名。Shumway[14]于1940 年參照木蛙胚胎發(fā)育時(shí)期，將美洲豹蛙 (R.pipiens)的胚胎及幼體發(fā)育過程劃分為25 個(gè)時(shí)期，且以每時(shí)期最具特征性的表現(xiàn)為各時(shí)期命名。二者不同的是，Pollister 和Moore[23]將右端鰓蓋閉合期與鰓蓋閉合完成期歸為了同一時(shí)期，而Shumway[14]將這兩期單獨(dú)劃分了出來，筆者與其劃分方式一致，將牛蛙的右端鰓蓋閉合期與鰓蓋閉合完成期分為不同的兩期[23]。此后，學(xué)者們對黑斑蛙、花臭蛙、凹耳臭蛙、斑腿泛樹蛙等胚胎發(fā)育過程[15-18]皆參照了Shumway[14]的分期方式進(jìn)行劃分。已有部分研究在無尾兩棲類動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的鰓血循環(huán)期之后、右端鰓蓋閉合期之前劃分出了鰓蓋褶期[8,15-16,23]。本研究與謝永廣等[11]、Shumway[14]、劉紹龍等[24]的發(fā)現(xiàn)一致，注意到鰓蓋褶期常在尾血循環(huán)期出現(xiàn)，且出現(xiàn)時(shí)模糊。根據(jù)胚胎發(fā)育分期和命名的原則，即必須以發(fā)育過程中顯著特征為劃分依據(jù)，本文未將鰓蓋褶期單獨(dú)劃分，鰓血循環(huán)期后即右端鰓蓋閉合期。

3.2 影響牛蛙受精卵發(fā)育耗時(shí)的因素

所有生物體都需要以負(fù)熵為食，即生物體在吸收外界環(huán)境中的熱能后，再向外界環(huán)境釋放熱能，以維持其能量代謝。能量代謝是維持生命組織的主要因素，所以人們將生物體的發(fā)育與其過程中消耗的能量代謝聯(lián)系起來[25]。胚胎發(fā)育時(shí)期的環(huán)境溫度則是影響胚胎發(fā)育形態(tài)、時(shí)間及發(fā)育速度的外部因素[26]。在胚胎發(fā)育至幼體的過程中，主要由受精卵中的卵黃提供能量，此過程中，水溫升高會(huì)提高卵黃中的蛋白降解酶活性，卵黃吸收率和代謝活性隨之增加，加快胚胎的發(fā)育速度[27]。研究發(fā)現(xiàn)，林蛙 (R.chensinensis)[28-29]、木蛙[30]、棘胸蛙[31]等胚胎發(fā)育速度與水溫呈正相關(guān)[32]，牛蛙也有類似現(xiàn)象[8-9]。

影響牛蛙胚胎發(fā)育耗時(shí)的因素除溫度外，還有光照條件[33]、養(yǎng)殖密度[34]、鹽度[35]等環(huán)境因素[36]，而受精卵的卵徑大小則為影響胚胎發(fā)育耗時(shí)的內(nèi)在因素。在水溫相似的條件下，飾紋姬蛙 (Microhylafissipes) 受精卵卵徑為(0.97±0.02) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合期僅需82 h 36 min[37]；本實(shí)驗(yàn)中的牛蛙受精卵卵徑為 (1.41±0.31) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合完成期需要177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃；棘胸蛙受精卵卵徑為 (4.31±0.69) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合期需要288 h 44 min，總積溫5 462.03 h·℃[11]。由此可見，受精卵卵徑越大所需發(fā)育時(shí)間越長，所需生物積溫更高，這一規(guī)律與大多數(shù)魚類中胚胎發(fā)育時(shí)間與卵徑的關(guān)系也相符[38]。這可能由于較大的卵裂球在生長發(fā)育中需要更多的營養(yǎng)和更高的生物積溫以維持其正常發(fā)育[39]，而產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 孵化過程中水體環(huán)境對牛蛙受精卵的影響

在胚胎的早期發(fā)育過程中，溶解氧、pH 等環(huán)境因子對胚胎發(fā)育的影響極大[40-41]。有研究表明，蛙類胚胎的耗氧量會(huì)隨著發(fā)育時(shí)間增加而增加，養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中溶解氧含量過低可導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩，甚至幼苗死亡[8,42]；而王春青和呂樹臣[43]發(fā)現(xiàn)當(dāng)水中溶解氧過高則會(huì)引起蝌蚪的氣泡病，若不及時(shí)救治將引起大量死亡。在受精卵孵化過程中，由于胚胎發(fā)育階段的酸堿調(diào)節(jié)機(jī)制尚未發(fā)育完全[44-45]，pH 也會(huì)顯著影響胚胎形態(tài)及孵化率[46]。當(dāng)pH 過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致云紋石斑魚 (Epinephelusmoar) 胚胎的孵化率降低[47]，這與劉楚吾和陳信初[8]的研究結(jié)果一致；而當(dāng)pH 過低，則會(huì)引起海灣扇貝 (Argopectenirradia) 胚胎的畸形率上升[45]。因此本實(shí)驗(yàn)在孵化過程中將水中pH 嚴(yán)格控制在7.0～7.5，溶解氧質(zhì)量濃度在7 mg·L-1以上。在本實(shí)驗(yàn)中也盡量避免蛙卵的移動(dòng)，以免造成牛蛙胚胎的死亡。王雪虹[9]認(rèn)為機(jī)械振動(dòng)刺激會(huì)導(dǎo)致蛙卵的死亡，Xie 等[48]的實(shí)驗(yàn)證明慢性機(jī)械刺激會(huì)造成卵裂球的損害，誘導(dǎo)裂原活化蛋白激酶的磷酸化，從而減緩胚胎的生長。

本實(shí)驗(yàn)在孵化牛蛙受精卵的過程中，每日換水1/3 并及時(shí)處理水中胚胎的代謝產(chǎn)物和死掉的胚胎。這是由于蛙類胚胎發(fā)育過程所產(chǎn)生的代謝廢物會(huì)導(dǎo)致水體中的氨氮(NH+4)、亞硝酸鹽 (NO-2-N) 等含量增加，可能會(huì)直接或間接影響胚胎及幼體的發(fā)育[49]。且在淡水魚類的受精卵孵化過程中常見有水霉病，此為卵菌性疾病，會(huì)顯著影響受精卵孵化的成活率[50-51]。在蛙類受精卵孵化中同樣常見，多發(fā)生于水質(zhì)較差、卵塊密度太大、水溫驟然下降等情況，尤其在連綿陰雨天氣的季節(jié)最易出現(xiàn)。一旦有卵感染上水霉病，卵四周即會(huì)長出肉眼可見的灰白色菌絲，若不及時(shí)處理，菌絲則會(huì)蔓延至其他正常卵團(tuán)中，導(dǎo)致大量胚胎死亡。因此，提前做好預(yù)防、保持良好的水質(zhì)和環(huán)境對促進(jìn)胚胎健康發(fā)育和提高受精卵成活率至關(guān)重要。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，本研究通過觀察牛蛙早期胚胎發(fā)育的過程及其變化特征，將牛蛙胚胎發(fā)育過程劃分為7 個(gè)階段24 個(gè)時(shí)期。在水溫 (24.5±0.4) ℃的條件下，胚胎從合子階段的受精卵發(fā)育至器官形成階段的肌肉效應(yīng)期需要6 7 h 49 min，總積溫為1 896.95 h·℃；至孵化完成階段的鰓蓋閉合期共耗時(shí)177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃。此外，本研究詳細(xì)記錄并補(bǔ)充了牛蛙早期胚胎發(fā)育所經(jīng)歷每個(gè)時(shí)期的變化特征及清晰的影像學(xué)資料，可為其高質(zhì)量育種提供參考依據(jù)。

基于本研究的結(jié)果，可進(jìn)一步通過改變胚胎的發(fā)育環(huán)境[52]，研究環(huán)境因素對胚胎發(fā)育的影響，探究這些環(huán)境因素與基因調(diào)控之間的相互作用[53-54]。兩棲類動(dòng)物具有較強(qiáng)的再生能力，如非洲爪蟾 (Xenopuslaevis) 在胚胎發(fā)育過程中一些特定的組織和器官在被損傷后可再生[55-56]。受此啟發(fā)，可通過研究牛蛙蝌蚪是否具有再生能力并分析其再生的分子機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)通路[57]，了解再生在不同情況下的作用機(jī)制可為干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞可塑性研究提供參考[58]。